Determinarea ecotoxicitatii produselor comerciale fabricate pe baza de agenti de suprafata (detergenti comerciali) si evaluarea riscului generat asupra mediului acvatic

Determinarea ecotoxicitatii produselor comerciale fabricate pe baza de agenti de suprafata (detergenti comerciali) si evaluarea riscului generat asupra mediului acvatic

Justificarea lucrarii:

In cadrul industriei chimice, industria de detergenti a fost totdeauna o industrie competitiva, cu o mare deschidere pentru inovatie si spre cresterea economica. In ultimul secol a fost, si va continua sa fie, un factor cheie pentru progresul societatii. Aceasta este industria responsabila pentru cresterea nivelului de igiena al oamenilor si al spatiilor locuite de oameni - locuinte, birouri, spatii de productie, etc. si in acelasi timp pentru reducerea timpului si efortului necesar indeplinirii acestui scop. Consumul crescand de detergenti a contribuit la marirea concentratiilor acestora in reteaua de canalizare a oraselor si implicit, la impurificarea apelor de suprafata.

La nivel european, detergentii si produsele de curatat au ocupat un loc aparte in cadrul legislatiei elaborate in Comunitatea Europeana, urmare a faptului ca sunt produse de mare tonaj si pot afecta mediul inconjurator atat la producere (emisii in mediu: aer, apa, sol), dar mai ales la utilizare, prin eliminare in apele uzate, care dupa/sau fara tratarea in instalatii specifice de epurare, ajung in apele de suprafata.

Efectele negative pe care pot sa le manifeste concentratiile crescute de detergenti in apa uzata oraseneasca si ulterior, prin intermediul retelei de canalizare in apa raurilor si lacurilor, sunt in general datorate proprietatilor superficil-active ale detergentilor - caracteristica a agentilor de suprafata (surfactantii) din compozitia detergentilor, indiferent de clasa din care fac parte.

Din nefericire, multi surfactanti sintetici, care se fabrica in cantitati mari si se utilizeaza mult in compozitia detergentilor comerciali sunt rezistenti la biodegradare, ei persista si spumeaza in instalatiile de tratare si chiar in apele de suprafata (lacuri, rauri). In consideratiile actuale de evaluare ecologica a surfactantilor, biodegradabilitatea si toxicitatea ecologica sunt deosebit de importante. Biodegradabilitatea este chiar mai importanta decat eficienta de utilizare sau costul de fabricatie. Prin biodegradabilitatea surfactantilor se intelege descompunerea lor biochimica in prezenta unor microorganisme, capabile sa distruga in conditii naturale proprietatile nedorite ale surfactantilor, cum ar fi spumarea si toxicitatea pentru fauna subacvatica. Din punct de vedere al evaluarii practice a biodegradarii succesive, surfactantii se impart in trei categorii:

Total biodegradabili (degradare 100%), cu transformarea lor in materiale minerale (CO2, H2O, Na2SO4) inofensive pentru mediul ambiant

Biodegradabili (degradare > 80%)

Nebiodegradabili (degradare < 80%)

Biodegradabilitatea este puternic influentata de structura chimica. Atacul enzimatic care conduce la biodegradarea surfactantilor are loc la gruparea hidrofoba. In consecinta, pentru surfactantii ionici natura gruparii hidrofile are o importanta minora asupra vitezei de biodegradare. In ceea ce priveste surfactantii neionici de tip etoxilat, viteza de biodegradare scade cu cresterea lungimii gruparii hidrofobe, determinanta pentru caracteristica de biodegradabilitate fiind tot gruparea hidrofoba. Ramificarea catenei alifatice determina scaderea rapida a vitezei de biodegradare. Grupele feniliden intercalate intre catena alifatica si grupele hidrofile incetinesc procesul de degradare.

Biodegradabilitatea surfactantilor a constituit in timp o problema deosebita, motiv pentru care reglementarile europene aparute in ultimii 10 ani, au avut drept scop limitarea utilizarii agentilor de suprafata cu biodegradabilitate redusa si evaluarea compatibilitatii acestora cu mediul inconjurator pe termen lung, luind in considerare rata crescuta a toxicitatii acvatice a detergentilor, mai precis a substantelor active din produsele formulate.

Ultimele reglementari ale U.E. in domeniul detergentilor (Regulamentul European nr. 648/2004/EC si amendamentele sale ulterioare), indica orietarea spre utilizarea de agenti de suprafata, care pot fi usor si total biodegradati (mineralizati) - ultimate biodegradation.

Incepand cu data de 8 octombrie 2005, Noul Regulament european a intrat in vigoare si implicit toate categoriile de agentii de suprafata utilizati ca materie prima in detergentii destinati consumatorilor, trebuie sa indeplineasca conditiile de "biodegradabilitate ultima", practic sa se evidentieze degradarea acestora pana la CO₂ si H₂O (mineralizare). Reglementarile europene anterioare impuneau testarea "biodegradabilitatii primare" a agentilor de suprafata anionici si neionici, practic determinarea concentratiei remanente de surfactant analizat, in solutia supusa biodegradarii.

La nivel national, se fac eforturi remarcabile pentru stabilirea unui cadru administrativ si legislativ pentru implementarea legislatiei europene referitoare la controlul efectiv si supravegherea eficienta a regimului detergentilor, in vederea protejarii sanatatii populatiei si a mediului, motiv pentru care consideram ca trebuie acordata o atentie deosebita dezvoltarii de metodologii care sa permita identificarea efectelor adverse pe care detergentii le pot provoca in cadrul unei componente a mediului inconjurator.

Tendintele actuale sunt de a promova si a asigura libera circulatie pe piata europeana, a produselor cu impact redus asupra mediului, ceea ce se poate realiza eficient, prin introducerea etichetei ecologice, simbol grafic care ajuta consumatorii sa identifice produsele care nu afecteaza mediul iconjurator si implicit sanatatea umana, pe parcursul intregului lor ciclu de viata, de la fabricatie, distributie, utilizare, pana la gestionarea si reciclarea deseurilor.

In contextul activitatii de testare si evaluare a riscurilor pe care agentii de suprafata din compozitia detergentilor le reprezinta pentru mediul inconjurator si implicit pentru sanatatea umana, lucrarea isi propune

realizarea unui numar mare si variat de experimente de laborator in vederea asimilarii si implementarii a metodelor adecvate pentru contolul si testarea substantelor cu structuri diferite din compozitia detergentilor, care necesita tehnici complexe si specifice;

dezvoltarea / verificarea unor metode ecotoxicologice, biologice, histologice si biochimice, care sa permita furnizarea unui complex de date experimentale stiintifice necesare pentru:

evaluarea impactului si a mecanismelor biochimice de actiune, a agentilor de suprafata (in special al celor, cationici si amfoterici) din compozitia detergentilor universali utilizati in activitati menaj;

determinarea caracteristicilor fizico-chimice si ecotoxicologice (biodegradabilitate si toxicitate acvatica) ale surfactantilor continuti in produsele comerciale destinate uzului uman;

     dezvoltarea unei metodologii complexe de evaluare a riscului complementar generat de detergentii comerciali asupra componentei acvatice a mediului, care sa permita:

identificarea tipului si cantitatilor de agenti de suprafata utilizate detergent;

identificarea si informatii privind potentialii metaboliti recalcitranti rezultati in urma aplicarii testelor de biodegradabilitate;

evaluarea toxicitatii letale acute a lichidelor rezultate din testele de biodegradare fata de pesti, daphnia, alge si bacterii;

estimarea capacitatii de biodegradare a principalelor componente organice din compozitia detergentilor comerciali, care nu sunt substante tensioactive;

     imbogatirea bazei de date ecotoxicologice privind agentii de suprafata cationici si amfoterici, avand in vedere faptul ca literatura de specialitate ne pune la dispozitie foarte putine informatii referitoare la acest aspect.

Descrierea substantelor / produselor chimice propuse pentru testare:

Cele mai importante substante chimice din compozitia detergentilor sunt agentii de suprafata (surfactantii), ei incadrindu-se in categoria chimicale HPV (high-production-volume) si fiind responsabili pentru influenta detergentilor asupra factorilor de mediu. Dupa utilizare, detergentii sunt eliminati in apele uzate fara sa sufere modificari structurale, ceea ce face ca agentii de suprafata sa-si pastreze proprietatile superficiale si deci ecotoxicitatea. In sfera notiunii de agenti de suprafata sau agenti superficiali se inglobeaza o mare varietate de compusi chimici care, acumulandu-se la suprafetele de separatie, sunt capabili sa modifice puternic, chiar in concentratii foarte mici, proprietatile superficiale ale lichidelor in care se dizolva. Toate aceste substante chimice prezinta o structura moleculara asimetrica, compusa din doua parti cu proprietati fundamentale diferite: una nepolara sau slab polara (de natura hidrocarbonata) si alta puternic polara (ionizabila sau neionizabila). Partea nepolara este usor insolubila in apa (hidrofoba) si in lichide puternic polare; in schimb, este usor solubila in uleiuri (lipofila) si, in general, in lichide nepolare. Partea polara este hidrofila si deci, lipofoba.

Dupa felul cum disociaza in apa, agentii de suprafata (surfactantii) se clasifica in mai multe grupe, prezentate in continuare:

• Surfactanti anionici, a caror grupare hidrofila are un caracter acid si disociaza in ionul pozitiv (cationul) si ionul negativ (anionul), acesta fiind radicalul tensioactiv al moleculei. Din aceasta clasa fac parte alchilsulfonatii, alchilsulfatii si alchil-aril-sulfonatii, cu lanturi liniare sau ramificate;
• Surfactanti cationici, cu gruparea hidrofila cu caracter bazic, disociaza in ionul pozitiv, care reprezinta radicalul tensioactiv si in ionul negativ; din aceasta clasa fac parte saruri si baze cu azot cuaternar, amine, saruri de sulfoniu, saruri de fosfoniu;
• Surfactanti amfoterici (amfolitici), a caror grupare hidrofila este atat acida, cat si bazica, in solutie apoasa reactionand fie ca agent de suprafata anionic, fie cationic, in functie de pH; aceasta clasa cuprinde: polipeptide, acizi aminosulfonici si sarurile lor;
• Surfactanti neionici, a caror grupare hidrofila nu disociaza in apa. Clasa agentilor neionici cuprinde: esteri ai acizilor grasi cu alcoli si polialcooli, monogliceride ale acizilor grasi, esteri ai acizilor grasi cu poligliceride.

In cadrul lucrarii, o atentie deosebita va fi acordata surfactantilor cationici, utilizati frecvent in fabricarea detergentilor de rufe, vase si a balsamurilor, precum si surfactantilor amfoterici, folositi la fabricarea produselor pentru ingrijire personala (adica sampon si balsam pentru par, sapun lichid si lotiuni de curatare) si in industria agentilor de curatare, deoarece:

controlul agentilor de suprafata cationici si amfoterici nu a fost legiferat pana la aparitia Regulamentului European, datorita inexistentei unei metode-standard - norma europeana EN sau internationala ISO sau metoda asociata unei directive europene pentru determinarea chimica cantitativa a acestor categorii de substante active;

pana la nivelul anului 2004, nu a existat nici pe plan european, nici la nivel national, o metoda-standard sau asociata unei directive pentru testarea biodegradabilitatii agentilor de suprafata cationici si/sau amfoterici, desi existau reglementari privind gradul minim de biodegradabilitate acceptat pentru aceste tipuri de substante active utilizate in compozitia detergentilor comerciali. In literatura de specialitate sunt relativ reduse referintele privind caracterizarea ecotoxicologica a agentilor ce suprafata cationici si amfoterici.

Metode / tehnici analitice si Bioteste aplicate pentru determinarea ecotoxicitatii surfactantilor din detergentii comerciali si identificarea efectelor adverse pe care detergentii le pot provoca in mediul acvatic, pe baza unei metodologii de evaluare a riscului complementar

v    Metode analitice performante pentru identificarea tipurilor si concentratiilor de agenti de suprafata utilizati in detergentii comerciali:

metode spectrometrice de analiza chimica cantitativa a agentilor de suprafata din detergentii comerciali, in conformitate cu Anexa II a Regulamentului European nr.648/2004

metode potentiometrice pentru determinarea continutului de agenti de suprafata din solutii apoase, conform referintelor din literatura de specialitate;

metode cromatografice pentru determinarea concentratiilor remanenete de surfactanti din solutiile nutritive supuse biodegradarii aerobe / anaerobe, conform referintelor din literatura de specialitate.

v    Metode ecotoxicologice aplicate pentru determinarea biodegradabilitatii aerobe:

   Testul de confirmare OECD conform Regulament European CE 648/2004 - (Metoda de referinta descrisa in Anexa VIII.1 a Regulamentului), pe baza careia se determina biodegradabilitatea aeroba primara a surfactantilor anionici, neionici, cationici si/sau amfoterici intr-o instalatie micropilot de laborator, alimentata in flux continuu cu o solutie nutritiva a produsului de testat.

   Metode OECD indicate in Directiva 67/548/CEE si/sau norme internationale EN/ISO pe baza carora se evalueaza biodegradabilitatea ultima (mineralizarea) agentilor de suprafata, in conformitate cu Anexa III a Regulamentului European CE 648/2004 si respectiv Anexa I a Regulamentului CE 907/2006.

Metoda de referinta specificata pentru testarea in laborator a mineralizarii agentilor de suprafata este standardul international EN ISO 14593 : 1999 - Evaluarea biodegradabilitatii aerobe finale a compusilor organici in mediu apos. - Metoda de analiza a carbonului anorganic din vase sigilate (testul headspace CO₂)

De asemenea, se pot aplica in laborator:

Metoda din Directiva 67/548/CEE anexa V.C.4-C [Degajarea bioxidului de carbon (CO₂) - testul Sturm modificat)];

Metoda din Directiva 67/548/CEE anexa V.C.4-E [Testul in sticla inchisa] -similara cu standardul SR EN ISO 10707:2001 - Calitatea apei. Evaluarea in mediul apos a biodegradabilitatii aerobe "ultime" a compusilor organici. Metoda prin analiza consumului biochimic de oxigen (CBO₅ Method - test in fiola inchisa);

Metoda din Directiva 67/548/CEE anexa V.C.4-D (Respirometrie manometrica);

Metoda din Directiva 67/548/CEE anexa V.C.4-A [Disparitia carbonului organic dizolvat (COD)] - similara cu standardul SR EN ISO 7827/2001- determinarea biodegradabiltatii usoare in prezenta microorganismelor namolului activ; perioada de testare-28 zile, indicator urmarit: indepartarea COD, se determina nivelul ultim de biodegradare (% COD) si timp de biodegradare;

v    Metode ecotoxicologice OECD indicate in Directiva 67/548/CEE si/sau norme internationale EN/ISO, pe baza carora se evalueaza biodegradabilitatea anaeroba a agentilor de suprafata:

ISO 11734 WATER QUALITY - Evaluation of the ultimate anaerobic biodegradability of organic compounds digested in sludge - method by measurement of the biogas production ;

OECD 311 pentru determinarea biodegradabilitatii ultime a agentilor de suprafata.

v    Metode ecotoxicologice OECD indicate in Directiva 67/548/CEE si/sau norme europene pentru controlul toxicitatii lichidelor rezultate din testele de biodegradare

     Metoda OECD 203 similara cu testul recomandat de Directiva 67/548/CEE AnexaV.C.1 - testul de toxicitate letala acuta cu pesti dulcicoli

     Metoda OECD 202 similara cu testul recomandat de Directiva 67/548/CEE AnexaV.C.2 - testul de imobilizare acuta cu purici de apa Daphnia magna Status

     Metoda OECD 201 similara cu testul recomandat de Directiva 67/548/CEE anexaV.C.3 - test de inhibitie acuta microalge verzi, specia Selenastrum capricornutum (denumire actuala: Raphidocelis subcapitata sau Pseudokirchneriella subcapitata

     Metoda descrisa de standardul DIN EN ISO 11348-3 similara cu testul recomandat de Directiva 67/548/CEE Anexa V.C.11 - test de inhibitie acuta cu bacterii luminiscente Vibrio fischeri

In efluenti instalatiei de biodegradabilitate a substantelor / produselor luate in studiu, se va determina analitic sau biochimic concentratia radicalilor liberi continuti (ioni superoxid, ioni hidroxil, etc.) pentru a se evidentia un potential efect de stres oxidativ la nivelul formatiunilor fiziologice ale organismelor acvatice. Pentru acest tip de determinare se vor aplica:

a) metoda spectrofotometrica - este cea mai veche metoda, adesea indispensabila identificarii unui radical liber din mai multe posibilitati de formare, utilizand reactivi specifici; metoda se bazeaza pe cuantificarea efectului de inhibitie pe care un radical liber il exercita fata de maximul de absorbtie al reactivilor specifici utilizati;

b) chemiluminiscenta - insoteste de multe ori reactii sau procese generatoare de radicali liberi.

Pentru a identifica efectul pe termen lung al surfactantilor continuti in detergentii comerciali asupra organismelor acvatice - pesti se vor realiza:

v    Bioteste de toxicitate acvatica

     Teste de toxicitate letala acuta (SR 13126/1994)

Determinarea concentratiei letale medii care omoara 50% din organismele testate (pesti) - Testul CL₅₀    

     Teste de toxicitate subacuta

Procedura specifica pe baza careia se estimeaza valorile maxim admisibile in apa - Determinare MATC estimativ

     Teste de toxicitate cronica

Procedura specifica pe baza careia se determina experimental valorile maxime admisibile in apa - Determinare MATC experimental

     Bioconcentrare: test pe pesti prin metoda continua - Directiva 98/73/EC, metoda C13, ghid OECD 305

Pestii supravietuitori, in urma experimentelor de toxicitate acvatica, vor fi sacrificati pentru evaluarea efectelor adverse induse de surfactanti, prin aplicarea de

v    Metode biochimice:

De la organismele acvatice (pesti) intoxicate se vor preleva, prin disectie, diferite organe: ficat, branhii, rinichi, intestin, muschi alb, muschi rosu si creier. Se vor realiza dozari enzimatice pe extractele proteice obtinute din aceste organe, in conformitate cu urmatoarele metode de analiza biochimica:

     Metoda LOWRY pentru determinarea concentratiei proteice. Dozarea proteinelor se bazeaza pe formarea unui complex cupric cand proteina reactioneaza cu un reactiv alcalin de cupru (reactia biuretului) si pe reducerea fosfomolibdatilor si fosfowolframatilor din reactivul Folin-Ciocalteu de catre compusii fenolici din proteina.

     Metoda Beer si Sizer de dozarea a activitatii catalazice. Mersul reactiei enzimatice este urmarit spectrofotometric, la 240nm, prin disparitia peroxidului de hidrogen din mediu. O unitate enzimatica descompune un mol de H₂O₂ intr-un minut la 25^oC si la pH 7.

     Metoda de dozare enzimatica a MnSOD si CuZnSOD- presupune determinare a SOD (la 450nm) prin utilizarea unei sari de tetrazolium pentru detectia radicalilor superoxid generati de xantin oxidaza sau de hipoxantina.

     Metoda de determinare a activitatii glutation peroxidazei. Pentru determinarea activitatii GPx, proba cu activiatate glutation peroxidazica este adaugata intr-o solutie ce contine GSH, Glutation reductaza si NADPH. Reactia este initiata prin adaugarea unui peroxid organic (tert - Butil Hidroperoxid), dupa care se inregistreaza absorbanta la 340 nm. Rata de descrestere a absorbantelor este direct proportionala cu activitatea GPx a probei.

     Metoda de determinare activitatii enzimatice a Glutaton-S-transferazei. Activitatea totala a GST (microsomala si citosolica) se determina prin masurarea ratei de conjugare a 1-cloro-2,4-dinitrobenzenului (CDNB) (substrat electrofil) cu glutationul redus. Conjugarea este insotita de o crestere in absorbanta la 340nm. Rata de cresterea a absorbantei este direct proportionala cu activitatea GST din proba

     Metoda Lohr si Waller de determinare a activitatii enzimatice a Glutation-6-fosfat transferazei. Activitatea G6PD este direct proportionala cu rata formarii NADPH pe baza extinctiei la 340nm.

     LiquiUV tests pentru determinarea tranzaminazelor hepatice (GOT s GPT) se bazeaza pep e utilizarea 2-oxoglutaratului ca substrat si a unor solutii de tampon TRIS (pH 7.5) cu continut de L- alanina sau L-aspartat.

     Metoda de determinarea Lactat dehidrogenazei. L-lactat: NAD⁺ oxidoreductaza catalizeaza reactia reversibila:

CH₃-CO-COOH +NADH + H⁺ ↔ CH₃-CHOH-COOH + NAD⁺

Viteza de reactie este determinata prin scaderea D.O. la 340nm ca urmare a oxidarii NADH (compusul care absoarbe la 340nm este NADH, NAD⁺ nu absoarbe).

In vederea stabilirii mecanismelor de actiune si a modului de metaborizare a compusilor studiati se vor efectua experimentari privind:

peroxidarea lipidica determinarea concentratie de malondialdehidei (MDA) si 4 hidroxinonenal proteinei,

efectul asupra proteinele Hsp (Hsp 27 si Hsp 70) utilizand tehnica Real Time PCR cu primer specifici organismeor acvatici

fragmentare ADN

v    Metode Histologice

Impactul lucrarii asupra mediului:

     Metodele de analiza chimica cantitativa a agentilor de suprafata vor fi utilizate in:

controlul / monitorizarea calitatii ecosistemelor acvatice prin determinarea concentratiilor de agenti de suprafata existente in apa, si prevenirea poluarii apelor de suprafata sau a panzei freatice;

controlul produselor care circula pe piata, astfel incat sa se asigure protectia sanatatii umane si a mediului inconjurator;

     Metodele ecotoxicologice aplicate pentru determinarea biodegradabilitatii agentilor de suprafata vor permite producatorilor / importatorilor de detergenti si produse de curatat sa realizeze controlul, testarea si evaluarea conformitatii produselor comerciale fabricate pe baza de surfactanti. Functie de rezultatele obtinute in testele de biodegradabilitate se vor lua decizii privind libera circulatie a produselor comerciale sau dimpotriva, restrictionarea si interzicerea comercializarii lor.

     Biotestele de toxicitate acvatica, metodele biochimice si histologice vor permite obtinerea bazei de date necesara pentru evaluarea riscului generat asupra componentei acvatice a mediului, ceea ce va determina:

protectia calitatii mediului si a vietii prin asigurarea liberei circulatii si utilizarea pe piata a detergentilor comerciali, fara efecte nocive si care prezinta siguranta pentru sanatatea umana si mediul inconjurator;

conservarea resurselor naturale de apa, ale solului si subsolului;

protejarea starii de sanatate a populatiei prin cunoasterea exacta a efectelor toxice / nocive pe care detergentii comerciali le exercita asupra mediului si implicit asupra omului si reducerea riscului de contaminare / imbolnavire prin aplicarea masurilor de securitate adecvata;

identificarea acelor produse comerciale cu impact redus asupra mediului inconjurator (in conformitate cu datele ecotoxicologice), care pot fi lansate liber pe piata, in conditii depline de securitate fata de mediu si sanatatea umana;

satisfacerea solicitarilor de testare venite din partea producatorilor / importatorilor /distribuitorilor de detergenti si /sau autoritatilor responsabile la nivel national de controlul si libera circulatie pe piata a acestora.

Potentiali beneficiari ai rezultatelor:

Universitatea Bucuresti - Facultatea de Biologie

Institutul National de Cercetare Dezvoltare pentru Ecologie Industriala (INCD ECOIND)

Agenti comerciali producatori / importatori de produse de curatat/ detergenti, care isi pot verifica calitatea produselor pe care le fabrica / comercializeaza si continutul de substanta tensioactiva din compozitia detergentilor comerciali in vederea elaborarii fiselor de securitate, inregistrarii produselor si asigurarii unei circulatii controlate pe piata UE.