STANOVENIE BIOLOGICKEJ ÚČINNOSTI ĽUDSKÉHO KOAGULAČNÉHO FAKTORA IX

STANOVENIE  BIOLOGICKEJ ÚČINNOSTI ĽUDSKÉHO KOAGULAČNÉHO  FAKTORA IX

Účinnosť sa stanovuje porovnaním množstva skúšaného prípravku potrebného na skrátenie času zrážania skúšanej zmesi, ktorá obsahuje látky (okrem faktora IX) podieľajúce sa na zrážaní krvi, a množstva referenčného prípravku kalibrovaného v medzinárodných jednotkách, ktoré je potrebné na dosiahnutie toho istého účinku.

Medzinárodnou jednotkou je aktivita v stanovenom množstve medzinárodného štandardu, ktorý pozostáva z lyofilizovaného koncentrátu ľudského koagulačného faktora IX. Ekvivalenciu medzinárodného štandardu v medzinárodných jednotkách vyhlasuje Svetová zdravotnícka organizácia.

Skúšaný prípravok a referenčný prípravok sa oddelene rozpustia podľa údajov na štítku
a ihneď sa použijú. Ak skúšaný prípravok obsahuje heparín, určí sa jeho množstvo (2.7.12)
a neutralizuje sa pridaním protamíniumsulfátu R (10 µg protamíniumsulfátu neutralizuje 1 I. U. heparínu). Obidva prípravky sa zriedia potrebným množstvom tlmivého imidazolového roztoku s pH 7,3 R tak, aby vznikli roztoky obsahujúce 0,5 I. U. až 2,0 I. U. na mililiter. Pripravia sa dvojnásobné riedenia 1:10 až 1:80 s použitím zmesi zloženej z 1 objemu roztoku citrónanu disodného R 38 g/l a 5 objemov tlmivého imidazolového roztoku s pH 7,3 R. Riedenia sa musia merať presne a ihneď sa musia použiť.

Použijú sa napr. inkubačné skúmavky, ktoré sa udržujú vo vodnom kúpeli pri teplote 37 °C. Do každej skúmavky sa prenesie 0,1 ml plazmy (substrátu) R2 a 0,1 ml jedného z riedení referenčného prípravku alebo skúšaného prípravku. Do každej skúmavky sa pridá 0,1 ml vhodného riedenia cefalínového činidla R alebo krvných doštičiek R a 0,1 ml suspenzie 0,5 g kaolínu ľahkého R v 100 ml roztoku chloridu sodného R 9 g/l. Skúmavky sa nechajú asi 10 min stáť a pravidelne sa nakláňajú. Do každej skúmavky sa pridá 0,1 ml roztoku chloridu vápenatého R 7,4 g/l. Stopkami sa meria čas zrážania, t. j. interval medzi pridaním chloridu vápenatého
a prvými známkami tvorby fibrínu, ktorý možno pozorovať vizuálne alebo vhodným prístrojom. Vypočíta sa účinnosť bežnými štatistickými metódami (napr. 5.3. Štatistické vyhodnotenie výsledkov stanovenia biologickej účinnosti a skúšok).

Na zaručenie toho, že plazma (substrát) R2 neobsahuje významné množstvo faktora IX, urobí sa slepý pokus, pri ktorom sa skúšaný prípravok nahradí zodpovedajúcim objemom zmesi 1 objemu roztoku citrónanu disodného R 38 g/l a 5 objemov tlmivého imidazolového roztoku
s pH 7,3 R. Skúška je platná len vtedy, ak čas zrážania v slepom pokuse je 100 s až 200 s.