SKÚŠKA FUNKCIE Fc IMUNOGLOBULÍNU

SKÚŠKA  FUNKCIE Fc IMUNOGLOBULÍNU

Stabilizovaná ľudská krv. Ľudská krv skupiny 0 sa odoberie do antikoagulačného roztoku ACD. Stabilizovaná krv sa uchováva pri teplote 4 °C najviac 3 týždne.

Tlmivý fosforečnanový roztok s chloridom sodným s pH 7,2. 1,022 g hydrogenfosforečnanu sodného, bezvodého R, 0,336 g dihydrogenfosforečnanu sodného, bezvodého R a 8,766 g chloridu sodného R sa rozpustia v 800 ml vody R a zriedia sa tým istým rozpúšťadlom na
1 000 ml.

Zásobný roztok horčíka a vápnika. 1,103 g chloridu vápenatého R a 5,083 g chloridu horečnatého R sa rozpustia vo vode R a doplnia sa tým istým rozpúšťadlom do 25 ml.

Zásobný tlmivý barbitalový roztok. 207,5 g chloridu sodného R a 25,48 g barbitalu, sodnej soli R sa rozpustia v 4 000 ml vody R a upraví sa hodnota pH na 7,3 kyselinou chlorovodíkovou 1 mol/l. Pridá sa 12,5 ml zásobného roztoku horčíka a vápnika a roztok sa zriedi vodou R na 5 000 ml. Prefiltruje sa cez membránový filter (0,22 µm) a uchováva sa v sklenených obaloch pri teplote 4 °C.

Tlmivý barbitalový roztok s albumínom. 0,150 g albumínu hovädzieho R sa rozpustí v 20 ml zásobného tlmivého barbitalového roztoku a zriedi sa vodou R na 100 ml.

Tanínový roztok. 10 mg tanínu R sa rozpustí v 100 ml tlmivého fosforečnanového roztoku
s chloridom sodným s pH 7,2. Pripravuje sa v čase potreby.

Morčací komplement. Pripraví sa zmiešané sérum z krvi najmenej 10 morčiat. Sérum sa oddelí od zrazenej krvi centrifugáciou pri teplote asi 4 °C. Uchováva sa v malých množstvách pri teplote nižšej ako –70 °C. Tesne pred začiatkom hemolýzy vyvolanej komplementom sa sérum zriedi tlmivým barbitalovým roztokom s albumínom na 125 – 200 CH₅₀ na mililiter a zriedený roztok sa v priebehu skúšky udržuje v ľadovom kúpeli.

Antigén rubeoly. Vhodný antigén rubeoly na hemaglutinačno-inhibičnú titráciu (HIT). Titer
> 256 HA jednotiek.

Príprava ľudských erytrocytov s tanínom. Ľudské erytrocyty sa oddelia centrifugáciou vhodného objemu stabilizovanej ľudskej krvi a najmenej 3-krát sa premyjú tlmivým fosforečnanovým roztokom s chloridom sodným s p H 7,2. Tým istým roztokom sa suspendujú na suspenziu 2 % (V/V). 0,1 ml roztoku tanínu sa zriedi tlmivým fosforečnanovým roztokom s chloridom sodným s pH 7,2 na 7,5 ml (finálna koncentrácia je 1,3 mg/l). 1 objem tohto čerstvo pripraveného riedenia sa zmieša s 1 objemom suspenzie ľudských erytrocytov a 10 min sa inkubuje pri teplote 37 °C. Erytrocyty sa oddelia centrifugáciou (400 ot/min – 800 ot/min počas 10 min), supernatantná kvapalina sa odstráni a erytrocyty sa 1-krát premyjú tlmivým fosforečnanovým roztokom s chloridom sodným s pH 7,2. Erytrocyty sa resuspendujú tlmivým fosforečnanovým roztokom s chloridom sodným s pH 7,2 na 1 % (V/V).

Pridanie antigénu k ľudským erytrocytom. Odoberie sa potrebný objem (V_s) erytrocytov suspendovaných s tanínom, pridá sa antigén rubeoly v množstve 0,2 ml na 1,0 ml erytrocytov
a 30 min sa inkubuje pri teplote 37 °C. Erytrocyty sa oddelia centrifugáciou (400 ot/min až
800 ot/min počas 10 min) a odstráni sa také množstvo supernatantnej kvapaliny, aby zostal objem 200 µl. Pridá sa tlmivý barbitalový roztok s albumínom v objeme zodpovedajúcom objemu odstránenej supernatantnej kvapaliny, erytrocyty sa resuspendujú a centrifugujú, ako sme už opísali, a premývanie sa zopakuje. Zostávajúci objem 200 µl sa doplní do ³/₄ objemu V_s, čím sa získa počiatočný objem (V_i). 900 µl tlmivého barbitalového roztoku s albumínom sa zmieša so 100 µl objemu V_i, ktorý sa týmto spôsobom zmenšil na zvyškový objem V_r, a určí sa počiatočná absorbancia pri 541 nm (A). Objem V_r   sa zriedi tlmivým barbitalovým roztokom
s albumínom pomocou faktora, ktorý sa rovná A. Týmto spôsobom sa získa konečný upravený objem V_f = V_r x A ľudských senzibilizovaných erytrocytov; v prípade riedenia 1:10 sa hodnota A upraví na 1,0

Väzba protilátky na ľudské erytrocyty s tanínom pokryté antigénom. Pripravia sa rady nasledujúcich roztokov dvojmo, za použitia jednej semi-mikro kyvety (napr. na jedno použitie) alebo jednej skúmavky na každý roztok:

1. Skúšané roztoky. Ak treba, skúšaný imunoglobulín sa upraví na pH 7,0, napr. pridaním hydroxidu sodného 1 mol/l. Objemy skúšaného produktu obsahujúce 30 mg a 40 mg imunoglobulínu sa doplnia tlmivým barbitalovým roztokom s albumínom na 900 µl.

2. Referenčné roztoky. Referenčné roztoky sa pripravia ako skúšané roztoky s použitím ľudského imunoglobulínu BRP.

3. Kontrolný komplement. 900 µl tlmivého barbitalového roztoku s albumínom.

Do každej kyvety (skúmavky) sa pridá 100 µl ľudských senzibilizovaných erytrocytov
a skúmavky sa dôkladne premiešajú.

Nechajú sa 15 min stáť pri izbovej teplote a pridá sa 1 000 µl tlmivého barbitalového roztoku s albumínom. Erytrocyty sa oddelia centrifugáciou (1 000 ot/min počas 10 min) a odoberie sa
1 900 µl supernatantnej kvapaliny. Pridá sa 1 900 µl tlmivého barbitalového roztoku
s albumínom a premývanie sa opakuje dovtedy, kým nezostane konečný objem 200 µl. Skúšané vzorky sa môžu uchovávať vo vzduchotesne uzavretých kyvetách (skúmavkách) 24 h pri teplote 4 °C.

Hemolýza vyvolaná komplementom. Na určenie hemolýzy sa k skúšanej vzorke pridá 600 µl tlmivého barbitalového roztoku s albumínom zahriateho na teplotu 37 °C. Erytrocyty sa opatrne resuspendujú opakovaným pipetovaním (najmenej 5-krát) a kyveta sa vloží do spektrofotometra vybaveného termostatom. Po 2 min sa pridá 200 µl morčacieho komplementu zriedeného na 125 až 200 CH₅₀/ml. Opatrne sa 2-krát premieša pipetovaním zmesi a ihneď sa zaznamenáva absorbancia v závislosti od času pri 541 nm s použitím tlmivého barbitalového roztoku
s albumínom ako kompenzačnej kvapaliny. Meranie sa zastaví vtedy, keď krivka absorbancie ako časovej závislosti zreteľne prekročí inflexný bod.

Vyhodnotenie. Určí sa smernica (S) hemolytickej krivky v približnom bode inflexie tak, že sa vymedzí najstrmší úsek s vhodným časovým intervalom Dt (napr. Dt = 1 min) a vypočíta sa S medzi priľahlými priesečníkovými bodmi, vyjadrená ako DA za minútu. Zistí sa najväčšia hodnota pre S ako (S_exp). Okrem toho sa určí absorbancia na začiatku merania (A_s) extrapoláciou krivky, ktorá je takmer lineárna a rovnobežná s časovou osou v prvých minútach záznamu. Hodnota S_exp sa koriguje podľa vzťahu

Vypočíta sa aritmetický priemer z hodnôt S´ pre každý prípravok. Vypočíta sa index funkcie Fc (I_Fc) zo vzťahu

kde aritmetický priemer korigovanej smernice skúšaného prípravku,

aritmetický priemer korigovanej smernice referenčného prípravku,

aritmetický priemer korigovanej smernice kontrolného komplementu.

Vypočíta sa index funkcie Fc skúšaného prípravku. Hodnota nie je menšia ako hodnota uvedená v príbalovej informácii referenčného prípravku.