Антибиотици

Антибиотичните вещества се образуват от различни групи организми-бактерии , гъби , растения и животни.Историята на откриването на първия антибиотик , който е намерил широко приложение в медицинската практика, е свързана с името на Александър Флеминг, но в научната литература терминът е въведен през 1942г. от Ваксман.Независимо от несъвършенството на превода този термин навлиза трайно не само в научниа речник , но и във всекидневието.Много автори дават различни сведения за антиботиците.Те са специфични продукти на жизнената дейност на организма или техни модификации,притежаващи висока физиологична активност спрямо определени групи МО , включващи и вируси, и спрямо злокачествени тумори , задържайки техния растеж и необратимо унищожаване на организма.Специфичността на антибиотичните вешества като продукти на обмяната се състои в това , че първо антибиотиците са различни от другите продукти на жизнената дейност като алкохоли , органични киселини и др.,също потискащи растежа на определени групи МО, и притежаватизключително висока биологична активност.Например за потискане на грам+ бактерии е необходима минимална концентрация на еритромицин, която се измерва с 0,01-0,02 мг/мл.При такива нищожни концентрации на спирт и органични киселини не може да се очаква никакъв инхибиращ ефект върху бактериите.Антибиотичните вещества притежават избирателност на биологичното действие.Не всички организми , намиращи се в контакт с антибиотика , са чувствителни към неговото действие.МО се делят на две групи:чувствителни към определени антибиотици и резистентни към тях.Едни антибиотици потискат растежа на неголям брой видове МО,а пък други – на много видове.Изхождайки от тази особеност на антибиотиците , те се разделят на две групи:

G

40-100 нови антибиотици се откриват всяка година.Активното търсене на нови антибиотици , образувани от различни групи МО , е свързано от една страна с това ,че много антибиотични вещества намират широко приложение в хуманната и ветеринарната медицина като химиотерапевтични препарати , и отделно в хранително-вкусовата промишленот и селското стопанство.Сериозно приложение намират и научно-изследователската работа като най-различни реагенти , локиращи ензимни реакции в обмяната на веществта при изучаването на различни МО.Приложението на атибиотиците като лечебни препарати в медицинскта практика способства за появата на различни форми на МО ,които са резистентни.Антибиотиците са представители на различни класове химични съединения-от доста простите ациклични съединения до твърде сложните структури от типа на полипептидните вериги , актиномицини и др.Благодарение на разнообразната химична структура антибиотичните вещества притежават различни механизми на билогично действие и могат да се разделят на няколко групи:

v    

v    

v    

v    

v    

v    

v    

v    

v    

v    

4.1 потискащи синтезата на РНК-

v    

v    

v    

v    

v    

4.2 потискащи синтезата на ДНК-

v     D

v    

v    

v    

v    

v    

v    

v    

v    

v    

v    

v    

v    

v    

v    

v    

v    

v    

Penicillium

pH N C P

N

Те оказват съществено влияние върху метаболизма на МО и образуването от тях на антибиотици.Пример:при производството на пеницилин от Penicillium chrysogenum- глюкоза и лактоза , като в този процес глюкозата може да бъде използвана като единствен източник на С , ако тя се въвежда в средата раздробена на малки порции в процеса на развитие на продуцента.При образуването на грамицидин С се използва относително проста по състав синтетична хранителна среда , на която се използват глицерин и янтарна киселина.При производството на стрептомицин като най-добър източник на С се смята глюкозата , но бошинството щамове се култивират на захароза и рафиноза.Продуцентите на неомицин най-добре се развиват върху синтетични хранителни среди с глюкоза и значително повече натрупват антибиотика , ако в средата се съдържа соево брашно като С – източник.Но ако се направи комбинация на глюкоза и соево брашно , се получават 8-10 пъти по добри разултати при синтезата на антибиотика.Като С – източници могат да се използват мазнини , органични киселини , нишесте и глицерин.За всеки продуцент на антибиотици с цел най-добро развитие и висока степен на образуване на антибиотика е необходимо да се подбират не само съответните източници на въглерод и азот , но и тяхната концентрация и правилното съотношение азот и въглерод.

S Mn Mg Fe Zn Co

рН на средата

проблематика.

N P

, които включват пара , вода , електроенергия и сгъстен въздух.

В основата на промишленото производство на антибиотици лежат редица последователни етапи:

За всеки продуцент на антибиотици се разработва оптимална среда , която да отговаря на следните изисквания:

v    

v    

v    

v    

метода-периодичен и непрекъснат.Периодичният метод на стерилизация се прилага при използването на неголеми обеми среда и се състои в нагряване на средата до определена температура – 120-130^оС непосредствено във ферментора или в специални котли-стерилизатори.Средата се задържа при температурата в продължение на 30-60 минути , като задържането зависи от обема на средата и нейния състав , след което средата се охлажда до 27-30 ^оС , и най-често това е температурата на култивиране.Непрекъснатият метод на стерилизация е най-добре да се прилага при големи обеми среда .Първоначално средата се приготвя в специален съд , след което се подава в стерилизационна колона , през която се допуска остра пара с налягане 5 atm

обикновено се отглежда в богати по състав среди , които са способни да осигуряват най-висока биологична активност на МО.Посевният материал се приготвя за 24-48 часа в количество , като определяме сътношението спрямо свежата хранителна среда , и най-често използваното съотношение в практиката е 1:10.Но доста често в зависимост от спецификата на щам – продуцента то може да се увеличава или намалява.

Втори стадий е биосинтезата на антибиотика.Той е основен биологичен стадий в процеса на получаване на антибиотика.В този стадий трябва да се осигурят за продуцента на антибиотика такива условия на развитие , които да способстват за максимално ниво на биосинтеза на антибиотика.Ефективността на стадия на биосинтеза зависи от нивото на образуване на антибиотици от от организмите , което се определя от генетичните особености на организма , състава на хранителната среда , режима на развитие на продуцента , от времето на максимално образуване на антибиотични вещества , стойността на компонентите на средата , включително стойността на предшественика ,пеногасители и титранти , енергийни разходи , свързани с процеса на развитие на организма-продуцент на антибиотици , като в енергийните разходи се включва разхода за енргия , свързана със стерилизация на средата , със стерилизация на ферментора и времето , разбъркването на културалната течност , продухването на въздух през нея и др.Днес в промишлената микробиология най-перспективният метод за култивиране на МО продуценти на антибиотици , както и за други БАВ , е методът на дълбочинно кутивиране , като се използва както периодичния , така и непрекъснатия метод за култивиране.В промишлени условия антибиотиците се получават във ферментори.Те са с най-различни обеми 500л-50-100м³ и повече.Подготовката на посевния материал е многостадиен процес , който се извършва във ферментори с нарастващи обеми от 10 , 100 до 500л в определени съотношения.Процесите за развитие на МО във ферментора се извършват при строг контрол на всички стадии при точно изпълнение на работния регламент.Поддържа се зададена температура на култивиране , активно рН на средата , степен на аерация , скорост на разбъркване .В процеса на култивиране се отичита потреблението на организма на основните хранителни елементи на средата-C N P

Следващ трети стадий е предварителната обработка на културалната течност.В процеса на развитие на продуцентите на антибиотици БАВ в повечето случаи почти напълно се отделят от клетките в културалната течност или среда , но в някои случаи само част от антибиотика се отделя в културалната течност , а друга се запазва в клетките.Съществува и трети вариант , като антибиотикът се задържа изцяло в клетките.В зависимост от това къде се намира антибиотика , се използват съответние методи за извличането му . Например ако антибиотикът се намира в културалната течност , той се отделя чрез метода за екстракция с разтворители , които не се смесват с течната фаза , или се утаява във вид на неразтворимо съединение.Друг метод е чрез използването ма пирообменни смоли.Отделянето на антибиотика от клетките на МО най-често се осъществява с помощта на екстракция с органични разтворители , и ако антибиотикът се съдържа както в културалната течност , така и в клетките , като първа фаза на отделяне е преминаването на антибиотика във форма , от която най-целесъобразно се изолира .Най-често антибиотикът,съдържащ се в културалната течност , се утаява и след това се екстрахира от клетките.Отделянето на нативния разтвор на биомасата се извършва по метода на филтрация или на центрофугиране.При това се прилагат мерки за осигуряване на най-добра филтруемост на културалната течност , когато се постъпва най-често с киселинна или топлинна коагулация или комбинирано, обработване с електролити , внасяне на различни добавки и др.За процеса на филтрация се използват най-различни апарати , започвайки с класически филтър-преси ,метод на мембранна филтрация и в частност микро- и ултрафилтрация ,центрофуги , сепаратори и др.Филтър-пресите се използват за обработване на големи обеми културална течност , и се състоят от няколко редуващи плочи и рамки с филтриращи прегради , и при подаване на културалната течност филтър-пресата става под налягане .За филтруване на неголеми обеми могат да се използват и нутч-филтри , като филтрирането се извършва под вакуум метода на мембранната филтрация , и културалната течност се подава под налягане , но разликите между класическия метод на филтруване и мембранната филтрация е ,че се получават два потока филтрат

Четвъртият стадий е отделяне и пречистване на антибиотика.В процеса на образуване на антибиотика в културалната течност наред с присъствието на различни неизползвани компоненти на средата , се отделят и разнообразни продукти от обмяната , като по-голяма част от тях са продукти от автолизата на клетките.Отделянето на тези примеси е първият и много важен стадий на химическо пречистване на антибиотика.Стадият на отделяне и химическо пречистване включва редица процеси от обработка на нативния разтвор до изсушаване на готовия пречистен продукт . По време на този стадий в зависимост от свойствата н антибиотика , неговия химичен състав и място на условно натрупване , се прилагат различни методи за отделяне и пречистване . Като основни методи са екстракция , утаяване , сорбция върху йонообменни материали , изпаряване и изсушаване.Една от особеностите на стадия на отделяне и химическо пречистване е , че при отделяне на антбиотика се налага да се работи с доста ниски концентрации на отделеното вещество , които не превишават 1% в повечето случаи.В края на стадия на химическо пречистване вече се работи с по-високи концентрации , достигащи до 20-30%.При метода на екстракция доста често за целта на пречистване на антибиотика от различни примеси той многократно се прехвърля от един разтворител на друг с предварително утаяване или кристализация, и тази последователност е методът на прекристализация.Методите на утаяване се основават на принципа на това ,4е антибиотикът се свързва с органични или неорганични вещества с цел получаване на съединения , падащи като утайка.Получената утайка с помощта на филтри или центрофугиране се отделя от нативния разтвор , промива се и в редица случаи се изсушава , след което образува съединения , след което се образуващите се съединения се разлагат и антибиотикът се екстрахира или отново утаява.Йонообменната сорбция се състои в пропускане на водни разтвори на антибиотика , явяващи се по химичната си природа киселини , основи или амфотерни съединения , пропускащи се през колона със съответните йонообменни свойства , където антибиотичните вещества се сорбират , а разтворът с по-голяма част от примесите , имащ противоположен на антибиотика заряд , минава през колоната.

Следващ стадий е концентрираното получаване на разтвори чрез дестилация на по-голяма част от разтворитела като обикновено това се извършва в условия на дълбок вакуум.

Последният пети стадий е получаването на готовия продукт , приготвянето на лекарствени форми и разфасовка.Известно е ,че антибиотиците подлежат на високи изисквания-висока степен на чистота и стерилност.Поради това в този стадий на работа , но и в предходния , е необходимо да се спазват всички изисквания за чистота.За тази цел се поддържа висока тепен на чистота на самото обурудване , но и на самото помещение .Антибиотиците , които се използват в инжекционна форма , трябва да са стерилни.Затова получаването на такива прапарати и приготвянето на лекарствени форми и разфасовки се извършва в асептични условия.След изолирането и химическото пречистване на антибиотика , той трябва да бъде изсушен , т.е. от получения препарат да се отделят свободната и свързана вода.Доколкото повечето от антибиотиците са в една или друга степен термолабилни , за тяхното изсушаване е необходимо да се прилагат методи , които да не водят до загуби в биологичната активност , и да не променят цвета на препарата.При съвременното получаване на антибиотици се използват най-различни методи , като на първо място широко приложение има лиофилното изсушаване при ниски температури -8 ^оС ч -12 ^оС , но този метод е скъпоструващ и нископроизводителен.Затова в случаите , когато се работи с големи количества антибиотик , при изсушаването на препарата се използват разпрашителни сушилни. Разпрашителното сушене представлява пневматично изсушаване на суспензията или разтвора , и неговото подаване в камера с поток от нагрят въздух.Процесът на изсушаване протича в продължение на няколко минути , като по –голямата част от термолабилните вещества не променят формата си .Когато става въпрос за зърнени и пастообразни антибиотици , сушенето се извършва във вакуум сушилни.Готовият антибиотик след изсушаване се подава на биологичен и фармакологичен контрол .Биологичният контрол позволява да се определи стерилността на готовия препарат , при което се използват два метода . Първият е свързан с инактивирането на антибиотика и посяването му в съответната хранителна среда.Хранителната среда се култивира 2-3 денонощия при 37 ^оС , като ежедневно се наблюдава за възможен растеж на МО.Вторият метод за изясняване стерилността на антибиотика се определя от това , че за повечето от тези съединения няма биологични инактиватори по отношение на биологичната им активност.Затова при контролираните препарати се открива наличието на устойчиви на тях форми на МО , и се определя и възможно присъствие на чувствителна микрофлора.За определяне на възможното присъствие на чувствителни форми МО (бактерии) , разтворът на антибиотика се пропуска през мембранни филтри с диаметър на порите не по-голям от 0.75 микрона .След това микроскопски се наблюдава присъствие или отсъствие на микробни клетки.Всеки нов лекарствен прапарат преди да бъде разрешен за практическо приложение трябва да премине през педица изпитания за токсичност , т.е. подлежи на фармакологичен контрол.Препаратът се изпитва върху различни видове животни по отношение на неговата остра и хронична токсичност (влияние върху кръвта , ЦНС, дишането) . Показателите за остра токсичност са едни от най-важните критериии за качеството на веществото. Определя се максималната поносима доза на антибиотика , дозата предизвикваща смърт на 50% от всички животни , и дозата , която е смъртоносна за всички.Само след такова цялостно изпитване на препарата може да се използва за приложение.Опакованият антибиотик с указания за биологична активност , дата на производство и срок на годност се пуска в продажба.

В момента се отделя изключително внимание на методите за получаване на модифицирани форми на вече известни антибиотични вещества , тъй като на практика се оказва , че те притежават значително по-ценни свойства в сравнение с изходния препарат.В основата на полусинтетичните сбособи за получаване на антибиотици лежи следният принцип-в резултат на биосинтеза на антбиотици се получават изходни форми (цефалоспорин , тетрациклин ) , които подлежат на химична модификация.В редица случаи като основен изходен предшественик служи не само цялата молекула , а част от нея –пръстенното ядро.За производството на полусинтетични цефалоспорини се използват 7-аминоцефалиновата киселина и 6-аминопеницилиновата киселина , които впоследствие се подлагат на химична модификация.Получаването на 6-аминопеницилиновата киселина се извършва по три начина:

v    

v    

v    

По-ефективен способ за получаването на 6-аминопеницилиновата киселина е химичният метод , при който добивът достига до 90% , но като по-рационален метод е ензимната хидролиза на пеницилиновата молекула.Ензимът , който участва в хидролизата , е пеницилин-ацилаза която хидролизира молекулите на бензилпеницилина. до 6-аминопеницилинова киселина и фенилоцетна киселина.6-аминопеницилиновата киселина е лишена от антибиотична активност.Пеницилин-ацилазата се образува от различни видове МО , които притежават способността да продуцират пеницилин.Най-активни са ензимите , които се продуцират от бактерии и актиномицети.В момента получаването на 6-аминопеницилиновата киселина се извършва с помощта на имобилизирана пеницилин-ацилаза , която осигурява голям добив от продукта и висока степен на чистота.

v    

Културите на МО продуценти на антибиотици по своята същтност са хетерогенни и се състоят от множество варианти ,отличаващи се по морфологични , физиологични и биохимични свойства , и по нивото на биосинтеза на антибиотици.В разултат на спонтанни мутации могат да възникнат и възникват слабоактивни варианти .В периода на развитие на щам-продуцента на антибиотици в промишлени условия или в процеса на съхранение , той може спонтанно да се дисоциира на множество варианти , от които някои не са способни да образуват антибиотици. Така например при получаването на грамицидин С културата от Bacillus brevis R S P P , R P R R P⁺ S P

v