WYNIKI - KRZYWA WZORCOWA

WYNIKI

KRZYWA WZORCOWA

Uzyskane wyniki zostały przedstawione w postaci krzywej wzorcowej (Rys. 3.). Na osi rzędnych przedstawiono wartości pola powierzchni piku substancji badanej, natomiast na osi odciętych przedstawiono stężenie substancji badanej.

y = 1,79e+006X

Rys. 3. Krzywa wzorcowa roztworów 5-FU w soli fizjologicznej.

2. WALIDACJA METODY HPLC

2.1. SPECYFICZNOŚĆ

Specyficzność metody analitycznej oceniano przez porównanie chromatogramów trzech prób ślepych z chromatogramem roztworu wzorcowego.

Ocena specyficzności metody sprawdza, czy istnieją interferencje przy czasie retencji odpowiadającym substancji oznaczanej. Poniżej zamieszczono chromatogramy trzech prób ślepych i przykładowy chromatogram roztworu wzorcowego 5-FU o stężeniu 5,0 mg/ml
(Rys. 4 – 7).

Rys. 4. Chromatogram roztworu soli fizjologicznej

Rys. 4. Chromatogram roztworu Oncofolic 500 w soli fizjologicznej

Rys. Chromatogram roztworu Oncofolic 500 w soli fizjologicznej

Rys. 6. Chromatogram roztworu Oncofolic 900 w soli fizjologicznej

Rys. 7. Chromatogram roztworu 5-FU o stężeniu 5,0 mg/ml

Na podstawie przeprowadzonych analiz stwierdzono, że metoda ta jest specyficzna, ponieważ w czasie retencji substancji oznaczanej nie pojawiają się interferencje.

2.2. POWTARZALNOŚĆ

Powtarzalność zastosowanej metody wyrażana jest jako względne odchylenie standardowe RDS, które nazywane jest także współczynnikiem zmienności Wz gdy wartość ta wyrażona jest w procentach.

Analizowano roztwory 5-FU o stężeniach 1,0; 5,0 oraz 10,0 mg/ml. Dla każdego roztworu wykonano po trzy nastrzyki. Dla każdego nastrzyku obliczono wartość stężenia na podstawie krzywej wzorcowej. Wyniki przedstawiono w Tabeli 1.

Tabela 1. Wyniki oceny powtarzalności metody.

Obliczone wartości Wz świadczą o dobrej powtarzalności zastosowanej metody analitycznej. W farmaceutycznej kontroli jakości akceptowane wartości współczynnika zmienności to WZ <1%. Na poniższych Rysunkach (8 - 10) przedstawiono chromatogramy roztworów 5-FU o stężeniu 1,0; 5,0 oraz 10,0 mg/ml.

Rys. 8. Chromatogramy roztworu 5-FU o stężeniu 1,0 mg/ml.

Rys. 9. Chromatogramy roztworu 5-FU o stężeniu 5,0 mg/ml.

Rys. 10. Chromatogramy roztworu 5-FU o stężeniu 10,0 mg/ml.

2.3. DOKŁADNOŚĆ

Dokładność metody szacowano na podstawie 9 wyników oznaczeń dla trzech różnych stężeń. Wyniki przedstawiono w Tabeli 2.

Tabela 2. Wyniki parametrów analitycznych dotyczących oceny dokładności metody.

Wartości współczynnika zmienności mieszczą się w akceptowanym przedziale ufności. Metoda ta charakteryzuje się wystarczającą dokładnością.

2.4. LINIOWOŚĆ

Współczynnik korelacji liniowej krzywej wzorcowej jest miarą liniowości metody analitycznej. Dla uśrednionej krzywej wzorcowej 5-FU otrzymano następujący współczynnik korelacji liniowej: r=0,9999 (Rys. 3.).

Akceptowana wartość współczynnika korelacji to r > 0,99 Krzywa wzorcowa w oznaczanym przedziale stężeń 5-FU wykazuje charakter liniowy.

2. TEST ZAMRAŻANIA KRÓTKOTERMINOWY

Doświadczenie przeprowadzono dla 3 wybranych stężeń roztworów 5-FU 1,0; 5,0; 10,0 mg/ml. Próbki przechowywano w temperaturze -29˚C. Stężenie 5-FU oznaczono przed pierwszym zamrożeniem oraz po pierwszym i drugim zamrożeniu. Dane przedstawiono w Tabelach 3 -

Tabela 3. Dane doświadczalne dotyczące krótkoterminowego testu zamrażania roztworu 5-FU o stężeniu 10,0 mg/ml.

Tabela 4. Dane doświadczalne dotyczące krótkoterminowego testu zamrażania roztworu 5-FU o stężeniu 5,0 mg/ml.

Tabela Dane doświadczalne dotyczące krótkoterminowego testu zamrażania roztworu 5-FU o stężeniu 1,0 mg/ml.

Jako trwałe przyjmuje się roztwory próbek, których sygnał po 24 godzinach zmienił się o ≤ 2%, w porównaniu z sygnałem próbki świeżo przygotowanej.

Z przeprowadzonych oznaczeń ilościowych roztworów 5-FU wynika, że zmiana wartości stężeń obejmuje zakres poniżej 2 %. Krótkotrwałe zamrażanie roztworów 5-FU nie wpływa znacząco na zmianę ich trwałości.

2.6. TEST TRWAŁOŚCI 24 GODZINNY

Doświadczenie przeprowadzono dla 3 wybranych stężeń roztworów 5-FU 1,0; 5,0 oraz 10,0 mg/ml. Próbki roztworów przechowywane były w temperaturze pokojowej. Pierwsze oznaczenie stężenia przeprowadzono bezpośrednio po przygotowaniu roztworów (godzina 0). Kolejne oznaczenia stężeń przeprowadzano po upływie 4, 8, 12, 16, 20 i 24 godzin. Dane przedstawiono w Tabelach 6 - 8.

Tabela 6. Dane doświadczalne dotyczące 24 h testu trwałości roztworu 5-FU o stężeniu 10,0 mg/ml.

Tabela 7. Dane doświadczalne dotyczące 24 h testu trwałości roztworu 5-FU o stężeniu 5,0 mg/ml.

Tabela 8. Dane doświadczalne dotyczące 24 h testu trwałości roztworu 5-FU o stężeniu 1,0 mg/ml.

Obliczone procentowe zmiany stężeń mieszczą się
w zakresie poniżej 2%. Analizowane roztwory 5-FU są trwałe
w czasie 24 godzin

2.7. TEST ZAMRAŻANIA DŁUGOTERMINOWY

Doświadczenie przeprowadzono dla 3 wybranych stężeń
5-FU 1,0; 5,0 oraz 10,0 mg/ml. Próbki roztworów przechowywano w temperaturze -29˚C. Pierwsze oznaczenie stężeń przeprowadzono bezpośrednio przed zamrożeniem. Kolejne oznaczenie stężeń przeprowadzono po upływie 14 dni. Dane z tych oznaczeń przedstawiono w Tabelach 9, 10, 11.

Tabela 9. Dane doświadczalne dotyczące testu zamrażania długoterminowego roztworu 5-FU o stężeniu 1,0 mg/ml.

Tabela 10. Dane doświadczalne dotyczące testu zamrażania długoterminowego roztworu 5-FU o stężeniu 5,0 mg/ml.

Tabela 11. Dane doświadczalne dotyczące testu zamrażania długoterminowego roztworu 5-FU o stężeniu 10,0 mg/ml.

W analizowanych roztworach 5-FU, po upływie 14 dni nastąpiło zmniejszenie stężenia poniżej granicy oznaczalności.

Roztwory 5-FU pod wpływem długotrwałego zamrażania są nietrwałe.

3. TRWAŁOŚĆ 5-FU W ROZTWORACH INIEKCYJNYCH

W doświadczeniu analizowano roztwory 5-FU o stężeniu 1,0 i 5,0 mg/ml i z dodatkiem różnej ilości leku Oncofolic. Analizę przeprowadzano w temperaturze 4 i 21˚C. Wyniki dla poszczególnych oznaczeń przedstawiono w Tabelach 12 – 23 oraz w postaci Wykresów 1 – 8.

3.1. Trwałość 5-FU 1,0 mg/ml w temperaturze 21˚C

Oznaczano wartości stężeń dla roztworów 5-FU o stężeniu 1,0 mg/ml z dodatkiem leku Oncofolic. Analizę przeprowadzono w temperaturze 21 C. Wyniki oznaczeń ilościowych przedstawiono w Tabelach 12 - 14 oraz w postaci Wykresów 1 i 2.

Tabela 12. Dane doświadczalne oceny trwałości roztworów 5-FU o stężeniu 1,0 mg/ml w temperaturze 21 C.

Tabela 3. Dane doświadczalne oceny trwałości roztworów 5-FU o stężeniu 1,0 mg/ml z dodatkiem Oncofolic 500 w temperaturze 21 C.

Tabela 14. Dane doświadczalne oceny trwałości roztworów 5-FU o stężeniu 1,0 mg/ml z dodatkiem Oncofolic 900 w temperaturze 21 C.

Wykres 1. Zestawienie uśrednionych wartości stężeń roztworów 5-FU o stężeniu 1,0 mg/ml w temperaturze 21 C.

Wykres 2. Zestawienie procentowych zmian wartości stężeń roztworów 5-FU o stężeniu 1.0 mg/ml w temperaturze 21 C.

W Tabelach 12-14 oraz w Wykresach 1 i 2 przedstawiono wyniki pomiaru wartości stężeń oraz wartość procentowej zmiany stężenia roztworów 5-FU. Z danych tych wynika, że w roztworze 5-FU do dnia 7 włącznie nie wystąpiła istotna zmiana wartości stężeń. Natomiast w dniu 14 nastąpiło istotne zmniejszenie wartości stężeń (>10%). W 14 dniu w chromatogramie obserwujemy powstanie dodatkowego piku pochodzącego od produktu rozkładu 5-FU (Rys. 11). Roztwór 5-FU 1,0 mg/ml w temperaturze 21˚C zachowuje trwałość do 7 dnia analizy.

Z wyników analizy statystycznej trwałości roztworów 5-FU o stężeniu 1,0 mg/ml wynika, że w dniach 1 – 7 zdarzają się istotne różnice statystyczne, wynikające z niskiej wartości odchylenia standardowego SD. Średnia wartość stężeń roztworów 5-FU względem dnia 0 jest na zbliżonym poziomie.

3.2. Trwałość 5-FU 1,0 mg/ml w temperaturze 4˚C

Oznaczano wartości stężeń dla roztworów 5-FU o stężeniu 1,0 mg/ml z dodatkiem leku Oncofolic. Analizę przeprowadzono
w temperaturze 4 C. Wyniki oznaczeń ilościowych przedstawiono w Tabelach 15 - 17 oraz w Wykresach 3 i 4.

Tabela 1 Dane doświadczalne oceny trwałości roztworów 5-FU o stężeniu 1,0 mg/ml w temperaturze 4 C.

Tabela 16. Dane doświadczalne oceny trwałości roztworów 5-FU o stężeniu 1,0 mg/ml z dodatkiem Oncofolic 500 w temperaturze 4 C.

Tabela 17. Dane doświadczalne oceny trwałości roztworów 5-FU o stężeniu 1,0 mg/ml z dodatkiem Oncofolic 900 w temperaturze 4 C.

Wykres 3. Zestawienie uśrednionych wartości stężeń roztworów 5-FU o stężeniu 1,0mg/ml w temperaturze 4 C.

Wykres 4. Zestawienie procentowych zmian wartości stężeń roztworów 5-FU o stężeniu 1,0 mg/ml w temperaturze 4 C.

W Tabelach 15 -17 oraz w Wykresach 3 i 4 przedstawiono wyniki pomiaru wartości stężeń oraz wartość procentowej zmiany stężenia w roztworach 5-FU. Z danych tych wynika, że w roztworze 5-FU do dnia 7 włącznie nie wystąpiła istotna zmiana wartości stężeń. Natomiast w dniu 14 nastąpiło istotne zmniejszenie wartości stężeń (>10%). W 14 dniu w chromatogramie obserwujemy powstanie dodatkowego piku pochodzącego od produktu rozkładu 5-FU (Rys. 11). Roztwór 5-FU 1,0 mg/ml w temperaturze 4˚C zachowuje trwałość do 7 dnia analizy.

Z wyników analizy statystycznej trwałości roztworów 5-FU o stężeniu 1,0 mg/ml wynika, że w dniach 1 – 7 zdarzają się istotne różnice statystyczne, wynikające z niskiej wartości SD. Średnia wartość stężeń roztworów 5-FU względem dnia 0 jest na zbliżonym poziomie.

3.3. Trwałość 5-FU 5,0 mg/ml w temperaturze 21˚C

Oznaczano wartości stężeń dla roztworów 5-FU o stężeniu 5,0 mg/ml z dodatkiem leku Oncofolic. Analizę przeprowadzono w temperaturze 21 C. Wyniki oznaczeń ilościowych przedstawiono w Tabelach 18, 19, 20 oraz w Wykresach 5 i 6.

Tabela 18. Dane doświadczalne oceny trwałości roztworów 5-FU o stężeniu 5,0 mg/ml w temperaturze 21 C.

Tabela 19. Dane doświadczalne oceny trwałości roztworów 5-FU o stężeniu 5,0 mg/ml z dodatkiem Oncofolic 500 w temperaturze 21 C.

Tabela 20. Dane doświadczalne oceny trwałości roztworów 5-FU o stężeniu 5,0 mg/ml z dodatkiem Oncofolic 900 w temperaturze 21 C.

Wykres Zestawienie uśrednionych wartości stężeń roztworów 5-FU o stężeniu 5,0 mg/ml w temperaturze 21 C.

Wykres 6. Zestawienie procentowych zmian wartości stężeń roztworów 5-FU o stężeniu 5,0 mg/ml w temperaturze 21 C.

W Tabelach 18 – 20 oraz w Wykresach 5 i 6 przedstawiono wyniki pomiaru wartości stężeń oraz wartość procentowej zmiany stężenia roztworów 5-FU. Z danych tych wynika, że w roztworze 5-FU 5,0 mg/ml do dnia 7 włącznie nie wystąpiła istotna zmiana
wartości stężeń. Natomiast w dniu 14 nastąpiło istotne
zmniejszenie wartości stężeń (>10%). W 14 dniu
w chromatogramie obserwujemy powstanie dodatkowego piku pochodzącego od produktu rozkładu 5-FU (Rys. 11.). Roztwór 5-FU 5,0 mg/ml w temperaturze 21˚C zachowuje trwałość do 7 dnia analizy.

Z wyników analizy statystycznej trwałości roztworów 5-FU wynika, że w dniach 1 – 7 zdarzają się istotne różnice statystyczne, wynikające z niskiej wartości SD. Średnia wartość stężeń roztworów 5-FU względem dnia 0 jest na zbliżonym poziomie.

3.4. Trwałość 5-FU 5,0 mg/ml w temperaturze 4˚C

Oznaczano wartości stężeń dla roztworów 5-FU o stężeniu 5,0 mg/ml z dodatkiem leku Oncofolic. Analizę przeprowadzono
w temperaturze 4 C. Wyniki oznaczeń ilościowych przedstawiono w Tabelach 21, 22, 23 oraz w Wykresach 7 i 8.

Tabela 21. Dane doświadczalne oceny trwałości roztworów 5-FU o stężeniu 5,0 mg/ml w temperaturze 4 C.

Tabela 22. Dane doświadczalne oceny trwałości roztworów 5-FU o stężeniu 5,0 mg/ml z dodatkiem Oncofolic 500 w temperaturze 4 C.

Tabela 23. Dane odświadczalne oceny trwałości roztworów 5-FU o stężeniu 5,0 mg/ml z dodatkiem Oncofolic 900 w tempertaurze 4 C.

NS : wynik nieistotny statystycznie

IS : wynik istotny statystycznie

Wykres 7. Zestawienie uśrednionych wartości stężeń roztworów 5-FU o stężeniu 5,0 mg/ml w temperaturze 4 C.

Wykres 8. Zestawienie procentowych zmian wartości stężeń roztworów 5-FU o stężeniu 5,0 mg/ml w temperaturze 4 C.

W Tabelach 21-23 oraz w Wykresach 7 i 8 przedstawiono wyniki pomiaru wartości stężeń oraz wartość procentowej zmiany stężenia roztworów 5-FU. Z danych tych wynika, że w roztworze 5-FU 5,0 mg/ml do dnia 7 włącznie nie wystąpiła istotna zmiana wartości
stężeń. Natomiast w dniu 14 nastąpiło istotne
zmniejszenie wartości stężeń (>10%). W 14 dniu
w chromatogramie obserwujemy powstanie dodatkowego piku pochodzącego od produktu rozkładu 5-FU (Rys. 11). Roztwór 5-FU 5,0 mg/ml w temperaturze 4˚C zachowuje trwałość do 7 dnia analizy.

Z wyników analizy statystycznej trwałości roztworów 5-FU o stężeniu 5,0 mg/ml wynika, że w dniach 1 – 7 zdarzają się istotne różnice statystyczne, wynikające z niskiej wartości SD. Średnia wartość stężeń roztworów 5-FU względem dnia 0 jest na zbliżonym poziomie.

Rys. 11. Przykładowy chromatogram roztworu 5-FU w 14 dniu analizy.