1.Introducere

Apa este unul din componentii de baza ai vietii, de aceea cunosterea calitatii sale prezinta o importanta decisiva. Romania este o tara bogata in resurse de apa, ocupand locul 21 in Europa (cf. Statisticii Natiunilor Unite) in conditiile in care dispune de numai 1700 m³ de apa timp de un an pentru un locuitor.   

Desi tara noastra este inzestrata cu mari resurse de apa, din cauza deversarii tot mai accentuate a reziduurilor industriale sau menajere exista pericolul ca aceasta sa nu mai poata fi utilizata la intreaga ei capacitate.

Dezvoltarea industriei a condus la cresterea rapida a necesarului de apa , resperctiv a volumului apelor uzate evacuate din procesele tehnologice industriale.

Dupa provenienta, apele reziduale sunt clasificate in :

- ape uzate menajere;

ape uzate industriale.

Principalele substante poluante din apele uzate industriale sunt substantele organice si anorganice , dizolvate sau in suspensie cu diferite grade de nocivitate.

Microorganismele indigene (autohtone) si zimogene (care ajung in ape prin poluare) sunt parte a componentei biotice a apelor reziduale, alcatuind o microbiota extrem de diversa, adaptata la conditiile fizico-chimice specifice, cu rol esential in biodegradare.

Microbiota apelor reziduale depinde de provenienta acestora. In mod normal se intalneste un numar mare de bacterii heterotrofe care apartin speciilor: Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Enterobacter, Streptococcus faecalis, Escherichia coli etc. Drojdiile apartinand speciilor Saccharomyces, Candida, Cryptococcus, Rhodotorula sunt deseori prezente in apele reziduale.

Pentru protectia mediului inconjurator si sanatatea si securitatea biocenozelor, in contextul integrarii Romaniei in UE, se impune alinierea tarii noastre la cererile politicii ce vizeaza protectia mediului, printre acestea numarandu-se si cele legate de tratarea, prin diverse metode, a apelor reziduale rezultate din industrie si nu numai. Un loc aparte il ocupa apele reziduale provenite din industria alimentara, acestea fiind caracterizate printr-un continut ridicat de compusi organici corelat si cu o incarcatura microbiana ridicata adaptata pentru biodegradarea substantelor din mediul lor de viata.

Cunoasterea compozitiei microbiotei apelor reziduale precum si a proprietatilor biochimice corelate cu natura poluantilor, precum si a conditiilor fizico-chimice optime de activitate metabolica, este un element important in eficientizarea tratamentului biologic aplicat pentru epurarea apelor reziduale in statiile de epurare.

In acest context, prezentul studiu prezinta cercetari preliminare de evaluare microbiologica si biochimica a microbiotei apelor reziduale din industria alimentara (fabrica de lapte si fabrica de bere) in vederea obtinerii de culturi adaptate pentru epurare si utilizarea acestora pentru testare pe sisteme model si reale, in vederea studiului si modelarii proceselor de apurare biologica.

2. Materiale si metode

Prelevarea probelor de apa

Pentru prelevarea apelor reziduale s-a folosit un prelevator alcatuit din piston, furtun si recipiente din plastic cu un volum de 150 ml. Inainte de prelevare, recipientele au fost dezinfectate cu alcool etilic.

Dupa examinarea planurilor unitatilor de productie au fost identificate si apoi inspectate punctele de evacuare ale apelor reziduale din sectii.

Prelevarea s-a realizat din canalele de scurgere amplasate in curtea unitatii de productie in cazul fabricii de bere si din cadrul unitatii in cazul fabricii de lapte, inainte ca aceste ape reziduale sa fie deversate in sistemul municipal de colectare. Din ambele unitati s-au prelevat ape din cate doua surse diferite.

La fabrica de bere prelevarile de ape reziduale au fost efectuate din canalizarile unde sunt deversate apele reziduale de la sectia de fermentare+ filtrare+ imbuteliere- canalizare centralizata.

La fabrica de prelucrare a produselor lactate, prelevarile s-au efectuat din canalizarile in care sunt deversate apele reziduale de la sectiile de fabricare a branzei si canalizare generala.

Probele au fost prelevate la inceputul si sfarsitul lunilor ianuarie si februarie 2008. Probele au fost pastrate in coditii de refrigerare la temperaturi de 04sC si analizate la Laboratorul de Epurare a apelor reziduale de la Facultatea Stiinta si Ingineria Alimentelor.

Evaluarea microbiologica a apelor reziduale

Microorganismele din microbiota apelor reziduale au fost izolate prin metoda Koch bazata pe diluarea si raspandirea celulelor in mediul cu agar cu obtinerea de colonii individuale din care s-au obtinut ulterior culturi pure de bacterii, drojdii si mucegaiuri prin repicare in eprubete in mediu inclinat. S-au respectat conditiile optime recomandate pentru cultivarea microorganismelor si anume cultivarea pe must de malt cu agar, la temperaturi de 25-28sC, timp de 3-5 zile, pentru drojdii si mucegaiuri si pe bulion de carne cu agar, la temperatura de 37sC timp de 48 h pentru bacterii.

Culturile pure obtinute s-au codificat si s-au pastrat in calitate de culturi stoc pentru evaluarile biochimice.

Izolatele au fost evaluate din punct de vedere morfologic prin examenul caracterelor culturale ale coloniilor si prin examen microscopic in frotiuri uscate , colorate Gram, utilizand microscopul cu epifluorescenta si contrast de faza Olympus

Evaluarea proprietatilor biochimice a culturilor izolate din microbiota apelor reziduale

Pentru evidentierea cresterii pe diverse substraturi de carbon si azot, celule din culturile pure izolate au fost inoculate in punct pe suprafata mediilor solidificate continanad diverse surse de carbon si azot ca unica sursa dupa cum urmeaza:

Mediul de baza utilizat pentru dezvoltarea bacteriilor (cod BC):

NaCl 0,5%

NH₄H₂PO₄ 0,1%

MgSO₄ 0,02%

K₂HPO₄ 0,1%   

agar 2%

apa distilata

Surse de carbon testate: maltoza (1%), lactoza (1%), amidon (1%).

Sursa de azot testata: cazeina din lapte (1%)

Mediul de baza pentru multiplicarea drojdiilor (cod Dj):

MgSO₄ 7H₂O 0,07%

NaCl    0,05%

(NH₄)₂SO₄     0,74%

K₂HPO₄    0,013%

KH₂PO₄ 0,1%

Agar 2%

Apa distilata

Surse de carbon testate: maltoza (1%), lactoza (1%).

Mediul de baza utilizat pentru dezvoltarea mucegaiurilor (saruri Czapek, cod Cza):

NaNO₃    0,2%

K₂HPO₄    0,1%

MgSO₄ 7H₂O 0,05%

KCl 0,05%

FeSO₄ 4H₂O    0,001%

Agar    2%

Apa distilata

Surse de carbon adaugate: amidon (1%), acid lactic (1%).

Capacitatea microorganismelor de a metaboliza diverse substraturi de carbon si azot a fost monitorizata prin determinarea diametrelor coloniilor dezvoltate pe mediile de baza specifice, suplimentate cu maltoza, lactoza, amidon, acid lactic (in calitate de sursa de carbon) si respectiv cazeina (in calitate de sursa de azot) in concentratie de 1%. In cazul amidonului si a cazeinei, a fost posibila determinarea semnificativa a potentialului de biodegradare prin stabilirea unui raport de hidroliza.

Toate experimentele au fost realizate in duplicat iar reprezentarile au tinut cont de media aritmetica si deviatia standard.

3. Rezultate si discutii

Diversitatea microbiotei apelor reziduale din industria alimentara

Atat apele reziduale din industria prelucrarii laptelui, cat si cele din industria berii, prezinta un continut ridicat in materii organice biodegradabile constituind astfel un mediu prielnic dezvoltarii microorganismelor.

Din probele de ape reziduale prelevate, in urma examenului cultural s-au obtinut culturi pure care au fost examinate din punct de vedere microscopic si macroscopic in vederea identificarii categoriilor de microorganisme prezente (tabelul 1).

Din datele prezentate in tabelul 1, se observa predominanta bacteriilor in microbiota apelor reziduale, iar in cazul apei de la fabrica de lapte diversitatea de culturi de dojdii si mucegaiuri care, alaturi de bacterii, alcatuiesc o comunitate complexa in corelatie cu abundenta de compusi organici cu carbon si azot din aceste ape (lactoza, acid lactic, cazeine etc.).

In urma examenului microscopic corelat cu caracterele culturale, s-au identificat bacterii Gram negative apartinanad genurilor Bacillus si Pseudomonas dar si specii de drojdii apartinand probabil genurilor Saccharomyces, Torulopsis, Kluyveromyces si mucegaiuri apartinand genurilor Aspergillus si Geotrichum (figurile 1, 2, 3, 4, 5)

Tabelul 1. Categorii de microorganisme evidentiate in microbiota apelor uzate din industria laptelui si a berii.

(a)    (b)

   

(c) (d)

(e)

Fig. 1. Aspectul microscopic al bacteriilor izolate din apele reziduale prelevate de la fabrica de bere si de la fabrica de prelucrare a laptelui: (a) tulpina IBS1Bc2, (b) tulpina IBS2Bc1, (c) tulpina IIBS2Bc1. (d) tulpina ILGBc1, (e) tulpina ILGBc2.

(a) (b)

(c)

Fig. 2. Caracterele microscopice ale drojdiilor izolate din apele reziduale prelevate de la fabrica de bere si de la fabrica de prelucrare a laptelui: (a) tulpina IBS2Dj1, (b) tulpina IILBDj7, (c) tulpina IILBDj8.

   

(a)     (b)

   

(c)    (d)

(e)

Fig. . Caracterele microscopice ale mucegaiurilor izolate din apele reziduale prelevate de la fabrica de bere si de la fabrica de prelucrare a laptelui: (a,b) tulpina IILBFg4, (c,d) tulpina IILBFg2, (e) tulpina IIBS1Fg1.

Potentialul microorganismelor izolate de a metaboliza diverse surse de carbon si azot similare cu cele din apele reziduale

Din culturile pure izolate apartinand celor trei categorii de microorganisme, au fost inoculate celule pe medii specifice. Astfel, bacteriile au fost testate pentru capacitatea lor de a metaboliza amidonul, maltoza si lactoza prin cultivarea pe mediul BC cu amidon 1 % , maltoza 1%, sau lactoza 1%. Dupa o termostatare timp de 48 de ore, s-a evaluat dezvoltarea coloniala prin determinarea diametrului coloniei. S-a calculat media diametrelor si s-a stabilit deviatia standard (figura 3).

Fig. 3. Capacitatea bacteriilor din apele reziduale din industria berii de a metaboliza maltoza

Toate tulpinile de bacterii izolate din apele reziduale din industria berii sunt capabile sa metabolizeze maltoza. Tulpinile IBS1Bc5, IBS1Bc6, prezinta cea mai buna capacitate de a metaboliza maltoza.

Capacitatea bacteriilor de a hidroliza amidonul a fost pus in evidenta prin inundare cu solutie Lugol 0.1N a suprafetei mediului de cultura cu 1% amidon pe suprafata caruia s-au dezvoltat colonii dupa 48 h de cultivare. Au fost masurate diametrele coloniilor (Dc) si diametrele zonelor de hidroliza (Dh). Consumul de substrat s-a stabilit prin raportul (Dh)/ (Dc).

Rezultatele sunt prezentate in figura 4.

Culturile de bacterii izolate din apele reziduale din industria berii au capacitatea de a biodegrada amidonul, cel mai bun potential prezentandu-l tulpina IBS1Bc2.

Fig. 4. Capacitatea bacteriilor izolate din apele reziduale din industria berii, de a degrada amidonul

Pe mediul cu 1% cazeina, ca unica sursa de azot, s-au inoculat in punct celule de bacterii. Dupa o termostatare timp de 48 de ore, la temperatura de 37sC, bacteriile au prezentata o crestere coloniala punctiforma fara sa fie vizibila o zona de hidroliza a cazeinei in jurul coloniilor ; aceasta sugereaza un metabolism slab al cazeinei.

Bacteriile izolate au capacitatea de a metaboliza lactoza. Prin cultivare pe mediul cu 1% lactoza ca unica sursa de carbon si energie, dupa 48 h de la cultivare s-a observat o buna crestere coloniala, majoritatea tulpinilor formand colonii cu diametru mai mare de 0,5 cm, iar tulpina IIBS2Bc1 o colonie cu diametrul de 1.2 cm, ceea ce indica un bun potential de metaboliza a lactozei (fig. 5).

Fig. 5. Metabolizarea lactozei de catre bacteriile din apele reziduale din industria berii

Tulpinile de drojdii izolate au fost testate prin tehnica inocularii in punct prin cultivare pe mediul cu 1% lactoza sau maltoza ca unice surse de carbon. Diametrul coloniilor au fost masurate dupa 4 zile de cultivare la temperatura de 25sC.

In figura 6, se observa ca tulpinile de drojdii izolate din apele reziduale din industria berii dar si a prelucrarii laptelui prezinta o crestere coloniala redusa pe maltoza, diametrele nedepasind valoarea de 0,5 cm.

Fig. 6. Capacitatea drojdiilor din microbiota apelor reziduale din industria alimentara de a metaboliza glucide simple.

In apele reziduale de la fabricile de lapte este prezenta lactoza care in urma activitatii microbiotei, poate fi transformata in acid lactic, acid butiric, acid propionic si gaze precum dioxid de carbon si hidrogen. Toate tulpinile de drojdii izolate au capacitatea de a metaboliza lactoza, insa cel mai bun potential il prezinta tulpina IILBDj3 care a prezentat cresterea cea mai buna, diametrul coloniei atingand valoarea de 0,8 cm dupa 4 zile de cultivare pe mediu cu 1% lactoza ca unica sursa de carbon.

4. CONCLUZII

1. Apele reziduale din industria berii si a laptelui contin o microbiota diversa alcatuita din bacterii, care sunt predominante, drojdii si mucegaiuri.

2. Prin analiza caracterelor morfologice ale tulpinilor izolate in culturi pure bazata pe examen microscopic direct si examen cultural s-au evidentiat urmatoarele grupe de microorganisme:

- bacterii, genurile Bacillus, Pseudomonas, Escherichia;

- drojdii, genurile Saccharomyces,, Kluyveromyces, Torulopsis;

- mucegaiuri, genurile Aspergillus si Geotrichum.

3. S-a testat capacitatea tulpinilor izolate de a metaboliza compusi organici in corelatie cu incidenta acestora in apele reziduale din industria alimentara.

4. In functie de potentialul fde biodegradare al tulpinilor testate datele obtinute sunt utile pentru realizarea unor culturi multiple , specializte in biodegradare in corelatie cu tipul de poluanti organici din apele reziduale si gradul de poluare.

5. Studiul ofera date preliminare pentru identificarea unor tulpini active , adaptatela conditiile fizico-chimice din apele reziduale, in vederea utilizarii acestora in calitate de inocul specializat pentru teste de epurare in sisteme model si naturale.

Referinte bibliografice

Banu, C., 1998 , Manualul inginerului de industrie alimentara, vol. 1, Ed. Tehnica Bucuresti;

Carawan, V.A. J., Hansen, a.p., 1979, Wastewater characterization in a multiproduct dairy, Dairy Sci, vol. 62, no.8, 1243-1251.

Dawson, D., 2005, Foodborne protozoan parasites, International Journal of Food Microbiology 103 : 207- 227

Eerd, L.L, Hoagland, R.E., Zablotowicz, R. M., Hall, C. J., 2003, Pesticide metabolism in plants and microorganisms, Weed Science, 51:472-495.

Fillaudeau, L., Avet, P. B., Daufin, G., 2006, Water, wastewater and waste management in brewing industries, Journal of cleaner production 14: 463-471.

Ibekue, M. A., Grieve, C.M., Lyon, S.R., 2003, Characterization of microbial communities and composition in constructed dairy wetland wastewater effluent, Appl Environ Microbiology, 69(9): 5060-5069

Janczukowicz, W., Zielinski, M., Debowski, M., 2007, Biodegradability evaluation of dairy effluents originated in selected sections of dairy production, Bioresource Technology (in press).

Kontogianni, A., Langford, I.H., Papandreou, A., Skourtos, M. S., 2003, Social preferences for improving water quality: an economic analysis of benefits from wastewater treatment, Water Resources Management 17: 317-336.

Madigan, T.M., Martinko, J.M, Parker, J., 2000, Brock biology of microorganisms, ninth edition, Prentice-hall,inc.,pag.1-29, 102-163, 642-720

Spellman, R.F, 2003, Handbook of water and wastewater treatment plant operations, Lewis Publishers, chapter: Water microbiology.

Zara, L.M, 1999, Valorificarea pe cale biotehnologica a zerului, Universitatea "Dunarea de Jos" Galati, pag. 62-90.