Scrigroup - Documente si articole

     

HomeDocumenteUploadResurseAlte limbi doc
BulgaraCeha slovacaCroataEnglezaEstonaFinlandezaFranceza
GermanaItalianaLetonaLituanianaMaghiaraOlandezaPoloneza
SarbaSlovenaSpaniolaSuedezaTurcaUcraineana

BiologieBudovaChemieEkologieEkonomieElektøinaFinanceFyzikální
GramatikaHistorieHudbaJídloKnihyKomunikaceKosmetikaLékaøství
LiteraturaManagementMarketingMatematikaObchodPoèítaèùPolitikaPrávo
PsychologieRùznéReceptySociologieSportSprávaTechnikaúèetní
VzdìláníZemìdìlstvíZemìpisžurnalistika

STANOVENIE BIOLOGICKEJ ÚÈINNOSTI ¼UDSKÉHO KOAGULAÈNÉHO FAKTORA VIII

lékaøství



+ Font mai mare | - Font mai mic



DOCUMENTE SIMILARE

TERMENI importanti pentru acest document

STANOVENIE  BIOLOGICKEJ ÚÈINNOSTI ¼UDSKÉHO KOAGULAÈNÉHO  FAKTORA VIII



Stanovenie biologickej aktivity ¾udského koagulaèného faktora VIII sa zakladá na jeho pôsobení ako kofaktora pri aktivácii faktora X aktivovaným faktorom IX (faktor IXa) za prítomnosti iónov Ca2+ a fosfolipidov. Úèinnos prípravku faktora VIII sa stanovuje porovnaním množstva tohto prípravku potrebného na dosiahnutie urèitej rýchlosti tvorby faktora Xa
v skúšanej zmesi s množstvom medzinárodného štandardu alebo referenèného prípravku kali-brovaného v medzinárodných jednotkách, ktoré je potrebné na dosiahnutie tej istej rýchlosti tvorby faktora Xa. Skúšaná zmes obsahuje rôzne látky, ktoré vstupujú do aktivácie faktora X.

Medzinárodnou jednotkou je aktivita faktora VIII v stanovenom množstve medzinárodného štandardu, ktorý pozostáva z lyofilizovaného koncentrátu ¾udského koagulaèného faktora VIII. Ekvivalenciu medzinárodného štandardu v medzinárodných jednotkách vyhlasuje Svetová zdravotnícka organizácia.

¼udský koagulaèný faktor VIII BRP je kalibrovaný v medzinárodných jednotkách porovnaním s medzinárodným štandardom.

Chromogénna metóda stanovenia spoèíva v dvoch po sebe nasledujúcich stupòoch, a to v

– aktivácii faktora X, ktorá závisí od faktora VIII v koagulaènej reagenènej zmesi zloženej

z jednotlivých purifikovaných zložiek,

– enzýmovom štiepení chromogénneho substrátu faktora Xa, prièom sa uvo¾òuje chromofór,

ktorého kvantita sa môže stanovi spektrofotometricky; za vhodných podmienok stanovenia je

lineárny vzah medzi rýchlosou tvorby faktora Xa a koncentráciou faktora VIII.

Princíp stanovenia je vyjadrený touto schémou:

(aktivovaný) faktor VIII

1. stupeò faktor X faktor Xa,

faktor IXa, fosfolipid, Ca2+

faktor Xa

2. stupeò chromogénny substrát peptid + chromofór.

Obidva stupne používajú reagencie, ktoré sú komerène dostupné z rôznych zdrojov. Aj keï sa zloženie jednotlivých reagencií môže meni, ich základné vlastnosti sa opisujú ïalej
v špecifikácii. Odchýlky od tohto opisu sa povo¾ujú iba v prípade, ak sa pri použití medzinárodného štandardu pre koncentrát ¾udského krvného koagulaèného faktora VIII dokáže, že získané výsledky sa signifikantne nelíšia.

Komerèné testovacie súpravy sa používajú pod¾a návodu výrobcu je dôležité, aby sa zistila vhodnos použitej súpravy na stanovenie.

REAGENCIE

Reagencia pre koagulaèný faktor obsahuje purifikované bielkoviny získané z ¾udských alebo hovädzích zdrojov. Obsahuje faktor X, faktor IXa a aktivátor faktora VIII, ktorým je zvyèajne trombín. Tieto bielkoviny sú èiastoène purifikované, pokia¾ možno najmenej na 50 %,
a neobsahujú neèistoty, ktoré by zasahovali do aktivácie faktora VIII alebo faktora X. Faktor X sa nachádza v takom množstve, aby jeho koneèná koncentrácia poèas prvého stupòa stanovenia bola 10 nmol až 350 nmol na liter, pod¾a možnosti 15 nmol až 30 nmol na liter. Faktor IXa sa pripravuje aktiváciou purifikovaného faktora IX na faktor IXa s použitím faktora XIa
a nasledujúcou purifikáciou faktora IXa
z reakènej zmesi. Jeho koneèná koncentrácia poèas tvorby faktora Xa je menšia ako 30 % koncentrácie faktora X, zvyèajne 1 nmol až 100 nmol na liter, pod¾a možnosti 1 nmol až 10 nmol na liter. Trombín môže by prítomný vo forme prekurzora – protrombínu za predpokladu, že jeho aktivácia v reagencii je dostatoène rýchla, aby v priebehu stanovenia umožòovala stálu a úplnú aktiváciu faktora VIII. Fosfolipidy sa môžu získa z prírodných zdrojov, napr. z hovädzieho mozgu alebo z miechy, prípadne zo sójového výažku, alebo sa môžu pripravi synteticky a musia obsahova znaèný podiel, zvyèajne 15 % až 35 %, druhov fosfatidylserínu. Koneèná koncentrácia fosfolipidov poèas tvorby faktora Xa je 1 mol až 50 mol na liter, pod¾a možnosti 10 mol až 35 mol na liter. Reagencia obsahuje vápenaté ióny v takom množstve, aby ich koneèná koncentrácia bola 5 mmol až 15 mmol na liter. Koneèná tvorba faktora Xa prebieha v roztoku obsahujúcom najmenej 1 mg ¾udského alebo hovädzieho albumínu na mililiter, ktorý je vhodne upravený na hodnotu pH v rozsahu 7,3 až 8,0. Zložky kompletnej reagencie sa zvyèajne rozde¾ujú najmenej na dve reagencie, ktoré samy osebe nie sú schopné tvori faktor Xa. Po rozpustení sa môžu zmieša za predpokladu, že sa v neprítomnosti faktora VIII nevytvorí podstatné množstvo faktora Xa. V koneènej inkubaènej zmesi musí by faktor VIII jedinou zložkou limitujúcou rýchlos reakcie.

Druhý stupeò spoèíva v stanovení množstva faktora Xa vytvoreného v prvom stupni
s použitím chromogénneho substrátu špecifického pre faktor Xa. Zvyèajne sa používa derivát krátkeho peptidu z troch až piatich aminokyselín, ktoré sú pripojené k skupine chromofórov. Odštiepením tejto skupiny od peptidického substrátu sa posunie chromoformná aktivita do vlnovej dažky, ktorá umožòuje jeho spektrofotometrické stanovenie. Substrát sa zvyèajne rozpustí vo vode R a používa sa v koneènej koncentrácii 0,2 mmol až 2 mmol na liter. Substrát môže obsahova aj vhodné inhibítory na zastavenie ïalšej tvorby faktora Xa a na potlaèenie trombínovej aktivity a tým sa zlepšuje selektivita stanovenia faktora Xa.

POSTUP

Celý obsah ampuliek referenèného prípravku a skúšaného prípravku sa rozpustí pridaním vhodného množstva vody R; použije sa ihneï. Pridá sa dostatoèné množstvo základnej riediacej reagencie, aby vznikli roztoky obsahujúce 0,5 I. U. až 2,0 I. U. faktora VIII na mililiter.

Základná riediaca reagencia pozostáva z plazmy od darcu postihnutého ažkou hemofíliou A alebo zo synteticky pripravenej reagencie, ktorej výsledky sa signifikantne nelíšia od výsledkov získaných s použitím hemofilickej plazmy a toho istého referenèného a skúšaného prípravku. Základná riediaca reagencia musí by dlhšie stabilná, než trvá stanovenie, najmenej 30 min pri teplote 20 °C, a musí sa použi do 15 minút.

Pripravia sa riedenia referenèného a skúšaného prípravku s izotonickým nechelátovým tlmivým roztokom obsahujúcim 1 % ¾udského alebo hovädzieho albumínu a trometamol alebo imidazol; upravené na hodnotu pH v rozsahu 7,3 až 8,0. Z každého prípravku sa pripravia najmenej tri oddelené a nezávislé riedenia, pod¾a možnosti dvojmo. Riedenia sa pripravia tak, aby koneèná koncentrácia faktora VIII poèas tvorby faktora Xa bola menšia ako 0,03 I. U. na mililiter, pod¾a možnosti menšia ako 0,01 I. U. na mililiter.

Pripraví sa kontrolný roztok, ktorý obsahuje všetky zložky okrem faktora VIII.

Všetky riedenia sa pripravujú v plastových skúmavkách a ihneï sa použijú.

1. Stupeò. Ku každému riedeniu referenèného prípravku a skúšaného prípravku sa pridá potrebný objem predhriatej koagulaènej reagencie (alebo zmes jednotlivých jej zložiek), premieša sa a inkubuje sa v plastových skúmavkách alebo v jamkách mikroplatnièky pri teplote 37 °C. Koncentrácie jednotlivých zložiek poèas tvorby faktora Xa musia by také, aké sa opisujú pri reagenciách. Na aktiváciu faktora X je potrebný vhodný èas. Reakcia sa zvyèajne skonèí pred dosiahnutím maximálnej koncentrácie faktora Xa, aby krivka predstavovala vyhovujúci lineárny vzah dávka – odpoveï. Èas aktivácie sa volí tak, aby krivka tvorby faktora Xa v tomto èase bola lineárna. Vhodný èas aktivácie je zvyèajne 2 min až 5 min; odchýlky sú dovolené
v prípade, že sa tým dosiahne prijate¾ná linearita vzahu dávka – odpoveï.

2. Stupeò. Aktivácia sa skonèí pridaním predhriatej reagencie, ktorá obsahuje chromogénny substrát. Spektrofotometrickým meraním zmeny absorbancie pri vhodnej vlnovej dažke sa urèí rýchlos štiepenia substrátu, ktorá musí by vo vzahu ku koncentrácii faktora Xa lineárna. Rýchlos štiepenia sa urèí dvojakým spôsobom: kontinuálnym meraním absorbancie, ktoré umožní vypoèíta poèiatoènú rýchlos štiepenia substrátu, alebo skonèením hydrolýzy po vhodnom èase tak, že sa po pridaní vhodnej reagencie, napr. kyseliny octovej (500 g/l C2H4O2) alebo citrátového roztoku s pH 3,0 (1 mol/l) zníži hodnota pH. Upraví sa èas hydrolýzy tak, aby bola krivka tvorby chromofóru v závislosti od èasu lineárna. Vhodný èas hydrolýzy je zvyèajne v rozpätí 3 min až 15 min; odchýlky sú dovolené v prípade, že sa tým dosiahne lepšia linearita vzahu dávka – odpoveï.

Skontroluje sa platnos stanovenia a vypoèíta sa úèinnos skúšaného prípravku bežnými štatistickými metódami pre model pomeru smerníc (napr. 5.3 Štatistické vyhodnotenie výsledkov stanovenia biologickej úèinnosti a skúšok).



Politica de confidentialitate | Termeni si conditii de utilizare



DISTRIBUIE DOCUMENTUL

Comentarii


Vizualizari: 731
Importanta: rank

Comenteaza documentul:

Te rugam sa te autentifici sau sa iti faci cont pentru a putea comenta

Creaza cont nou

Termeni si conditii de utilizare | Contact
© SCRIGROUP 2025 . All rights reserved