STANOVENIE BIOLOGICKEJ ÚÈINNOSTI ¼UDSKÉHO KOAGULAÈNÉHO FAKTORA IX

STANOVENIE  BIOLOGICKEJ ÚÈINNOSTI ¼UDSKÉHO KOAGULAÈNÉHO  FAKTORA IX

Úèinnos sa stanovuje porovnaním množstva skúšaného prípravku potrebného na skrátenie èasu zrážania skúšanej zmesi, ktorá obsahuje látky (okrem faktora IX) podie¾ajúce sa na zrážaní krvi, a množstva referenèného prípravku kalibrovaného v medzinárodných jednotkách, ktoré je potrebné na dosiahnutie toho istého úèinku.

Medzinárodnou jednotkou je aktivita v stanovenom množstve medzinárodného štandardu, ktorý pozostáva z lyofilizovaného koncentrátu ¾udského koagulaèného faktora IX. Ekvivalenciu medzinárodného štandardu v medzinárodných jednotkách vyhlasuje Svetová zdravotnícka organizácia.

Skúšaný prípravok a referenèný prípravok sa oddelene rozpustia pod¾a údajov na štítku
a ihneï sa použijú. Ak skúšaný prípravok obsahuje heparín, urèí sa jeho množstvo (2.7.12)
a neutralizuje sa pridaním protamíniumsulfátu R (10 µg protamíniumsulfátu neutralizuje 1 I. U. heparínu). Obidva prípravky sa zriedia potrebným množstvom tlmivého imidazolového roztoku s pH 7,3 R tak, aby vznikli roztoky obsahujúce 0,5 I. U. až 2,0 I. U. na mililiter. Pripravia sa dvojnásobné riedenia 1:10 až 1:80 s použitím zmesi zloženej z 1 objemu roztoku citrónanu disodného R 38 g/l a 5 objemov tlmivého imidazolového roztoku s pH 7,3 R. Riedenia sa musia mera presne a ihneï sa musia použi.

Použijú sa napr. inkubaèné skúmavky, ktoré sa udržujú vo vodnom kúpeli pri teplote 37 °C. Do každej skúmavky sa prenesie 0,1 ml plazmy (substrátu) R2 a 0,1 ml jedného z riedení referenèného prípravku alebo skúšaného prípravku. Do každej skúmavky sa pridá 0,1 ml vhodného riedenia cefalínového èinidla R alebo krvných doštièiek R a 0,1 ml suspenzie 0,5 g kaolínu ¾ahkého R v 100 ml roztoku chloridu sodného R 9 g/l. Skúmavky sa nechajú asi 10 min stᝠa pravidelne sa nakláòajú. Do každej skúmavky sa pridá 0,1 ml roztoku chloridu vápenatého R 7,4 g/l. Stopkami sa meria èas zrážania, t. j. interval medzi pridaním chloridu vápenatého
a prvými známkami tvorby fibrínu, ktorý možno pozorova vizuálne alebo vhodným prístrojom. Vypoèíta sa úèinnos bežnými štatistickými metódami (napr. 5.3. Štatistické vyhodnotenie výsledkov stanovenia biologickej úèinnosti a skúšok).

Na zaruèenie toho, že plazma (substrát) R2 neobsahuje významné množstvo faktora IX, urobí sa slepý pokus, pri ktorom sa skúšaný prípravok nahradí zodpovedajúcim objemom zmesi 1 objemu roztoku citrónanu disodného R 38 g/l a 5 objemov tlmivého imidazolového roztoku
s pH 7,3 R. Skúška je platná len vtedy, ak èas zrážania v slepom pokuse je 100 s až 200 s.