SEMANTIDŲ PAVYZDŽIAI

SEMANTIDŲ PAVYZDŽIAI

Semantidai – populiarūs taksonominės informacijos šaltiniai, atstovaujantys arba pirminę genetinę informaciją DNR, arba antrinę – RNR, arba tretinę – baltymus ir jų vedinius. Manoma, jog tiriant pirminę genetinę medžiagą, gaunami fundamentalesni duomenys, turėtų būti daugiau tiesioginė ir nesudėtinga jų taksonominė interpretacija.

Vis tik po fenolinių junginių taksonomijoje dažniausiai panaudojami baltymai. Rezultatai, gauti iš baltymų taksonomijos, skirstomi į tris grupes, atitinkančias tris naudojamus metodus: SEROLOGIJĄ, ELEKTROFOREZĘ, AMINORŪGŠČIŲ sekvenavimą.

Serologijos technika remiasi imunologinėmis žinduolių reakcijomis, paveikus juos svetimais baltymais. Augalo, gyvūno ar mikrobo ekstraktas A, turintis baltymų arba ANTIGENŲ įšvirkščiamas žinduoliui, dažniausiai triušiui. Jis suformuos baltyminius ANTIKŪNIUS, kiekvieną specifinį antigenui, galinčius jį koaguliuoti. Šie antikūniai gali būti ekstraguojami iš gyvūnų kraujo kaip ANTISERUMAI. Nors pastarasis koaguliuos vėlesnes antigenų atsargas, jis gali būti panaudotas kaip standartinis testas kitų augalų ekstraktams B, C, D ir kitiems. Jų koaguliacijos kiekis gali būti panaudotas kaip panašumo matas augalų ekstraktui A, o tuo pačiu rūšių B, C, D ir kitų panašumui rūšiai A.

Dabar individuali antigeno-antikūnio reakcija, sudarydama bendrą nusėdimą, gali būti atskirai užrašyta. Tai atliekama dviem būdais. Leidžiant antigeninei medžiagai ir antiserumui difunduoti vienam į kitą gelyje. Tada skirtingi baltymai keliauja nevienodu greičiu, todėl skirtingose gelio vietose atsiranda skirtingos reakcijos. Antras būdas, pirma gelyje elektroforezės būdu atskiriami vienos dimensijos antigenai, po to jie difunduoja serumo lovelyje. LENTELĖ IR FIG.43.

Pirmojo DVIGUBOS DIFUZIJOS SEROLOGIJOS metodas pranašesnis už IMUNO-ELEKTROFOREZĖS metodą tuo, kad kelių skirtingų taksonų antigenų mišinių reakcijų veržlumas konkrečiam serumui gali būti stebimas tuo pačiu metu tame pačiame gelyje, bet sudedamųjų reakcijų atskyrimas geresnis antruoju metodu. Kitas patobulinimas, žinomas kaip ABSORBCIJA, apima bendrą antikūnių pašalinimą antiserume taip, kad likusius lengvai galima palyginti su kitų taksonų antikūniais.

Paprastai serologijos metodo tikslas nėra baltymų IDENTIFIKACIJA. Šiuo metodu palyginami nežinomi baltymai, kurių pagrindinė funkcija – maisto atsargų, struktūrinė,enziminė ir kitokia – gali būti nežinoma. Tada aiškinant rezultatų reikšmę, gali kilti nepatogumų. Kartais stengiamasi tiksliai identifikuoti, vykdant lygiagrečius baltymų elektroforetinius atskyrimus panašiuose mėginiuose.

Serologiniai tyrimai atlikti lapų, vaisių, sėklų, gumbų, sporų ir žiedadulkių audiniams. Manyta, kad skirtingos augalo dalys dėka skirtingų enzimų turi nevienodus baltymus. Maisto atsargomis gali būti skirtingi baltymai. Vis tiktai kai kurie baltymai yra visose augalų dalyse. Daugiausia dėmesio buvo skiriama tokiems organams, kaip sėklos ir stiebagumbiai, kur baltymai – maisto atsargos.

Įrodyta, kad serologija naudinga visų rangų nuo šeimos iki rūšies sistematikai. Šiuo metodu ištirti Solanum genties, turinčių stiebagumbius, ryšiai tarp protėvinių ir kultivuojamų rūšių. Taikant serologinį metodą, surinkta daug vertingų duomenų apie Ranunculaceae ir Berberidaceae; Cornaceae ir Nyssacaceae taksonus. Serologiniais ryšiais nustatyta Ranunculaceae klasifikacija tribos ir genties range patvirtino klasikinį įrodymą, ypač paremtą chromosomų tyrimais. Žemesniu rangu tirti vienmečių Bromus ryšiai, naudojant imuno-elektroforetinius duomenis kartu su morfologiniais, citologiniais, citogenetiniais. Jų dėka naujai apžvelgtos rūšies problemos, diploidų - tetraploidų ir hibridų ryšiai. Anksčiau vadinamo Bromus secalinus varieteto citologinis ir serologinis atskirumas leido jį pripažinti kaip naują rūšį B.pseudosecalinus.

Elektroforetinis baltymų atskyrimas remiasi jų amfoterinėmis savybėmis. Veikiant teigiamais arba neigiamais krūviais įvairiu mastu pagal pH vidurkį, jie keliauja per gelį skirtingais greičiais išilgai įtampos gradiento. Paprastai ši procedūra atliekama akrilamido gelio kolonėlėje, sudarytoje iš dviejų pertrauktinių gelių (terminas DISKINĖ ELEKTROFOREZĖ). Didesnio dydžio porų gelis patalpintas virš mažesnio dydžio porų gelio. Baltymų atskyrimas priklauso nuo gelio porų rėčio efekto, dalinis atskyrimasvyksta stambesnių porų zonoje, o visiškas atskyrimas į aiškias grupes – smulkių porų zonoje. Praėjus atskyrimo laikui, srovė išjungiama ir baltymai aptinkami dažais. Šiam tikslui gali būti panaudoti bendri baltymų dažai. Jeigu studijuojamas ypatingas enzimas – reikia specifinio dažo.

Alternatyvi technika – IZOELEKTRINIS FOKUSAVIMAS, kur vieno dydžio porų gelis, išdėstytas pagal pH gradientą nuo 3 iki 10, kai pritaikomas tiriamas ekstraktas ir srovė išjungiama, tada baltymai “atsigula” toje gradiento padėtyje, kuri sutampa su izoelektriniu tašku. Labai patogu, nes baltymai iš eilės gelyje gali būti atskirti lėkštelėje antrinėje dimensijoje standartine diskine elektroforeze, besiremiančia daugiau molekuliniu dydžiu, nei elektriniu krūviu. Naudojant dviejų dimensijų metodą, iš vieno organizmo buvo išskirta virš 1000 baltymų.

Taksonomijoje elektroforezės rezultatai pritaikomi naudingiausiai genties ir žemesniame ranguose. Kuo daugiau darbų buvo skirta maisto atsargoms - baltymams, pavyzdžiui, pupinių, miglinių, tuo daugiau buvo tiriami enzimai. Elektroforezė ne tik gali atskirti giminingus atsargų baltymus bei enzimus, bet taip pat ALOZIMUS ir IZOZIMUS, kurie skiriasi pagal formą.

ALOZIMAI – SKIRTINGOS ENZIMO FORMOS, KUR SUDEDAMIEJI POLIPEPTIDAI APIBRĖŽTI SKIRTINGAIS ALELIAIS VIENAME LOKUSE. Alelis –vieno ir to paties geno skirtingos formos, išsidėsčiusios vienoduose ploteliuose – lokusuose homologinėse arba porinėse chromosomose. Alozimas – enzimas, koduotas skirtinguose aleliuose, bet viename lokuse.

IZOZIMAI arba IZOENZIMAI – SKIRTINGOS FORMOS, KUR POLIPEPTIDAI APIBRĖŽIAMI DAUGIAU NEI VIENU LOKUSU. Izozymas – enzimo produktas, koduotas viename alelyje, bet skirtinguose lokusuose.???

Alozimai pasirodo yra dažnesni, bet literatūroje nagrinėjami kartu su izozimais. Juos galima pamatyti zimogramose. NUOTRAUKA Brūkšnys – enzimai alelyje. Yra heteromerinių brūkšnių, rodančių, kad enzimas yra keliuose lokusuose. Manoma, kad alozimai gali būti atskirti pagal jų skirtingą elektroforetinį mobilumą ir tiksliomis sąlygomis, reikalingomis jų optimaliam katalitiniam aktyvumui. Jie galėtų veikti, skatinami augalo, jo skirtinguose organuose, skirtingose augimo stadijose arba skirtingose augavietėse. Enzimų polimorfizmas dažnai matomas žemesniame, nei rūšies range, ypač išnagrinėjus daugiau nei vieno enzimo sandarą. Izozimai gali būti naudojami, atpažįstant net individualius klonus t.y. organizmo palikuonis, turinčius identiškų. Todėl jie naudingi ne tik taksonomistams, bet ir ekologams bei populiacijų biologams. Daugeliu atvejų vidinis populiacijų kintamumas pagal izozimus nelydimas morfologinės diferianciacijos, pavyzdžiui, Conocephalum conicum rasės Lenkijoje.

Vertingiausi elektroforezės rezultatai buvo gauti, tiriant miglinių, giminingų kviečiams, atstovų genomo sandarą ir tetraploidų bei heksaploidų protėvius. Tiriant atsarginius baltymus, padaryta išvada, kad heksaploidas Triticum aestivum iš tikrųjų turi diploidinių rūšių baltymų sumą. Tiriant enzimus, atrasta, kad tam tikri poliploidai turi visų savo protėvių enzimus plius keletą naujų enzimų. Tikriausiai nauji hibrido enzimai – oligomerai inkorporuoja polipeptidus naujose genomų kombinacijose poliploiduose.

Aminorūgščių sekvenavimas – šiuolaikiškesnis metodas, kurio tikslas yra identifikuoti grynus baltymus iki atomų. Dabar įmanoma nuo polipeptidinės grandinės atlaužti iš eilės po vieną amino rūgštį. Kiekviena amino rūgštis iš eilės identifikuojama chromatografiškai. Tokiu būdu palaipsniui atstatoma aminorūgščių seka. Pradžioje reikia sulaužyti polipeptidinę grandinę į mažesnius fragmentus. Šie maži vienetai atskiriami chromatografija arba elektroforeze (“pirštų atspaudų” (fingerprintig) metodas). Net tokie apytiksliai rezultatai taksonomiškai vertingi. Aminorūgščių sekvenavimo metodas tiria vieno homologinio baltymo kintamumą pagal tikslią aminorūgščių seką, pavyzdžiui, tikriausiai vienas monofiletinės kilmės, esantis eilėje organizmų. Faktas: ypatingas baltymas neturi vienos nekintamos struktūros, bet didelė jo dalis gali kisti, nesikeičiant jo esminei funkcijai. Citochromą c sudaro apytikriai 113 aminorūgščių. Įvairiose augalų rūšyse apie 79 šio baltymo aminorūgštis kinta, bet vienos iš likusių 34 amino rūgščių pakitimas sugriauna molekulės funkcionavimą. Citochromas c – ideali molekulė, nes santykinai maža, nekintanti, spalvota ir aptinkama aerobiniuose organizmuose. Jo sekos nustatytos mažiausiai 25 induočių augalų rūšims, be to dumbliams, gyvūnams, grybams ir bakterijoms. FIGURA KETURI.PENKI

Yra keletas anomalijų, pavyzdžiui, aminorūgščių skirtumų SKAIČIUS tarp kukurūzų ir kviečių baltymų didesnis, nei tarp kukurūzų ir kai kurių dviskilčių. Netgi viena anomalija rodo, kad baltymų struktūros matas nėra patikimiausias giminystės rodiklis. Praktiškai šios problemos padidinamos, nes absoliučiai visi aminorūgščių sekvenavimo darbai daugiau stengėsi atskleisti filogeniją, nei padėti sukuriant klasifikacijas. Reikia manyti, kad molekulės evoliucija įvyko dėl minimalaus mutacijų skaičiaus (PARSIMONIJOS PRINCIPAS) t.y. kad nėra konvergentiškos evoliucijos arba grįžtamosios mutacijos, kad skirtingos padėtys molekulėje yra vienodai atsakingos už pavadavimą. Kol kas neįmanoma patvirtinti šių samprotavimų. Tos pačios problemos egzistuoja, atsižvelgiant į serologinį darbą, kadangi dauguma tokių darbų panaudota, kuriant filogenetinius kelius. Skirtingi visų rūšių požymiai, taip pat ir baltymai, klasifikuojant turėtų būti panaudoti skirtingais greičiais ir skirtingose kryptyse taip, kad taksonomistui nebūtų sunku išmokti, jog skirtingi baltymai, gauti elektroforeze ir sekvenavimu, arba skirtingi organai – serologija – duoda skirtingas giminystės indikacijas. Taigi būtina tirti baltymų įvairovę, geriausiai įvairiais metodais. Nepasitikėti vienintelio baltymo seka.

Siekiant tyrimams naudoti pirminę genetinę medžiagą, taikytas DNR HIBRIDIZACIJOS metodas. Jo esmė tokia: ekstrahuota vieno organizmo DNR, laikoma paversta į vienos vijos polinukleotidinę grandinę. Sumaišius du taksonus –vieno taksono dvigubos vijos, o kito taksono vienos vijos DNR – iš naujo susijungusios grandinės kiekis su įprasta kito taksono DNR, paimamas kaip nukleotidų sekos panašumo matas.

Tiriant mikroorganizmus, grybus, kerpes šiuo būdu, gauti perspektyvūs rezultatai. Bet atsirado daug praktinių problemų. Bėda, kad nežinoma, kurios DNR dalys yra prisijungiančios. Ne iki galo suprasti citogenetinės duplikacijos, inversijos, translokacijos reiškinio efektai.

RNR buvo tiriama DNRRNR hibridizacijos metodu. Čia vieno organizmo DNR ir kito organizmo RNR (dažniausiai ribosominės RNR) frakcijų susijungimo kiekis imamas kaip giminingumo matas. Šiuo metodu tirtas Caryophyllales taksonas. Nustatyta, kad Caryophyllaceae šeima, turinti antocianinus vietoj betalainų, gimininga betalainą turinčioms šeimoms, bet ne tiek gimininga, kaip betalainą turinčios šeimos tarpusavyje.

Iš tikrųjų nukleotidų sekos suteikia daug taksonominės informacijos. Sukūrus PGR (PCR) techniką 1987 metais, atsirado galimybė nuodugniau tirti DNR seką. Šie sekų duomenys, apdoroti taksometriniais ir kladistiniais metodais, geriau padeda suprasti augalų filogeniją. DNR tiriama vadinamais DNR sekvenavimo metodais, primenančiais aminorūgščių sekvenavimo metodų principą. Augalams tiriamos rbcL, 18S ir 26S rDNR dalys. Tada palyginami skirtingų taksonų DNR fragmentai. Gautus molekulinius duomenis mokslininkai vertina kaip mažiau subjektyvius, nors ir čia galima suklysti. Naudojant šiuo metodu gautus molekulinius duomenis kartu su morfologiniais duomenimis ir kita informacija, buvo patikslinta augalų induočių filogenija. J.E.Doyle, 1998.

Augalams daugiau tinka PCR – RFLP ir RAPD metodai. Šie metodai labai greitai keičiasi priešingai elektroforezės metodams: keičiasi tik detalės, ne metodo principas.

PCR - RFLP – restriction fragment length polymorphism arba CAPS – cleaved amplified polymorphic sequences. PGR metodu padauginama ypatinga chloroplasto DNR dalis ir iškerpama enzimais restriktazėmis. Šis metodas patikimesnis, nei RAPD. Jis remiasi restriktazių veikla, kurios atpažįsta ypatingą DNR fragmentą ir nukerpa. Atsiranda DNR fragmentai su lygiais ir nelygiais galais. DNR fragmentų nukleotidų seka nustatoma enzimais ir jie palyginami. Duomenis galima apdoroti kladistikos metodais. Galima tirti herbariumų medžiagą, tinka spręsti rūšių komplekso problemas.

RAPD –random amplified Polymorphic Sequences. Turint daug PGR produktų, šiam metodui konstruojamos labai trumpos sutartinės DNR sekos. Tai gali būti trumpi ar ilgi fragmentai. Naudojamas pradmuo (primer), prisikabinantis prie skirtingų DNR vijų. Taip tikrinama 10 pradmenų. Pradedantieji naudoja 100 pradmenų, kol darbui atsirenka 1-2 tinkamus pradmenis. Dauguma pradmenų sukuria 10 - 12 fragmentų. RAPD naudojama tirti tolimoms rūšims, tik jokiu būdu ne gentims. Metodas labai jautrus reikalauja tikslumo. Gauti molekuliniai duomenys apdorojami taksometrikos metodais.

Iškyla problema, kurį metodą pasirinkti. Pirmiausia reikia žinoti, ką tirsime – poliplodiją, hibridus, kokiu rango augalus ar grybus norima tirti. LENTELE. Žinoma,chemotaksonomija, vystantis mokslui ir technikai pasiūlys naujus metodus, sprendžiant identifikacijos, klasifikacijos, evoliucijos ir fitogeografijos problemas.

Chromatografija – fizinis – cheminis mišinių atskyrimo būdas, kai mišinio komponentai atskiriami sorbcija – kieta medžiaga, o po to sekančiu išplovimu. Gali būti adsorbcinė, popieriaus, dujų, skysta, dviejų dimensijų gelftracinė?, plonasluoksnė chromatografijos.

Kartel N.A. et al. Genetics. Encyclopedial Dictionary. Minsk, “Technalohija”, 1999. – 448p.