CHROMATOGRAFIA - ZASADA ROZDZIAŁU CHROMATOGRAFICZNEGO

CHROMATOGRAFIA

Chromatografia jest wszechstronną metodą rozdzielania składników jednorodnych mieszanin w wyniku selektywnej adsorpcji lub różnego ich podziału pomiędzy fazę ruchomą i stacjonarną układu chromatograficznego. Cząsteczki substancji rozdzielanych są przy tym wielokrotnie wymieniane pomiędzy tymi fazami (13).

W skład każdego układu chromatograficznego wchodzą:

Faza nieruchoma (stacjonarna)

Faza ruchoma

Substancja rozdzielana

Ze względu na rodzaj fazy ruchomej chromatografię można podzielić na:

Chromatografię gazową

Chromatografię cieczową

Chromatografię fluidalną

Ze względu na rodzaj fazy stacjonarnej chromatografię można podzielić na:

Chromatografię adsorpcyjną (adsorbent),

Chromatografię jonowymienną (wymieniacz jonowy)

Chromatografię powinowactwa - oddziaływania biospecyficzne

Chromatografia podziałowa (10).

1. ZASADA ROZDZIAŁU CHROMATOGRAFICZNEGO

Zjawiska decydujące o rozdziale chromatograficznym mają różny charakter, dlatego poszczególne metody chromatograficzne oparte są na różnych podstawach teoretycznych.

Podstawą rozdziału chromatograficznego jest fakt, iż poszczególne składniki próbki w niejednakowym stopniu ulegają podziałowi między dwie niemieszające się fazy, czyli fazę ruchomą gaz - ciecz w stanie nadkrytycznym lub ciecz – gaz i fazę stacjonarną. Prędkość poruszania się składników próbki w kolumnie jest funkcją podziału tych składników w dwu pozostających w stanie równowagi fazach, przy czym składniki wykazujące większe powinowactwo do fazy stacjonarnej poruszają się wolniej niż składniki wykazujące większe powinowactwo do fazy ruchomej (8, 32).

2. WYSOKOSPRAWNA CHROMATOGRAFIA CIECZOWA

HPLC ( High Performance Liquid Chromatography) należy do wszechstronnych metod rozdzielania, w której znajdująca się w fazie ruchomej mieszanina związków rozdziela się na skutek oddziaływania z fazą stacjonarną. Metoda ta umożliwia przeprowadzenie szybkiej analizy. Wysokosprawna chromatografia cieczowa charakteryzuje się dobrą rozdzielczością, wysoką sprawnością, zastosowaniem wysokich ciśnień oraz dużą szybkością procesu (13, 8).

Zasada działania chromatografu jest następująca: pompa, pod odpowiednim ciśnieniem pobiera ze zbiornika lub zbiorników rozpuszczalniki stanowiące fazę ruchomą. Próbka wstrzykiwana jest do dozownika i wraz z fazą ruchomą przedostaje się na kolumnę chromatograficzną, na której zachodzi rozdział poszczególnych składników próbki. Następnie rozdzielona mieszanina trafia do detektora. Sygnał z detektora po wzmocnieniu jest zapisany na komputerze. W celu zautomatyzowania procesu rozdziału, rozdzielone składniki mieszanin zbierane są przez kolektor frakcji. Schemat budowy chromatografu cieczowego przedstawia Rys. 2. (13).

Rys. 2. Schemat blokowy chromatografu cieczowego.

1,2 – zbiorniki eluentów, 3 – pompa, 4 – manometr, 5 - dozownik, 6 – kolumna chromatograficzna, 7 – termostat, 8 – przepływomierz, 9 – detektor, 10 – kolektor frakcji, 11 - rejestrator

Fazę ruchomą (eluent) stanowią pojedyncze rozpuszczalniki lub ich dwu- trójskładnikowe mieszaniny. Rozpuszczalniki stosowane jako fazy ruchome powinny:

umożliwiać detekcję próbki,

charakteryzować się trwałością w warunkach rozdziału,

charakteryzować się wysokim stopniem czystości,

wykazywać odpowiednią zdolność rozpuszczania próbki,

być tanie.

Warunkiem dobrego rozdziału chromatograficznego jest ustalenie się właściwej równowagi w procesie oddziaływań międzycząsteczkowych, obejmujących próbkę, fazę ruchomą i fazę stacjonarną.

Układ, w którym faza stacjonarna jest polarna, a faza ruchoma niepolarna, określa się mianem chromatografii cieczowej w normalnym układzie faz.

Obecnie najczęściej stosuje się chromatografię z odwróconymi fazami, tj. faza stacjonarna jest niepolarna, a faza ruchoma polarna (13).

ZASTOSOWANIE WYSOKOSPRAWNEJ CHROMATOGRAFII CIECZOWEJ

Wysokosprawna chromatografia cieczowa jest stosowana do rozdzielania i analizy tych substancji, których nie można analizować metodą chromatografii gazowej.

Zaletą wysokosprawnej chromatografii cieczowej jest możliwość wykrycia i oznaczenia substancji analizowanej w próbce wobec wielu innych związków.

Najczęściej metoda HPLC jest wykorzystywana do analizowania takich związków jak:

preparaty farmaceutyczne

związki biologicznie czynne: białka, polisacharydy, witaminy, kwasy nukleinowe

węglowodory policykliczne w powietrzu atmosferycznym, wodzie i żywności

środki ochrony roślin

związki metaloorganiczne

związki kompleksowe

aniony nieorganiczne

Metoda HPLC jest wykorzystywana w analizie jakościowej oraz w analizie ilościowej.

Analiza jakościowa polega na identyfikacji pików odpowiadających poszczególnym składnikom próbki, co uzyskuje się w dwojaki sposób: przez porównanie czasu retencji próbki z czasem retencji wzorca lub przez zastosowanie detektorów jakościowych.

W analizie ilościowej zawartość składników w próbce oblicza się wykorzystując fakt, że powierzchnia piku lub jego wysokość jest proporcjonalna do ilości danego składnika w próbce. W analizie wykorzystuje się porównanie wysokości piku próbki z wysokością piku wzorca (8,13).