WALIDACJA METOD ANALIZY CHEMICZNEJ - POJĘCIE WALIDACJI METODY ANALITYCZNEJ

WALIDACJA METOD ANALIZY CHEMICZNEJ

POJĘCIE WALIDACJI METODY ANALITYCZNEJ

W ostatnich latach nastąpił gwałtowny rozwój chemii analitycznej. Wprowadzono wiele nowych metod analizy, które stwarzają możliwość wykonywania oznaczeń w zakresie analizy śladów i ultraśladów. Z drugiej strony konieczność uzyskiwania wyników charakteryzujących się bardzo dużą dokładnością i precyzją, powtarzalnością i odtwarzalnością przyczyniła się do wnikliwego zajęcia się samymi metodami analizy chemicznej. Wprowadzono więc do chemii analitycznej nowe pojęcie, określone jako walidacja metod analitycznych. Dzięki czemu uzyskaliśmy możliwość porównywania wyników z różnych laboratoriów w skali międzynarodowej (9).

Termin walidacja ma kilka definicji. USP 23 (United States Pharmacopeia) i WHO (World Health Organization) określają walidację metody analitycznej jako proces, za pomocą którego ustala się, poprzez badania laboratoryjne, że przeprowadzona charakterystyka metody jest zgodna z wymaganiami zamierzonych zastosowań analitycznych.

Według W. Szczepaniaka walidacja metody analitycznej jest to proces, który polega na eksperymentalnym wykazaniu, że metoda jest przydatna do rozwiązywania danego zadania analitycznego jak również na udokumentowaniu stopnia wiarygodności danej metody analitycznej (8).

W przemyśle farmaceutycznym problem zapewnienia odpowiedniej jakości badań analitycznych stał się szczególnie ważny z chwilą coraz powszechniejszego wprowadzania do lecznictwa preparatów zawierających substancje generyczne.

Najważniejsze parametry, będące podstawą walidacji metody analizy chemicznej to:

Selektywność

Specyficzność

Precyzja

Dokładność

Wykrywalność i oznaczalność

Zakres

Liniowość

Trwałość

PARAMETRY WALIDACJI

SELEKTYWNOŚĆ I SPECYFICZNOŚĆ

Selektywność i specyficzność to jedne z najważniejszych pojęć w analizie chemicznej. Jednakże pojęcia te są często nie rozróżniane bądź uważane za synonimy.

Selektywność można stopniować lub skalować, natomiast specyficzność jest absolutną wartością, charakterystyczną danej matrycy. Specyficzność jest najwyższym stopniem selektywności.

Niektóre metody są selektywne, inne są natomiast specyficzne. Metody chromatograficzne są zwykle selektywne, ponieważ wykrywa się i oznacza zawartość. Anality są identyfikowane poprzez pomiar czasu retencji pików, natomiast pomiar powierzchni piku może być podstawą analizy ilościowej. Inne metody, np. immunologiczne, muszą być wysoce specyficzne, ponieważ istotne jest, aby oznaczać tylko interesujący analit a nie obecne również w próbie metabolity.

Selektywność metod analitycznych jest określana przez porównanie wyników badań próbek zawierających zanieczyszczenia, z rezultatami oznaczeń próbek pozbawionych zanieczyszczeń (9).

PRECYZJA

Precyzja jest to stopień zgodności między wynikami uzyskanymi tą samą metodą i na tej samej próbce przy wielokrotnym powtarzaniu oznaczeń. Im mniejsze są różnice między wynikami poszczególnych oznaczeń a średnią arytmetyczną tych wyników, tym precyzja jest większa. Za precyzję oznaczeń odpowiedzialny jest błąd przypadkowy

Miarą precyzji oznaczeń jest odchylenie standardowe σ, a także względne odchylenie standardowe RSD oraz współczynnik zmienności CV%.

Charakteryzując precyzję można wyodrębnić dwa dodatkowe pojęcia: odtwarzalność i powtarzalność.

Przez odtwarzalność metody rozumiemy zgodność wyników uzyskiwanych podczas analizowania tą metodą tych samych próbek, ale przez różnych analityków, pracujących w różnych laboratoriach lub w tym samym laboratorium, lecz w innym przedziale czasowym. Miarą odtwarzalności jest RDS odtwarzalności.

Powtarzalność jest to zgodność wyników uzyskiwanych daną metodą i za pomocą tej samej aparatury podczas wielokrotnego analizowania identycznych próbek, w krótkich odstępach czasu, przez tego samego analityka, pracującego w danym laboratorium. Miarą powtarzalności jest względne odchylenie standardowe RSD powtarzalności oznaczeń (8, 9).

DOKŁADNOŚĆ

Dokładność jest to stopień zgodności między wynikiem oznaczonym lub średnią z n oznaczeń a prawdziwą zawartością analitu w badanej próbce.

Miarą dokładności jest wielkość błędu, czyli różnica między otrzymanym wynikiem a wartością prawdziwą. Im błąd jest mniejszy, tym dokładność jest większa.

Dokładność metody można wyznaczyć na wiele sposobów:

Przeprowadzając analizę próbki, w której zawartość analitu jest dokładnie znana.

Przez porównanie wyników uzyskanych opracowywaną metodą z wynikami uzyskanymi inną metodą, powszechnie przyjętą za dokładną.

Poprzez badanie odzysku znanej ilości analitu dodanego do matrycy, nie zawierającej substancji oznaczanej

Wyznaczając odzysk znanej ilości analitu, dodanego do próbki badanej ( 8, 9, 17, 25).

WYKRYWALNOŚĆ I OZNACZALNOŚĆ

Granica wykrywalności nazywa się stężenie analitu, generującego sygnał, który może być statystycznie odróżniony od sygnału próby ślepej. Jest to więc najmniejsze wykrywalne stężenie analitu (8).

W przypadku wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC), granicę wykrywalności stanowi ilość wstrzykniętej substancji, której odpowiada sygnał dwukrotnie większy od sygnału linii podstawowej (9).

Granica oznaczalności jest to stężenie analitu, generującego sygnał, znajdujący się w dolnym prostoliniowym zakresie krzywej kalibracyjnej, z taką precyzją, aby wartość współczynnika zmienności CV ≤ 10% (8).

Wyznaczając granicę oznaczalności można posłużyć się pomiarami wysokości pików analitu. Na ogół przyjmuje się,
aby wysokość pików była około 10-20 razy większa od linii podstawowej (9).

ZAKRES METODY

Zakres metody analitycznej obejmuje obszar pomiędzy górnym i dolnym przedziałem stężeń, w którym wykazano, że oznaczenia można przeprowadzić z akceptowaną precyzją, dokładnością i liniowością.

Zakres stężeń jest zwykle wyrażany w tych samych jednostkach jak wyniki oznaczeń otrzymane tą metodą (np. %, ppm) (9).

LINIOWOŚĆ

Liniowość metody analizy chemicznej określa zdolność uzyskiwania wartości mierzonych, które są wprost proporcjonalne do stężenia analitu w próbkach (9).

Przy niskich stężeniach zakres liniowy ograniczony jest przez dolną granicę oznaczalności, a zakrzywienie jest wynikiem występowania szumów aparaturowych i efektem matrycowym.

Za koniec zakresu prostoliniowego przyjmuje się punkt, w którym odchylenie od prostoliniowości nie przekracza 3% (8).

Do badań liniowości wykorzystuje się najczęściej 6 roztworów o różnych stężeniach, które obejmują zakres od 50 do 150%, w odniesieniu do oczekiwanych wyników analizy (9).

. TRWAŁOŚĆ

Z powodu łatwości z jaką wiele substancji rozkłada się w roztworze np. podczas przechowywania, przygotowywania, w czasie ekstrakcji, przenoszenia do innej fazy czy oczyszczania, opracowując metodę analizy należy badać trwałość roztworów.

Jeżeli sygnał po 48 godzinach zmienił się o ≤ 2%, w porównaniu z sygnałem próbki i wzorców świeżo przygotowanych, to możemy uznać, że roztwory standardów i próbek są trwałe (9).