Biochemijos laboratoriniai darbai - Glikolizės tyrimas

Biochemijos laboratoriniai darbai

Glikolizės tyrimas

Darbo tikslas:

Ištirti glikolizės proces¹ raumens audinyje.

Nustatyti slopiklio MJAR poveikį glikolizės procesui.

Apskaičiuoti gliukozės skaldymo bei fruktozės ir pieno rūgšties susidarymo greičius.

Raumenų ekstrakto paruošimas

Tirpalai

1. Buferis (pH 7,5), kuriame yra 5×10^-2 M KH₂PO₄   ir 1×10^-3 MgSO₄ (ruošiama 40 ml)

Darbo eiga

1. 5,0 g raumenų įdedama į porcelianinź lėkštutź, užpilamas nedidelis kiekis smėlio ir keli ml buferinio tirpalo. Raumenys sutrinami iki homogeniškos masės, užpilama 5 tūriais (36 ml) buferio ir pastoviai maišant 30 min. inkubuojama 0⁰C temperatūroje. Taip grubiai veikiant audinius, yra sudaromos l¹stelės, organelės.
2. Suardytų raumenų masė pašalinama centrifuguojant 10 min. 3000×g.
3. Supernatantas filtruojamas pro keliasluoksnź marlź ir gautas ekstraktas naudojamas tolesniam darbui.

BALTYMO KIEKIO NUSTATYMAS BREDFORDO METODU

REAGENTAI:

1. 0,5 mg/ml žmogaus serumo albuminas (ŽSA);
2. 0,15 M NaCl tirpalas;
3. Kumasi briliantinio mėlio G250 dažiklio tirpalas.

DARBO EIGA:

1. Į 8 mėgintuvėlius įpilama atitinkamai po 5, 10, 15, 20 μl žmogaus serumo albumino tirpalo ir į visus įpilama iki 100 μl 0,15 M NaCl tirpalo, į kontrolinį mėgintuvėlį įpilama tik 100 μl 0,15 M NaCl tirpalo;
2. Į visus mėgintuvėlius įpilama po 1 ml Kumasi briliantinio mėlio G250 tirpalo ir sumaišoma;
3. Laikoma 2 min. kambario temperatūroje;
4. Spektrofotometru pamatuojamas optinis tankis ties λ = 595 nm ir braižoma kalibravimo kreivė;
5. Imama 50 μl nežinomos koncentracijos baltymo ir įpilama iki 100 μl 0,15 M NaCl tirpalo, 1 ml Kumasi briliantinio mėlio G250 tirpalo ir sumaišoma. Laikoma 2 min. kambario temperatūroje. Spektrofotometru pamatuojamas optinis tankis, baltymo kiekis nustatomas iš kalibravimo kreivės.

1 lentelė. Optinio tankio priklausomybė nuo albumino koncentracijos.

1 pav. Optinio tankio priklausomybė nuo albumino koncentracijos.

2 lentelė. Optinio tankio priklausomybė nuo baltymo kiekio frakcijos

BANDYMAS SU GLIKOGENU

Tirpalai

1. glikogeno tirpalas (glikogenas tirpinamas 1 buferyje), ruošiama 4,1 ml.

2. 3×10^-2 M monojodacto rūgšties tirpalas (ruošiama 2 ml).

3. trichloracto rūgšties tirpalas (ruošiama 30 ml)

Darbo eiga

Į 8 mėgintuvėlius stovinčius lede supilame 1 lentelėje nurodytus kiekius glikogeno, ekstrakto, monojodacto rūgšties ir trichloracto rūgšties. Inkubuojami 30 min. 37⁰C temperatūroje. Kontroliniuose mėginiuose tricloracto rūgštį pripilame pradžioje iki ekstrakto pripylimo. Tiriant glikolizės poveikį į atitinkamus mėgintuvėlius pripilame monojodacto rūgšties, kuri slopina glicerolio aldehido fosfato dehidrogenazės aktyvum¹.

3 lentelė. Mėginių sudėtis.

Po inkubacijos baltymai nusodinami pridedant 3 ml 12% trichloracto rūgšties. Baltymų nuosėdos centrifuguojamos ir filtrate nustatomas gliukozės, fruktozės bei pieno rūgšties kiekis. Gliukozės kiekis nustatomas kolorimetriniu metodu su antroniniu reagentu, fruktozės kiekis kolorimetriniu metodu su rezorcinu, o pieno rūgšties kiekis nustatomas fermentiniu metodu su laktato dehidrogenaze. Iš substrato ir produkto kiekio pokyčio galima sprźsti apie glikolizės intensyvum¹. Baltymo koncentracija pradiniame baltyminiame ekstrakte nustatoma Bredfordo metodu. Apskaičiuojame gliukozės skaidymo, fruktozės bei pieno rūgšties susidarymo greičius (μmol/min. mg baltymo). Gautus duomenis surašome į 9 lentelź.

GLIKOGENO NUSTATYMAS

Metodas remiasi tuo, kad angliavandeniai, paveikti sieros rūgštimi, virsta furfurolo dariniais, kurie su antronu sudaro spalvotus junginius. Iš spalvos intensyvumo galima sprźsti apie angliavandenių kiekį.

Tirpalai

1. Antrono reagentas (antronas ištirpinamas 30 ml 95% sieros rūgšties).
2. Standartinis gliukozės tirpalas (5μg/ml gliukozės).
3. 30% KOH tirpalas

Darbo eiga

1. Į mėgintuvėlius, kuriuose yra po 1,5 ml 30% KOH, pridedama po 0,5 ml filtrato. Mėgintuvėliai 20 min. kaitinami verdančio vandens vonioje. Po to atšaldomi iki kambario temperatūros.
2. Tirpalai praskiedžiami 25 kartus.
3. Į mėgintuvėlius, stovinčius lede, įpilama po 1,25 ml tiriamojo tirpalo, kuriame yra nuo 3 iki 30 μg/ml gliukozės.
4. Paruošiamas 1,25 ml standartinio gliukozės tirpalo (5 μg ml vandens).
5. Paruošiamas kontrolinis tirpalas 1,25 ml vandens.
6. Į visus mėgintuvėlius įpilama po 2,5 ml šviežiai pagaminto antrono reagento. Antroninis reagentas pilamas lėtai, mėgintuvėlį pastoviai purtant ir šaldant ledo vonioje.
7. Supylus antron¹, mėgintuvėliai kaitinami 10 min. verdančio vandens vonioje, po to staigiai atšaldomi lediniame vandenyje. Šiose s¹lygose susidaro žalsvas su silpnai melsvu atspalviu tirpalas.
8. Tirpalas kolorimetruojamas esant raudonam spalvos filtrui (λ = 590 nm).
9. Gliukozės koncentracija (c) apskaičiuojama pagal formulź:

c = D₁/D₂ c_x,

kur D₁ – tiriamojo tirpalo optinis tankis, D₂ – standartinio gliukozės tirpalo optinis tankis, c_x –   standartinio gliukozės tirpalo koncentracija.

10. Rezultatai surašomi į 4 lentelź.

4 lentelė. Gliukozės koncentracija mėginiuose

; čia A_st=0,09; c_st=0,005 mg/ml.

* trichloracto rūgštis pripilama prieš pilant ekstrakt¹ (kontroliniai mėginiai); **M_gliukozės=180 g/mol.

FRUKTOZĖS NUSTATYMAS

Šildant tirpal¹ su koncentruota HCl, susidaro oksimetilfurfurolas, kuriam reaguojant su rezorcinu, atsiranda rožinė spalva. Ši Selivanovo pasiūlyta spalvinė reakcija taikoma tiek kiekybiniam tiek kokybiniam fruktozės bei jos fosfatų nustatymui.

Tirpalai

1. 1% rezorcino tirpalas. Rezorcinas tirpinamas 95% etilo alkoholyje (ruošiama 30 ml). m(rezorcino) = 0,3 g.
2. 30% HCl tirpalas.
3. Standartinis fruktozės tirpalas (0,5 mg fruktozės/1 ml 1 N HCl).

Darbo eiga

1. Kalibracinei kreivei gauti imama 8 mėgintuvėliai, jie suskirstomi poromis ir į kiekvien¹ por¹ pripilama po 0,1 ml; po 0,2 ml: po 0,3 ml: po 0,5 ml fruktozės tirpalo standarto ir vandens iki 1 ml.
2. Į kiekvien¹ įpilama po 1 ml 1% rezorcino tirpalo ir 3,0 ml 30% HCl.
3. Kontroliniam mėginiui vietoj fruktozės imama 1 ml vandens.
4. Tirpalai kruopščiai sumaišomi ir laikomi 8 min. 80⁰C vandens vonioje. Būtina sekti, kad tirpalai visuose mėgintuvėliuose kaistų vienodai, nes netolygus įšilimas gali iškreipti rezultatus.
5. Mėginiai išimami iš termostato, atšaldomi vandenyje ir kolorimetruojami naudojant žali¹ filtr¹ (λ = 490 nm).
6. Nubraižomas optinio tankio priklausomybės nuo fruktozės koncentracijos grafikas.
7. Nustatant fruktozės koncentracij¹ baltyminiuose filtratuose į mėgintuvėlį įpilama 1 ml tiriamojo tirpalo, pripilama 1 ml rezorcino ir 3 ml HCl. Kaitinama 8 min. 80⁰C temperatūroje ir kolorimetruojama.
8. Iš kalibracinės kreivės apskaičiuojama fruktozės koncentracija tiriamuosiuose tirpaluose.
9. Duomenys surašomi į lentelź.

5 lentelė. Fruktozės koncentracija mėginiuose

PIENO RŪGŠTIES NUSTATYMAS

Pieno rūgštis, veikiant fermentui laktato dehidrogenazei oksiduojama iki piruvo rūgšties. Oksiduojantis piruvo rūgščiai, NAD⁺ redukuojamas iki NADH, kurio koncentracij¹ galime išmatuoti spektrofotometriškai. Oksiduojantis vienam moliui pieno rūgšties, susidaro vienas molis NADH. Matuojant susidariusio NADH optinį tankį 340 nm bangos ilgyje ir žinant NADH molinės ekstinkcijos koeficient¹ galime apskaičiuoti susidariusio pieno rūgšties kiekį. Laktato dehidrogenazės katalizuojamos reakcijos pusiausvyra yra pastumta į pieno rūgšties susidarymo pusź. Tačiau esant terpėje hidrazino arba semikarbazido, su kuriais piruvo rūgštis sudaro hidrazinus arba semikarbazonus cheminės reakcijos pusiausvyra yra pastumiama į piruvo rūgšties susidarymo pusź ir galime kiekybiškai išmatuoti laktato kiekį.

Tirpalai

1. Glicino – hidrazino buferis, pH 9,0 (0,1 M glicino tirpalas, kuriame ištirpinta 0,1 M hidrazino). Ruošiama 100 ml
2. NAD tirpalas (1 mg/ml), pH 6,0 (ruošiama 5 ml).
3. Laktato dehidrogenazė (1 mg/ml).

Darbo eiga

Paruošiami tirpalai pagal 7 lentelź.

6 lentelė. Mėginių sudėtis.

Tirpalai sumaišomi ir termostatuojami 60 min. 25⁰C temperatūroje. Po inkubacijos su spektrofotometru išmatuojame tiriamo mėginio optinį tankį. Pieno rūgšties kiekį mėgintuvėlyje apskaičiuojame pagal formulź:

M = (D/6,22),

kur M – nustatomos medžiagos kiekis μmol/ml, D – tiriamojo mėginio optinis tankis, V – tiriamo mėginio tūris, 6,22 – optinis tankis tirpalo, kuriame yra 1 μmol/ml NADH.

8 lentelė. Pieno rugšties kiekis

REZULTATAI:

9 lentelė. Gliukozės, fruktozės ir pieno rūgšties kitimas glikolizės tyrimo eigoje.

IŠVADOS:

1. Trichloracto rūgštis yra glikolizės slopiklis.
2. Gliukozės   kiekis stipriai padidėjo pridėjus MJAR.
3. MJAR nedaro įtakos gliukozės virtimui į fruktozź.
4. Neaišku ar MJAR turi įtakos pieno rūgšties kiekio kitimui, nes kito labai nežymiai.

LITERATŪRA:

1. Laboratorinio darbo aprašas.
2. J. Kadziauskas. Biochemijos pagrindai. Vilnius 2008.
3. Lida Bagdonienė, Vida Bendikienė ir kt. Biochemijos laboratoriniai darbai. Vilnius 2006.