CATEGORII DOCUMENTE |
Bulgara | Ceha slovaca | Croata | Engleza | Estona | Finlandeza | Franceza |
Germana | Italiana | Letona | Lituaniana | Maghiara | Olandeza | Poloneza |
Sarba | Slovena | Spaniola | Suedeza | Turca | Ucraineana |
DOCUMENTE SIMILARE |
|
TERMENI importanti pentru acest document |
|
Stanovenie
biologickej aktivity ¾udského koagulaèného faktora VIII sa zakladá na jeho
pôsobení ako kofaktora pri aktivácii faktora X aktivovaným faktorom IX (faktor
IXa) za prítomnosti iónov Ca2+ a fosfolipidov. Úèinnos prípravku
faktora VIII sa stanovuje porovnaním množstva tohto prípravku potrebného na
dosiahnutie urèitej rýchlosti tvorby faktora Xa
v skúšanej zmesi s množstvom medzinárodného štandardu alebo referenèného
prípravku kali-brovaného v medzinárodných jednotkách, ktoré je potrebné na
dosiahnutie tej istej rýchlosti tvorby faktora Xa. Skúšaná zmes obsahuje rôzne
látky, ktoré vstupujú do aktivácie faktora X.
Medzinárodnou jednotkou je aktivita faktora VIII v stanovenom množstve medzinárodného štandardu, ktorý pozostáva z lyofilizovaného koncentrátu ¾udského koagulaèného faktora VIII. Ekvivalenciu medzinárodného štandardu v medzinárodných jednotkách vyhlasuje Svetová zdravotnícka organizácia.
¼udský koagulaèný faktor VIII BRP je kalibrovaný v medzinárodných jednotkách porovnaním s medzinárodným štandardom.
Chromogénna metóda stanovenia spoèíva v dvoch po sebe nasledujúcich stupòoch, a to v
– aktivácii faktora X, ktorá závisí od faktora VIII v koagulaènej reagenènej zmesi zloženej
z jednotlivých purifikovaných zložiek,
– enzýmovom štiepení chromogénneho substrátu faktora Xa, prièom sa uvo¾òuje chromofór,
ktorého kvantita sa môže stanovi spektrofotometricky; za vhodných podmienok stanovenia je
lineárny vzah medzi rýchlosou tvorby faktora Xa a koncentráciou faktora VIII.
Princíp stanovenia je vyjadrený touto schémou:
(aktivovaný) faktor VIII
1. stupeò faktor X faktor Xa,
faktor IXa, fosfolipid, Ca2+
faktor Xa
2. stupeò chromogénny
substrát peptid +
chromofór.
Obidva
stupne používajú reagencie, ktoré sú komerène dostupné z rôznych zdrojov. Aj
keï sa zloženie jednotlivých reagencií môže meni, ich základné vlastnosti sa
opisujú ïalej
v špecifikácii. Odchýlky od tohto opisu sa povo¾ujú iba v prípade, ak sa pri
použití medzinárodného štandardu pre koncentrát ¾udského krvného koagulaèného
faktora VIII dokáže, že získané výsledky sa signifikantne nelíšia.
Komerèné testovacie súpravy sa používajú pod¾a návodu výrobcu je dôležité, aby sa zistila vhodnos použitej súpravy na stanovenie.
REAGENCIE
Reagencia
pre koagulaèný faktor obsahuje purifikované bielkoviny získané z ¾udských alebo
hovädzích zdrojov. Obsahuje faktor X, faktor IXa a aktivátor faktora VIII,
ktorým je zvyèajne trombín. Tieto bielkoviny sú èiastoène purifikované, pokia¾
možno najmenej na 50 %,
a neobsahujú neèistoty, ktoré by zasahovali do aktivácie faktora VIII alebo
faktora X. Faktor X sa nachádza v takom množstve, aby jeho koneèná koncentrácia
poèas prvého stupòa stanovenia bola 10 nmol až 350 nmol na liter, pod¾a
možnosti 15 nmol až 30 nmol na liter. Faktor IXa sa pripravuje aktiváciou
purifikovaného faktora IX na faktor IXa s použitím faktora XIa
a nasledujúcou purifikáciou faktora IXa z reakènej zmesi. Jeho koneèná koncentrácia
poèas tvorby faktora Xa je menšia ako 30 % koncentrácie faktora X, zvyèajne 1
nmol až 100 nmol na liter, pod¾a možnosti 1 nmol až 10 nmol na liter. Trombín
môže by prítomný vo forme prekurzora – protrombínu za predpokladu, že jeho aktivácia
v reagencii je dostatoène rýchla, aby v priebehu stanovenia umožòovala stálu a
úplnú aktiváciu faktora VIII. Fosfolipidy sa môžu získa z prírodných zdrojov,
napr. z hovädzieho mozgu alebo z miechy, prípadne zo sójového výažku, alebo sa
môžu pripravi synteticky a musia obsahova znaèný podiel, zvyèajne 15 % až 35
%, druhov fosfatidylserínu. Koneèná koncentrácia fosfolipidov poèas tvorby
faktora Xa je 1 mol až 50 mol na liter, pod¾a možnosti 10 mol až 35 mol na liter. Reagencia obsahuje vápenaté ióny
v takom množstve, aby ich koneèná koncentrácia bola 5 mmol až 15 mmol na liter.
Koneèná tvorba faktora Xa prebieha v roztoku obsahujúcom najmenej 1 mg ¾udského
alebo hovädzieho albumínu na mililiter, ktorý je vhodne upravený na hodnotu pH
v rozsahu 7,3 až 8,0. Zložky kompletnej reagencie sa zvyèajne rozde¾ujú
najmenej na dve reagencie, ktoré samy osebe nie sú schopné tvori faktor Xa. Po
rozpustení sa môžu zmieša za predpokladu, že sa v neprítomnosti faktora VIII
nevytvorí podstatné množstvo faktora Xa. V koneènej inkubaènej zmesi musí by
faktor VIII jedinou zložkou limitujúcou rýchlos reakcie.
Druhý
stupeò spoèíva v stanovení množstva faktora Xa vytvoreného v prvom stupni
s použitím chromogénneho substrátu špecifického pre faktor Xa. Zvyèajne sa
používa derivát krátkeho peptidu z troch až piatich aminokyselín, ktoré sú
pripojené k skupine chromofórov. Odštiepením tejto skupiny od peptidického
substrátu sa posunie chromoformná aktivita do vlnovej dažky, ktorá umožòuje
jeho spektrofotometrické stanovenie. Substrát sa zvyèajne rozpustí vo vode R a
používa sa v koneènej koncentrácii 0,2 mmol až 2 mmol na liter. Substrát môže
obsahova aj vhodné inhibítory na zastavenie ïalšej tvorby faktora Xa a na
potlaèenie trombínovej aktivity a tým sa zlepšuje selektivita stanovenia
faktora Xa.
POSTUP
Celý obsah ampuliek referenèného prípravku a skúšaného prípravku sa rozpustí pridaním vhodného množstva vody R; použije sa ihneï. Pridá sa dostatoèné množstvo základnej riediacej reagencie, aby vznikli roztoky obsahujúce 0,5 I. U. až 2,0 I. U. faktora VIII na mililiter.
Základná riediaca reagencia pozostáva z plazmy od darcu postihnutého ažkou hemofíliou A alebo zo synteticky pripravenej reagencie, ktorej výsledky sa signifikantne nelíšia od výsledkov získaných s použitím hemofilickej plazmy a toho istého referenèného a skúšaného prípravku. Základná riediaca reagencia musí by dlhšie stabilná, než trvá stanovenie, najmenej 30 min pri teplote 20 °C, a musí sa použi do 15 minút.
Pripravia sa riedenia referenèného a skúšaného prípravku s izotonickým nechelátovým tlmivým roztokom obsahujúcim 1 % ¾udského alebo hovädzieho albumínu a trometamol alebo imidazol; upravené na hodnotu pH v rozsahu 7,3 až 8,0. Z každého prípravku sa pripravia najmenej tri oddelené a nezávislé riedenia, pod¾a možnosti dvojmo. Riedenia sa pripravia tak, aby koneèná koncentrácia faktora VIII poèas tvorby faktora Xa bola menšia ako 0,03 I. U. na mililiter, pod¾a možnosti menšia ako 0,01 I. U. na mililiter.
Pripraví sa kontrolný roztok, ktorý obsahuje všetky zložky okrem faktora VIII.
Všetky riedenia sa pripravujú v plastových skúmavkách a ihneï sa použijú.
1.
Stupeò. Ku každému riedeniu
referenèného prípravku a skúšaného prípravku sa pridá potrebný objem
predhriatej koagulaènej reagencie (alebo zmes jednotlivých jej zložiek),
premieša sa a inkubuje sa v plastových skúmavkách alebo v jamkách
mikroplatnièky pri teplote 37 °C. Koncentrácie jednotlivých zložiek poèas
tvorby faktora Xa musia by také, aké sa opisujú pri reagenciách. Na aktiváciu
faktora X je potrebný vhodný èas. Reakcia sa zvyèajne skonèí pred dosiahnutím
maximálnej koncentrácie faktora Xa, aby krivka predstavovala vyhovujúci lineárny
vzah dávka – odpoveï. Èas aktivácie sa volí tak, aby krivka tvorby faktora Xa
v tomto èase bola lineárna. Vhodný èas aktivácie je zvyèajne 2 min až 5 min;
odchýlky sú dovolené
v prípade, že sa tým dosiahne prijate¾ná linearita vzahu dávka – odpoveï.
2. Stupeò. Aktivácia sa skonèí pridaním predhriatej reagencie, ktorá obsahuje chromogénny substrát. Spektrofotometrickým meraním zmeny absorbancie pri vhodnej vlnovej dažke sa urèí rýchlos štiepenia substrátu, ktorá musí by vo vzahu ku koncentrácii faktora Xa lineárna. Rýchlos štiepenia sa urèí dvojakým spôsobom: kontinuálnym meraním absorbancie, ktoré umožní vypoèíta poèiatoènú rýchlos štiepenia substrátu, alebo skonèením hydrolýzy po vhodnom èase tak, že sa po pridaní vhodnej reagencie, napr. kyseliny octovej (500 g/l C2H4O2) alebo citrátového roztoku s pH 3,0 (1 mol/l) zníži hodnota pH. Upraví sa èas hydrolýzy tak, aby bola krivka tvorby chromofóru v závislosti od èasu lineárna. Vhodný èas hydrolýzy je zvyèajne v rozpätí 3 min až 15 min; odchýlky sú dovolené v prípade, že sa tým dosiahne lepšia linearita vzahu dávka – odpoveï.
Skontroluje sa platnos stanovenia a vypoèíta sa úèinnos skúšaného prípravku bežnými štatistickými metódami pre model pomeru smerníc (napr. 5.3 Štatistické vyhodnotenie výsledkov stanovenia biologickej úèinnosti a skúšok).
Politica de confidentialitate | Termeni si conditii de utilizare |
Vizualizari: 731
Importanta:
Termeni si conditii de utilizare | Contact
© SCRIGROUP 2025 . All rights reserved