STANOVENIE BIOLOGICKEJ ÚČINNOSTI ĽUDSKÉHO KOAGULAČNÉHO FAKTORA VIII

STANOVENIE  BIOLOGICKEJ ÚČINNOSTI ĽUDSKÉHO KOAGULAČNÉHO  FAKTORA VIII

Stanovenie biologickej aktivity ľudského koagulačného faktora VIII sa zakladá na jeho pôsobení ako kofaktora pri aktivácii faktora X aktivovaným faktorom IX (faktor IXa) za prítomnosti iónov Ca²⁺ a fosfolipidov. Účinnosť prípravku faktora VIII sa stanovuje porovnaním množstva tohto prípravku potrebného na dosiahnutie určitej rýchlosti tvorby faktora Xa
v skúšanej zmesi s množstvom medzinárodného štandardu alebo referenčného prípravku kali-brovaného v medzinárodných jednotkách, ktoré je potrebné na dosiahnutie tej istej rýchlosti tvorby faktora Xa. Skúšaná zmes obsahuje rôzne látky, ktoré vstupujú do aktivácie faktora X.

Medzinárodnou jednotkou je aktivita faktora VIII v stanovenom množstve medzinárodného štandardu, ktorý pozostáva z lyofilizovaného koncentrátu ľudského koagulačného faktora VIII. Ekvivalenciu medzinárodného štandardu v medzinárodných jednotkách vyhlasuje Svetová zdravotnícka organizácia.

Ľudský koagulačný faktor VIII BRP je kalibrovaný v medzinárodných jednotkách porovnaním s medzinárodným štandardom.

Chromogénna metóda stanovenia spočíva v dvoch po sebe nasledujúcich stupňoch, a to v

– aktivácii faktora X, ktorá závisí od faktora VIII v koagulačnej reagenčnej zmesi zloženej

z jednotlivých purifikovaných zložiek,

– enzýmovom štiepení chromogénneho substrátu faktora Xa, pričom sa uvoľňuje chromofór,

ktorého kvantita sa môže stanoviť spektrofotometricky; za vhodných podmienok stanovenia je

lineárny vzťah medzi rýchlosťou tvorby faktora Xa a koncentráciou faktora VIII.

Princíp stanovenia je vyjadrený touto schémou:

(aktivovaný) faktor VIII

1. stupeň faktor X faktor Xa,

faktor IXa, fosfolipid, Ca²⁺

faktor Xa

2. stupeň chromogénny substrát peptid + chromofór.

Obidva stupne používajú reagencie, ktoré sú komerčne dostupné z rôznych zdrojov. Aj keď sa zloženie jednotlivých reagencií môže meniť, ich základné vlastnosti sa opisujú ďalej
v špecifikácii. Odchýlky od tohto opisu sa povoľujú iba v prípade, ak sa pri použití medzinárodného štandardu pre koncentrát ľudského krvného koagulačného faktora VIII dokáže, že získané výsledky sa signifikantne nelíšia.

Komerčné testovacie súpravy sa používajú podľa návodu výrobcu je dôležité, aby sa zistila vhodnosť použitej súpravy na stanovenie.

REAGENCIE

Reagencia pre koagulačný faktor obsahuje purifikované bielkoviny získané z ľudských alebo hovädzích zdrojov. Obsahuje faktor X, faktor IXa a aktivátor faktora VIII, ktorým je zvyčajne trombín. Tieto bielkoviny sú čiastočne purifikované, pokiaľ možno najmenej na 50 %,
a neobsahujú nečistoty, ktoré by zasahovali do aktivácie faktora VIII alebo faktora X. Faktor X sa nachádza v takom množstve, aby jeho konečná koncentrácia počas prvého stupňa stanovenia bola 10 nmol až 350 nmol na liter, podľa možnosti 15 nmol až 30 nmol na liter. Faktor IXa sa pripravuje aktiváciou purifikovaného faktora IX na faktor IXa s použitím faktora XIa
a nasledujúcou purifikáciou faktora IXa z reakčnej zmesi. Jeho konečná koncentrácia počas tvorby faktora Xa je menšia ako 30 % koncentrácie faktora X, zvyčajne 1 nmol až 100 nmol na liter, podľa možnosti 1 nmol až 10 nmol na liter. Trombín môže byť prítomný vo forme prekurzora – protrombínu za predpokladu, že jeho aktivácia v reagencii je dostatočne rýchla, aby v priebehu stanovenia umožňovala stálu a úplnú aktiváciu faktora VIII. Fosfolipidy sa môžu získať z prírodných zdrojov, napr. z hovädzieho mozgu alebo z miechy, prípadne zo sójového výťažku, alebo sa môžu pripraviť synteticky a musia obsahovať značný podiel, zvyčajne 15 % až 35 %, druhov fosfatidylserínu. Konečná koncentrácia fosfolipidov počas tvorby faktora Xa je 1 mol až 50 mol na liter, podľa možnosti 10 mol až 35 mol na liter. Reagencia obsahuje vápenaté ióny v takom množstve, aby ich konečná koncentrácia bola 5 mmol až 15 mmol na liter. Konečná tvorba faktora Xa prebieha v roztoku obsahujúcom najmenej 1 mg ľudského alebo hovädzieho albumínu na mililiter, ktorý je vhodne upravený na hodnotu pH v rozsahu 7,3 až 8,0. Zložky kompletnej reagencie sa zvyčajne rozdeľujú najmenej na dve reagencie, ktoré samy osebe nie sú schopné tvoriť faktor Xa. Po rozpustení sa môžu zmiešať za predpokladu, že sa v neprítomnosti faktora VIII nevytvorí podstatné množstvo faktora Xa. V konečnej inkubačnej zmesi musí byť faktor VIII jedinou zložkou limitujúcou rýchlosť reakcie.

Druhý stupeň spočíva v stanovení množstva faktora Xa vytvoreného v prvom stupni
s použitím chromogénneho substrátu špecifického pre faktor Xa. Zvyčajne sa používa derivát krátkeho peptidu z troch až piatich aminokyselín, ktoré sú pripojené k skupine chromofórov. Odštiepením tejto skupiny od peptidického substrátu sa posunie chromoformná aktivita do vlnovej dažky, ktorá umožňuje jeho spektrofotometrické stanovenie. Substrát sa zvyčajne rozpustí vo vode R a používa sa v konečnej koncentrácii 0,2 mmol až 2 mmol na liter. Substrát môže obsahovať aj vhodné inhibítory na zastavenie ďalšej tvorby faktora Xa a na potlačenie trombínovej aktivity a tým sa zlepšuje selektivita stanovenia faktora Xa.

POSTUP

Celý obsah ampuliek referenčného prípravku a skúšaného prípravku sa rozpustí pridaním vhodného množstva vody R; použije sa ihneď. Pridá sa dostatočné množstvo základnej riediacej reagencie, aby vznikli roztoky obsahujúce 0,5 I. U. až 2,0 I. U. faktora VIII na mililiter.

Základná riediaca reagencia pozostáva z plazmy od darcu postihnutého ťažkou hemofíliou A alebo zo synteticky pripravenej reagencie, ktorej výsledky sa signifikantne nelíšia od výsledkov získaných s použitím hemofilickej plazmy a toho istého referenčného a skúšaného prípravku. Základná riediaca reagencia musí byť dlhšie stabilná, než trvá stanovenie, najmenej 30 min pri teplote 20 °C, a musí sa použiť do 15 minút.

Pripravia sa riedenia referenčného a skúšaného prípravku s izotonickým nechelátovým tlmivým roztokom obsahujúcim 1 % ľudského alebo hovädzieho albumínu a trometamol alebo imidazol; upravené na hodnotu pH v rozsahu 7,3 až 8,0. Z každého prípravku sa pripravia najmenej tri oddelené a nezávislé riedenia, podľa možnosti dvojmo. Riedenia sa pripravia tak, aby konečná koncentrácia faktora VIII počas tvorby faktora Xa bola menšia ako 0,03 I. U. na mililiter, podľa možnosti menšia ako 0,01 I. U. na mililiter.

Pripraví sa kontrolný roztok, ktorý obsahuje všetky zložky okrem faktora VIII.

Všetky riedenia sa pripravujú v plastových skúmavkách a ihneď sa použijú.

1. Stupeň. Ku každému riedeniu referenčného prípravku a skúšaného prípravku sa pridá potrebný objem predhriatej koagulačnej reagencie (alebo zmes jednotlivých jej zložiek), premieša sa a inkubuje sa v plastových skúmavkách alebo v jamkách mikroplatničky pri teplote 37 °C. Koncentrácie jednotlivých zložiek počas tvorby faktora Xa musia byť také, aké sa opisujú pri reagenciách. Na aktiváciu faktora X je potrebný vhodný čas. Reakcia sa zvyčajne skončí pred dosiahnutím maximálnej koncentrácie faktora Xa, aby krivka predstavovala vyhovujúci lineárny vzťah dávka – odpoveď. Čas aktivácie sa volí tak, aby krivka tvorby faktora Xa v tomto čase bola lineárna. Vhodný čas aktivácie je zvyčajne 2 min až 5 min; odchýlky sú dovolené
v prípade, že sa tým dosiahne prijateľná linearita vzťahu dávka – odpoveď.

2. Stupeň. Aktivácia sa skončí pridaním predhriatej reagencie, ktorá obsahuje chromogénny substrát. Spektrofotometrickým meraním zmeny absorbancie pri vhodnej vlnovej dažke sa určí rýchlosť štiepenia substrátu, ktorá musí byť vo vzťahu ku koncentrácii faktora Xa lineárna. Rýchlosť štiepenia sa určí dvojakým spôsobom: kontinuálnym meraním absorbancie, ktoré umožní vypočítať počiatočnú rýchlosť štiepenia substrátu, alebo skončením hydrolýzy po vhodnom čase tak, že sa po pridaní vhodnej reagencie, napr. kyseliny octovej (500 g/l C₂H₄O₂) alebo citrátového roztoku s pH 3,0 (1 mol/l) zníži hodnota pH. Upraví sa čas hydrolýzy tak, aby bola krivka tvorby chromofóru v závislosti od času lineárna. Vhodný čas hydrolýzy je zvyčajne v rozpätí 3 min až 15 min; odchýlky sú dovolené v prípade, že sa tým dosiahne lepšia linearita vzťahu dávka – odpoveď.

Skontroluje sa platnosť stanovenia a vypočíta sa účinnosť skúšaného prípravku bežnými štatistickými metódami pre model pomeru smerníc (napr. 5.3 Štatistické vyhodnotenie výsledkov stanovenia biologickej účinnosti a skúšok).