SKÚŠKY NA CUDZIE AGENSY VO VÍRUSOVÝCH OČKOVACÍCH LÁTKACH NA HUMÁNNE POUŽITIE

SKÚŠKY NA CUDZIE AGENSY VO VÍRUSOVÝCH OČKOVACÍCH LÁTKACH NA HUMÁNNE POUŽITIE

V skúškach, ktoré vyžadujú predbežnú neutralizáciu vírusu, sa použijú špecifické protilátky, ktoré nie sú ľudského ani opičieho pôvodu; ak sa vírus pomnožoval na vtáčom substráte, protilátky nesmú byť vtáčieho pôvodu. Na prípravu antiséra sa použije imunizujúci antigén vyprodukovaný na tkanivových kultúrach odlišného druhu, aký sa použil na produkciu očkovacej látky, a nesmie obsahovať cudzie agensy. Ak sa predpisuje použitie vajec SPF, produkujú sa z chovu, ktorý neobsahuje špecifikované patogénne mikroorganizmy (5.2.2. Chov kurčiat SPF na produkciu a kontrolu kvality očkovacích látok).

VÍRUSOVÉ INOKULUM

Vzorky pomnoženého vírusu sa odoberú a v prípade, že sa neskúšajú ihneď, uchovávajú sa pri teplote nižšej ako – 40 °C.

Dospelé myši. Najmenej desiatim dospelým myšiam s hmotnosťou 15,0 g – 20,0 g sa aplikuje 0,03 ml intracerebrálne a 0,5 ml vírusového inokula intraperitoneálne. Myši sa pozorujú najmenej 21 dní. Vykoná sa pitva všetkých myší, ktoré uhynuli po prvých 24 h skúšky alebo ktoré prejavujú príznaky choroby, aby sa zistili známky vírusovej infekcie. Vyšetruje sa makroskopickým pozorovaním a preočkovaním vhodnej tkanivovej suspenzie intracerebrálne a intraperitoneálne najmenej ďalším piatim myšiam, ktoré sa pozorujú 21 dní. Vírusové inokulum vyhovuje skúške, ak žiadna myš neprejavuje známky infekcie príznačné inokulovanému vírusu. Skúška je platná len vtedy, ak najmenej 80 % pôvodne naočkovaných myší prežije dobu pozorovania.

Cicajúce myšky. Najmenej dvadsiatim myšiam nie starším ako 24 h sa aplikuje 0,01 ml vírusového inokula intracerebrálne a najmenej 0,1 ml intraperitoneálne. Myši sa pozorujú denne najmenej 14 dní. Vykoná sa pitva všetkých myší, ktoré uhynuli po prvých 24 h skúšky alebo ktoré prejavujú príznaky choroby, aby sa zistili známky vírusovej infekcie. Vyšetruje sa makroskopickým pozorovaním a preočkovaním vhodnej tkanivovej suspenzie intracerebrálne
a intraperitoneálne najmenej ďalším piatim myšiam, ktoré sa pozorujú denne v priebehu 14 dní. Vírusové inokulum vyhovuje skúške, ak žiadna myš neprejavuje známky infekcie príznačné inokulovanému vírusu. Skúška je platná len vtedy, ak najmenej 80 % pôvodne naočkovaných myší prežije dobu pozorovania.

Morčatá. Najmenej piatim morčatám s hmotnosťou 350,0 g – 450,0 g sa aplikuje 5,0 ml inokula intraperitoneálne. Zvieratá sa pozorujú najmenej 42 dní. Vykoná sa pitva všetkých morčiat, ktoré uhynuli po prvých 24 h skúšky alebo ktoré prejavujú príznaky choroby, a vyšetrenie sa vykoná makroskopicky; tkanivá sa vyšetria mikroskopicky a kultivačne na prítomnosť infekcie. Zvieratá, ktoré prežili čas pozorovania, sa utratia a vyšetrujú sa rovnakým spôsobom. Vírusové inokulum vyhovuje skúške, ak žiadne morča neprejavuje známky infekcie príznačné pre inokulovaný vírus. Skúška je platná len vtedy, ak najmenej 80 % morčiat prežije dobu pozorovania.

SKÚŠKY VÍRUSOVÉHO INOKULA

Vzorky pomnoženého vírusu sa odoberú a v prípade, že sa neskúšajú ihneď, uchovávajú sa pri teplote nižšej ako – 40 °C.

Baktérie a huby. 10 ml vzorky musí vyhovovať skúške Sterilita (2.6.1).

Mykoplazmy. 10 ml vzorky musí vyhovovať skúške Dôkaz mykoplaziem (2.6.7).

Mykobaktérie (2.6.2). 5 ml vzorky sa skúša na prítomnosť Mycobacterium spp. kultivačnými metódami uznanými, že sú citlivé na dôkaz týchto mikroorganizmov.

Skúška na iné cudzie agensy v tkanivových kultúrach. Neutralizované vzorky zodpovedajúce, ak nie je predpísané inak, 500 ľudským dávkam alebo 50 ml očkovacej látky (podľa toho, čo je viac), sa skúšajú na prítomnosť cudzích agensov inokuláciou do kontinuálnych tkanivových kultúr z opičích obličiek a ľudských buniek. Ak sa vírus pomnožoval na ľudských diploidných bunkách, neutralizovaný odobratý vírus sa skúša aj na oddelenej kultúre diploidných buniek. Ak sa vírus očkovacej látky pomnožoval na inom bunkovom systéme ako na opičom alebo ľudskom, inokulujú sa bunky aj tohto druhu z oddelenej kultúry. Bunky sa inkubujú pri teplote 36 °C ± 1 °C a pozorujú sa 14 dní. Inokulovaný vírus vyhovuje skúške, ak žiadna z tkanivových kultúr nevykazuje prítomnosť akýchkoľvek cudzích agensov, ktoré nemožno pripísať náhodnej kontaminácii. Skúška je platná len vtedy, ak prežije najmenej 80 % tkanivových kultúr.

Vtáčie vírusy (skúška sa vyžaduje len pre vírus pomnožený na vtáčích tkanivových kultúrach). Neutralizuje sa vzorka zodpovedajúca 100 ľudským dávkam alebo 10 ml (podľa toho, čo je viac). Množstvo 0,5 ml na jedno vajce sa inokuluje skupine 9- až 11-dňových fertilných vajec SPF do alantoidného vaku a druhej skupine 5- až 7-dňových vajec do žatkového vaku. Inkubuje sa 7 dní. Inokulovaný vírus vyhovuje skúške, ak alantoidná a žatková tekutina nevykazuje prítomnosť akéhokoľvek hemaglutinačného agensa a ak sú všetky embryá a chorioalantoidné membrány po makroskopickom vyšetrení bez patologického nálezu. Skúška je platná len vtedy, ak najmenej 80 % naočkovaných embryí prežije 7 dní.

KULTÚRY PRODUKČNÝCH BUNIEK: KONTROLNÉ BUNKY

Kontrolné bunky sa mikroskopicky vyšetrujú na neprítomnosť akéhokoľvek vírusu vyvolávajúceho cytopatickú degeneráciu v priebehu inkubácie alebo najmenej 14 dní od naočkovania produkčných buniek (podľa toho, čo je dlhšie). Skúška je platná len vtedy, ak prežije najmenej 80 % kontrolných bunkových kultúr do konca pozorovacieho času.

Po 14 dňoch alebo v čase posledného odberu vírusu (podľa toho, čo je dlhšie), urobia sa ďalej opísané skúšky.

Skúška na hemadsorbujúce vírusy. Skúša sa najmenej 25 % kontrolných kultúr na prítomnosť hemadsorbujúcich vírusov pridaním morčacích erytrocytov. V prípade, že sa morčacie erytrocyty uchovávajú, je potrebné ich uchovávať najdlhšie 7 dní pri teplote
5 °C ± 3 °C. Polovica kultúr sa odčíta po 30-minútovej inkubácii pri teplote 5 °C ± 3 °C a druhá polovica po 30-minútovej inkubácii pri teplote 20 °C až 25 °C. Nesmú sa prejaviť známky prítomnosti hemadsorbujúcich agensov.

Skúška na iné cudzie agensy v tkanivových kultúrach. Supernatantné tekutiny z kontrolných buniek sa zmiešajú a skúšajú sa na prítomnosť cudzích agensov inokuláciou do tkanivových kultúr z opičích obličiek a ľudských buniek. Ak sa vírus očkovacej látky pomnožoval na inom bunkovom systéme ako na opičom alebo ľudskom, inokulujú sa bunky aj tohto druhu
z oddelenej kultúry. Na každom bunkovom systéme sa skúša najmenej 5 ml. Inokulované kultúry sa inkubujú pri teplote 36 °C ± 1 °C a pozorujú sa 14 dní. Nesmú sa prejaviť známky prítomnosti cudzích agensov.

Ak sa kultúra produkčných buniek udržuje pri inej teplote ako pri 36 °C ± 1 °C, urobí sa ďalšia skúška na cudzie agensy pri produkčnej teplote s použitím toho istého druhu buniek, aký sa použil na rast vírusu.

Vírusy vtáčej leukózy (skúška sa vyžaduje len pre vírus pomnožený na vtáčích tkanivových kultúrach). Urobí sa skúška na vírusy vtáčej leukózy s použitím 5 ml supernatantnej tekutiny z kontrolných buniek.

KONTROLNÉ VAJCIA

Hemaglutinačné agensy. 0,25 ml alantoidnej tekutiny z každého vajca sa skúša na hemaglutinačné agensy priamym zmiešaním s kuracími erytrocytmi a pasážuje sa na vajciach SPF. Ďalej sa postupuje takto: inokuluje sa 5 ml vzorky zo zmiešanej amniotickej tekutiny
z kontrolných vajec vždy po 0,5 ml do alantoidnej a amniotickej dutiny vajec SPF. Kontrolné vajcia vyhovujú skúške, ak sa nedokáže prítomnosť hemaglutinačných agensov v obidvoch skúškach.

Vírusy vtáčej leukózy. Použije sa 10 ml vzorky zo zmiešanej amniotickej tekutiny z kontrolných vajec. Pomnožuje sa päťnásobným pasážovaním na tkanivových kultúrach kuracích embryí, ktoré nemajú leukózu; urobí sa skúška na vtáčiu leukózu s použitím buniek z piatej pasáže. Kontrolné vajcia vyhovujú skúške, ak sa nedokáže prítomnosť vírusov vtáčej leukózy.

Iné cudzie agensy. 5 ml vzorky zo zmiešanej amniotickej tekutiny z kontrolných vajec sa inokuluje do ľudských a opičích tkanivových kultúr. Tkanivové kultúry sa sledujú 14 dní. Kontrolné vajcia vyhovujú skúške, ak sa nedokáže prítomnoť cudzích agensov. Skúška je platná len vtedy, ak prežije 80 % inokulovaných kultúr do konca pozorovacieho času.