STANOVENIE BIOLOGICKEJ ÚČINNOSTI ĽUDSKÉHO KOAGULAČNÉHO FAKTORA VII

STANOVENIE  BIOLOGICKEJ ÚČINNOSTI ĽUDSKÉHO KOAGULAČNÉHO  FAKTORA VII

Stanovenie biologickej aktivity koagulačného faktora VII sa zakladá na jeho pôsobení ako komplexu faktora VIIa-tkanivového faktora pri aktivácii faktora X za prítomnosti iónov Ca²⁺
a fosfolipidov. Účinnosť prípravku faktora VII sa stanovuje porovnaním množstva tohto prípravku potrebného na dosiahnutie určitej rýchlosti tvorby faktora Xa v skúšanej zmesi
s množstvom medzinárodného štandardu alebo referenčného prípravku kalibrovaného
v medzinárodných jednotkách, ktoré je potrebné na dosiahnutie tej istej rýchlosti tvorby faktora Xa.

Medzinárodnou jednotkou je aktivita faktora VII v stanovenom množstve medzinárodného štandardu, ktorý pozostáva z lyofilizovanej plazmy. Ekvivalenciu medzinárodného štandardu
v medzinárodných jednotkách vyhlasuje Svetová zdravotnícka organizácia.

Chromogénna metóda stanovenia spočíva v dvoch po sebe nasledujúcich stupňoch:

– aktivácia faktora X, ktorá závisí od faktora VII v reagenčnej zmesi obsahujúcej tkanivový

faktor, fosfolipidy a ióny Ca²⁺,

– enzýmové štiepenie chromogénneho substrátu faktora Xa, pričom sa uvoľňuje chromofór,

ktorého kvantita sa môže stanoviť spektrofotometricky; za vhodných podmienok stanovenia je

lineárny vzťah medzi rýchlosťou tvorby faktora Xa a koncentráciou faktora VII.

Princíp stanovenia je vyjadrený touto schémou:

tkanivový faktor + Ca²⁺

1. stupeň a) faktor VII faktor VIIa ,

faktor VIIa + Ca²⁺ + tkanivový faktor/fosfolipidy

b) faktor X faktor Xa ,

faktor Xa

2. stupeň chromogénny substrát peptid + chromofór .

Obidva stupne používajú reagencie, ktoré sú komerčne dostupné z rôznych zdrojov. Aj keď sa zloženie jednotlivých reagencií môže meniť, ich základné vlastnosti sú opísané v nasledujúcej špecifikácii.

REAGENCIE

Reagencia pre koagulačný faktor obsahuje purifikované bielkoviny získané z ľudských alebo z hovädzích zdrojov. Obsahuje faktor X, tromboplastín a fosfolipidický tkanivový faktor ako aktivátor faktora VII. Tieto bielkoviny sú čiastočne purifikované a neobsahujú nečistoty, ktoré by zasahovali do aktivácie faktora VII alebo faktora X. Faktor X sa nachádza v takom množstve, aby jeho konečná koncentrácia v prvom stupni stanovenia bola 10 nmol až 350 nmol na liter, podľa možnosti 14 nmol až 70 nmol na liter. Ako fosfolipidická zložka tkanivového faktora sa môže použiť tromboplastín pochádzajúci z prírodných materiálov (z hovädzieho alebo králičieho mozgu) alebo syntetický tromboplastín. Tromboplastín vhodný na určenie protrombínového času sa riedi tlmivým roztokom v pomere 1:5 až 1:50 tak, aby konečná koncentrácia iónov Ca²⁺ bola 15 mmol až 25 mmol na liter. Konečná etapa tvorby faktora Xa prebieha v roztoku obsahujúcom ľudský alebo hovädzí albumín upravený na hodnotu pH v rozsahu 7,3 až 8,0
a v koncentrácii, pri ktorej nevznikajú straty adsorpciou. V konečnej inkubačnej zmesi musí byť faktor VII jedinou zložkou určujúcou rýchlosť reakcie a žiadna reagenčná zložka zmesi nesmie mať sama osebe schopnosť tvoriť faktor Xa.

Druhý stupeň spočíva v stanovení množstva faktora Xa vytvoreného v prvom stupni za použitia chromogénneho substrátu, špecifického pre faktor Xa. Zvyčajne pozostáva z derivovaného krátkeho peptidu troch až piatich aminokyselín pripojeného k zoskupeniu chromofórov. Odštiepenie tohto zoskupenia od peptidického substrátu má za následok posun maxima absorbancie do vlnovej dažky, ktorá umožní jeho kvantitatívne stanovenie spektrofotometricky. Substrát sa zvyčajne rozpúšťa vo vode R a používa sa v konečnej koncentrácii 0,2 mmol až 2 mmol na liter. Substrát môže obsahovať aj vhodné inhibítory na zastavenie ďalšej tvorby faktora Xa (pridaním edetanu).

POSTUP

Celý obsah ampuliek referenčného prípravku a skúšaného prípravku sa rozpustí pridaním vhodného množstva vody R; použije sa do 1 h. Pridá sa dostatočné množstvo vhodnej riediacej reagencie, aby vznikli roztoky obsahujúce 0,5 I. U. až 2,0 I. U. faktora VII na mililiter.

Pripravia sa riedenia referenčného a skúšaného prípravku za použitia tlmivého izotonického roztoku bez komplexotvornej látky, ktorý obsahuje 1 % ľudského alebo hovädzieho albumínu
a ktorého pH sa upravilo na hodnotu v rozsahu 7,3 až 8,0. Z každého prípravku sa pripravia najmenej tri oddelené a nezávislé riedenia, podľa možnosti dvojmo. Riedenia sa pripravia tak, aby konečná koncentrácia faktora VII bola menšia ako 0,005 I. U. na mililiter.

Pripraví sa kontrolný roztok, ktorý obsahuje všetky zložky okrem faktora VII.

Všetky riedenia sa pripravujú v plastových skúmavkách a použijú sa do 1 h.

1. Stupeň. Ku každému riedeniu referenčného prípravku a skúšaného prípravku sa pridá potrebný objem predhriatej koagulačnej reagencie (alebo zmes jej jednotlivých zložiek), premieša sa a inkubuje sa v plastových skúmavkách alebo v jamkách mikroplatničky pri teplote 37 °C. Koncentrácie jednotlivých zložiek počas tvorby faktora Xa musia byť také, aké sa opisujú pri reagenciách.

Aktivácia faktora X sa nechá prebiehať určitý vhodný čas a reakcia sa zvyčajne skončí pred dosiahnutím maximálnej koncentrácie faktora Xa, aby krivka predstavovala vyhovujúci lineárny vzťah dávka – odpoveď. Čas aktivácie sa volí aj tak, aby krivka tvorby faktora Xa v závislosti od času bola lineárna. Vhodný čas aktivácie je zvyčajne 2 min až 5 min; odchýlky sú dovolené
v prípade, že sa tým dosiahne prijateľná linearita vzťahu dávka – odpoveď.

2. Stupeň. Reakcia sa skončí pridaním predhriatej reagencie obsahujúcej chromogénny substrát. Rýchlosť štiepenia substrátu, ktorá musí byť vo vzťahu ku koncentrácii faktora Xa lineárna, sa určí kvantitatívne meraním zmeny absorbancie pri vhodnej vlnovej dažke použitím spektrofotometra buď kontinuálnym meraním absorbancie (tým sa umožní vypočítať počiatočnú rýchlosť štiepenia), alebo skončením hydrolýzy po určitom čase tak, že sa zníži hodnota pH po pridaní vhodnej reagencie, napr. kyseliny octovej (500 g/l C₂H₄O₂) alebo citrátového roztoku
s pH 3,0 (1 mol/l). Upraví sa čas hydrolýzy tak, aby bola krivka tvorby chromofóru v závislosti od času lineárna. Vhodný čas hydrolýzy je zvyčajne v rozpätí 3 min až 15 min; odchýlky sú dovolené v prípade, že sa tým dosiahne lepšia linearita vzťahu dávka – odpoveď.

Skontroluje sa platnosť stanovenia a vypočíta sa účinnosť skúšaného prípravku bežnými štatistickými metódami (napr. 5.3. Štatistické vyhodnotenie výsledkov stanovenia biologickej účinnosti a skúšok).