Notiuni generale de biotehnologie

Biotehnologie

Bios - viata - biologie

Tehnologie - studiul tehnic al utilajelor, masinilor, materialelor

Federatia Europeana de Biologie (1978)

Utilizarea integrata a biochimiei, microbiologiei si ingineriei in scopul obtinerii unei aplicatii tehnologice (industriale) cu ajutorul microorganismelor, culturilor de celule si a partilor componente ale acestora

Orice manipulare a viului in folosul societatii inseamna biotehnologie

Evolutia

Biotehnologii primare, de generatia I

procedee clasice

extractiile

fermentatiile

biotehnologii de generatia II

utilizeaza metabolismul normal al unor microorganiosme nemodificate pentru obtinerea unor compusi

antibioticele

biotehnologii de generatia III, genetice

inginerie genetica

Se poate dezvolta la nivel de

laborator - caracter de cercetare fundamentala

industrial - caracter aplicativ

clasificarea diferitelor tipuri de biotehnologii in functie de

tipul de celule cu care se lucreaza - biotehnologii

microbiene

vegetale

animale

domeniul in care isi gasesc aplicatii produsele

biotehnologii industriale

farmaceutice

producerea de biomasa proteica

biosinteza antibioticelor

productia de acizi organici

aminoacizi

probiotice

polizaharide

hormoni

vitamine

alimentare

procedee industriale de prelucrare

legume

fructe

lapte

produse lactate

carne

aspecte fermentative ale acestora

depoluante

epurarea biologica a

apelor uzate (poluate)

aerului

solurilor degradate

extractia minereurilor cu ajutorul microorganismelor

biotehnologii agricole

vegetale

rezistenta plantelor la atacul factorilor patogeni

toleranta fata de factorii de mediu defavorabili

multiplicarea speciilor horticole

obtinerea de noi hibrizi sexuati

animale

in zootehnie

nutritia animala

cresterea rezistentei animalelor la atacul factorilor patogeni

reproductia artificiala

predeterminarea sexului la animale

conservarea resurselor genetice animale

medical-veterinare

crearea unor sisteme de diagnostic rapid al

maladiilor

dereglarilor functionale

sisteme biologice de combatere a bolilor

anticorpi monoclonali

vaccinuri

bacterii antagoniste

Cultivarea microorganismelor in instalatii industriale specializate, performante determina

Asigurarea de conditii optime de

Crestere

Dezvoltare

Biosinteza a metabolitilor doriti

Acumularea preferentiala a unui anumit metabolit necesita

Cresterea si dezvoltarea microorganismelor

Condusa

Reglata

Etapele elaborarii tehnologiilor de biosinteza

cuprinde mai multe faze

Laborator

Micropilot

Statii pilot

Productie industriala

Faza de laborator cuprinde 2 etape

Etapa I

Izolarea, selectarea si testarea microorganismului producator

Tehnici specifice pentru fiecare microorganism

Metode folosite pentru izolarea si testarea microorganismului

Tehnica dilutiilor

Microorganismele

preluate din diferite habitate

cultivate pe medii

solide

lichide

initial se urmareste realizarea unei culturi pure

tehnici microbiologice specifice

epuizarea ansei

dilutii succesive

apoi se stabileste o metoda de triere (screening)

microorganismul cultivat pe placi Petri pe medii de agar-agar

se fac teste de identificare

calitative

cantitative

De ex. - Enzime

includerea substratului specific pentru enzima dorita

amidon/amilaze

cazeina/proteaze

celuloza/celulaza

enzimele difuzeaza in gelul de agar-agar

daca nu se poate aplica un test calitativ

coloniile izolate se cultiva pe medii specifice

extractul (lichidul) de biosinteza

prelevat

prelucrat

dozarea compusului

spectrofotometric

fluorimetric

tritrimetric

polarimetric

se retin numai cateva tulpini care au dat cele mai bune rezultate

Intretinerea culturilor producatoare

lucrari de caracterizare a microorganismului dupa criterii

morfologice

biochimice

fiziologice

imunologice

toxicologice

inregistrarea tulpinii

intr-o colectie de microorganisme

sub un numar de identificare

Selectia unui mutant inalt producator

Lucrari de selectie

Naturala

Artificiala (mutageneza)

Conservarea

Tulpini parentale

Tulpini mutante

Prin

metode speciale

la temperaturi scazute

Liofilizarea

Conservarea in azot lichid

Cultura stoc

Cultura de la care se porneste procesul de biosinteza

Tulpinile din colectie utilizate in lucrarile de biosinteza

Metodele de intretinere a culturilor sunt specifice fiecarui microorganism

Conditii de pastrare

La frigider

Pe geloza nutritiva

In tub inclinat

punctul de plecare pentru prepararea unei culturi inocul de laborator

cultura inocul

constituie

cultura microbiana in curs de multiplicare

materialul de insamantare a mediului de biosinteza in etapa urmatoare

conditii de dezvoltare

format pe un substrat nutritiv corespunzator

pH

Temperatura

Agitare

Aerare

Transvazarea inoculului

In mediul de biosinteza

Conditii aseptice

Dupa o perioada de dezvoltare bine stabilita si definita prin

Varsta

Cantitate

Aspect microscopic

Aparatura

Placi Petri

Tuburi test

Flacoane Ehrlenmeyer

Faza de laborator

Etapa a II-a

Stabilirea parametrilor optimi de cultivare

Mediul de cultura

pH

Temperatura

Agitare

Aerare

Aparatura

Flacoane Ehrlenmeyer

Agitatoare rotative

Faza de micropilot

stabilirea conditiilor de cultivare

pH

temperatura

consum de O dizolvat

turatie

debit de aer

aparatura

bioreactor de laborator - 10 L

Faza de statie pilot

A - stabilirea parametrilor

de cultura

biosinteza

aparatura

instalatii de capacitate medie

bioreactoare 100 - 1000 L

B - stabilirea conditiilor de lucru la nivel semiindustrial

aparatura

bioreactoare 5000 - 10.000 L

sterilizarea

precede operatiile de insamantare - vitamina C

aparaturii

mediului

mediul de cultura

sterilizat

racit la temperatura optima de cultivare

cultura intermediara

treapta intermediara de cultivare

apare atunci cand raportul de inoculare

cantitatea de inocul/cantitatea de mediu de fermentatie

nu permite pregatirea culturii inocul in laborator

moduri de cultivare

A - culturi de suprafata

B - submers

mediu lichid

agitat

aerat

adoptat

in functie de fiziologia producatorului

rentabilitate

Productia industriala

initial -    faza experimentala industriala

apoi obtinerea industriala a medicamentelor

bioreactoare 10.000 - 100.000 L

Procedee de biosinteza

conditiile proceselor de biosinteza pot fi

oxibiotice (aerobe)

anoxibiotice (anaerobe) - fermentative

termenul de fermentatie s-a extins si la procesele oxibiotice

procesele de biosinteza ≡ bioproces

criterii de clasificare a bioproceselor

felul culturii

de suprafata

submers

tipul de operare

omogen/ heterogen

discontinuu/continuu

modul de transformare al componentelor nutritive ale mediului

simple

simultane

consecutive

Bioprocese in culturi de suprafata

suport

solid

semisolid

culturi solide

microorganismele se dezvolta

pe suprafata

in interiorul mediului

culturi semisolide

microorganismele se dezvolta in toata masa mediului

Bioprocese in culturi submerse

instalatii pentru asigurarea

amestecarii perfecte a componentelor mediului de biosinteza

solide

lichide

gazoase

alimentarea adecvata cu aer

aparatura de masura si control

utilaje speciale - bioreactoare

avantaje

se preteaza la automatizari

economie de spatiu

o buna amestecare si aerare a mediului

conditii optime pentru microorganisme

randamente ridicate

cel mai utilizat pentru

aminoacizi

proteine

enzime

sisteme industriale

discontinui (sarje)

continui

productivitate mare

aparte de capacitati mici - pastreaza mai bine parametrii optimi

tipul de operare

sistemele omogene

compozitia mediului este uniforma pe tot parcursul bioprocesului

sistem este monofazic

microorganismele sistemului au aceeasi stare fiziologica (stadiu de dezvoltare)

sistemele heterogene

compozitia mediului de fermentatie are gradiente de celule sau de substrat

sisteme

monofazice

multifazice

lichid/lichid

lichid/gaz

microorganismele

expuse la diferite conditii de mediu

diferite stari fiziologice (diferite stadii de dezvoltare)

tipul de operare

bioprocese inchise

celulele microbiene mentinute in totalitate in sistem

nu pot atinge o stare stationara

bioprocese deschise

celulele trec continuu in efluent

celulele parasesc sistemul in rata in care se formeaza

rezulta ca se gasesc in stare stationara

tipul de operare

sistem continuu de operare

deschis

omogen

cu un stadiu

cu mai multe stadii

heterogen

cu un stadiu

cu mai multe stadii

mixt

inchis

omogen

heterogen

mixt

modul de transformare al componentelor nutritive ale mediului

procese simple

componentele nutritive se transforma stoechiometric in produse de reactie

fara acumulare de intermediari in mediu

procese simultane

componentele nutritive se transforma in diferite proportii stoechiometrice

fara acumulare de intermediari in mediu

procese consecutive

componentele nutritive se transforma cu acumulare de intermediari

procese desfasurate in etape

componentele nutritive se transforma in intermediari si apoi in produsi de reactie

Microorganisme utilizate in biotehnologie

microorganismele

diversitate

morfologica

activitate biologica

pozitie sistematica

caractere comune

dimensiuni microscopice

organizare micelara (in general)

structura interna relativ simpla

grup format din

bacterii

drojdii

fungi

alge microscopice

protozoare

Bacteriile

organizare celulara

de tip procariot

unicelular

perete celular rigid

ac. Mureinic

ac. Teichoic

ac. Diaminopimelic

multiplicare prin diviziune directa

mare variabilitate explicata prin

fenomene

de recombinari genetice

mutatii

Levurile (drojdiile)

fungi microscopici

unicelulari

organizare celulara de tip eucariot

dimensiuni mari

aspect

monoforme

sferice

ovale

alungite

dimorfe

polimorfe

perete celular

gros

format din

polizaharide

glucani

manani

nucleu

bine definit

inconjurat de o membrana nucleara tipica

reproducerea

asexuata

inmugurire

diviziune

sexuata

prin conjugarea a doua celule sexuale

putine ca numar (350 de specii)

importante datorita numeroaselor utilizari practice, industriale

Fungii filamentosi

microorganisme eucariote

metabolism de tip chimiorganotrof

corp - hife - miceliu

filamente

tubulare

microscopice

lungi

subtiri

perete celular

semirigid

chitina asociata cu celuloza

reproducerea

spori asexuati

formati prin derivare din celule vegetative

sporangiospori

conidiospori

spori sexuati

rezultati din incrucisarea intre 2 celule polarizate sexual

ascospori

Metabolismul microbian

totalitatea reactiilor biologice implicate in activitatea biologica prin intermediul carora energia, elementele de mediu nutritiv sunt utilizate pentru biosinteze, crestere si alte activitati celulare;

cai metabolice

catabolism

reactii exergonice (elibereaza energie)

furnizeaza energie    - ATP

anabolism

reactii endergonice (consum de energie)

sinteza de noi constituenti prin folosirea energiei stocate din primul proces

bioelemente

majore

conc. mari

10^-4 M

C, O, H, N, S, P, K, Mg, Ca

Minore

Cantitati foarte mici

Zn, Mn, Mo, Co, Cu, W

Tipuri de metabolism dupa natura sursei de energie

Microorganisme fototrofe - energia radianta

Microorganisme chimiotrofe - energia din reactii chimice oxidative la intuneric

Capacitatea de a biosintetiza metaboliti esentiali

Autotrofe

Au capacitatea de a sintetiza toti constituentii celulari

pornind de la surse anorganice simple

de C - CO₂,

de azot - NH₃

Heterotrofe

incapabile de a sintetiza metabolitii esentiali

necesara adaugarea lor in mediu ca

substante organice

anorganice

necesara   

o sursa de C

hidrati de C

acizi organici

o sursa de N

aminoacizi

proteine

saruri anorganice de amoniu

biotehnologie - heterotrofe

factori de crestere

Andr Lwoff

Substante necesare pentru dezvoltarea microorganismelor

substante pe care un organism este incapabil sa le sintetizeze

in absenta carora multiplicarea este imposibila

aminoacizi naturali care intra in compozitia proteinelor

bazele purinice

bazele pirimidinice

vitaminele hidrosolubile - B

METABOLISMUL ENERGETIC LA MICROORGANISME

Energia obtinuta din reactiile metabolismului energetic este necesara activitatii biologice

Transport prin membrane

Respiratie

Biosinteza

Energia microorganismelor heterotrofe provine din degradarea unor substante organice adaugate in mediul de cultura ca sursa de carbon

3 faze de eliberare a energiei in procesul de catabolism

macromoleculele organice sunt descompuse la unitatile lor cu eliberarea a 1% din energia inglobata

proteinele - aminoacizi

grasimile - glicerol si ac. grasi

glucidele - monozaharide

moleculele rezultate din prima faza sunt degradate pana la produsi mai mici + CO₂ + H₂O cu eliberarea a 1/3 din energia lor totala

intermediari ai cailor metabolice

a 3-a faza este diferita pentru diferitele tipuri de microorganisme

microorganisme care pot descompune integral substantele nutritive pana la CO₂ si H₂O pe calea acizilor tricarboxilici

microorganisme care realizeaza numai o descompunere partiala a substratului nutritiv cu formare de produsi intermediari servind ca acceptori, donori de electroni

se obtin astfel diversi produsi (fermentatie)

compusii glucidici reprezinta sursa cea mai cunoscuta de energie

degradare pe calea Ebden-Meyerhof-Parnas cu

formarea a 2 molecule de ac. piruvic

eliberarea a 2 molecule de ATP

ac. piruvic

transformat in acetil-coenzima care intra in ciclul lui Krebs

se elibereaza 4 perechi de electroni care pot intra in lantul respirator

Bacterii - lantul respirator este asociat cu

membrana plasmatica

mezozomi

eucariote - sediul respiratiei in mitocondrii

energia

inmagazinata in ATP

folosita la nevoie

in functie de acceptorul final de electroni

respiratia aeroba (oxibiotica) - Oxigenul

respiratia anaeroba (anoxibiotica) - compus organic

fermentatia - compusii organici functioneaza ca donor si acceptor e

in functie de comportarea fata de Oxigenul molecular

microorganisme strict (obligatoriu) aerobe

oxigenul este acceptor final de H

au nevoie permanent de oxigenul atmosferic

dispun de citocromi

enzime

peroxidaze

catalaza

superoxid dismuataza

microorganisme strict (obligatoriu) anaerobe

nu se pot dezvolta in prezenta oxigenului molecular

nu au echipamentul enzimatic al celor aerobe

microorganisme aerobe facultativ anaerobe

cele mai numeroase

isi orienteaza metabolismul spre respiratie (fermentatie) in functie de prezenta (absenta) Oxigenului

microorganisme microaerofile

au nevoie de o cantitate de Oxigen mai mica decat din aerul atmosferic

metabolitii formati - produsii obtinuti prin biosinteza

metaboliti primari

formati in faza de crestere exponentiala

rezultat al metabolismului oxidativ (fermentativ)

alcooli primari (simpli)

acizi

aldehide

CO₂

H

CH₄

Metaboliti secundari

Substante chimice complexe

La inceputul fazei stationare de crestere

Uneori produse in cantitati foarte mari

Nu au functie metabolica evidenta

Antibiotice

Enzime

Vitamine

Sintetizati

pe seama constituentilor cu masa moleculara mica

pentru a indeparta din mediu compusii mici care le-ar periclita viata

Datorati

existentei unor inductori

epuizarii unor represori

Medii de cultura

Suporturi nutritive sterilizate

Permit dezvoltarea unui microorganism in afara nisei sale ecologice naturale

Importante pentru

Reproductibilitate

Eficienta

Criterii de clasificare

Consistenta

Lichide

Solide

Semisolide

Compozitie

Naturale

Elemente nutritive

Vegetale

Animale

Pot contine

Subproduse agroalimentare

Srot de floarea soarelui

Faina de porumb

Tarate de grau

Extract de porumb

Completate cu mici cantitati de saruri minerale

Avantaje

Mai ieftine

Dezavantaje

Nu permite

Standardizarea

Reproducerea procesului cu un randament constant

Sintetice

Reproductibile la scara industriala

Numai compusi

cu structura chimica cunoscuta

care pot fi dozati

Tipul de respiratie al microorganismelor

aerobe

anaerobe

Scopul si frecventa

de uz curent

medii speciale pentru studiile de izolare la nivel de laborator

elective

selective

de imbogatire

de conservare

de identificare

Faza de biosinteza la care este folosit

laborator

pilot

industrial

Destinatia finala

pentru cultura inocul

cultura de regim (medii de fermentatie, de biosinteza)

trebuie sa contina

sursa de carbon - carbohidrati

sursa principala de energie

regleaza necesarul de O si H

glucoza

amidon

fructoza

zaharoza

sursa de azot

organic

aminoacizi

proteine

uree

anorganic

amoniac

sulfat de amoniu

sursa de fosfor

acid fosforic

fosfat de amoniu

fosfat acid de potasiu

oligoelemente

potasiu

clorura de potasiu

fosfat acid de potasiu

magneziu

sulfat de magneziu

fier

clorura ferica

factori de crestere

aminoacizi

proteine

vitamine

coenzime

precursori

portiuni structurale ale moleculei produsului biosintetizat

sursa de carbon

exista o valoare a concentratiei elementelor necesare dezvoltarii nerestrictive

definita de Peppler, Harrison, 1970

Cinetica proceselor de biosinteza

Cresterea si multiplicarea microorganismelor

Procesul de crestere

se desfasoara

prin sinteza specifica echilibrata a constituentilor celulari

pornind de la substante nutritive simple aflate in mediu

controlat genetic

depinde de

substante nutritive

natura

concentratia

asigurarea cu energie

marirea volumului celular prin

sinteza de substante organice

marirea continutului in apa

cresterea se intrerupe la momentul producerii diviziunii celulare

raport intre volumul celulei/suprafata celulei

suprafata creste cu o ratie patratica

volumul creste cu o ratie cubica

raportul atinge un punct critic - diviziunea celulara

multiplicarea celulelor

pluricelulare - marirea taliei individului

unicelulare - cresterea numarului de indivizi

viteza de multiplicare

durata unei generatii - 20-30 min.

tipica pentru fiecare specie

variaza in functie de conditiile de mediu

Dinamica multiplicarii bacteriilor

procesul multiplicarii populatiei bacteriene cuprinde mai multe faze

faza de latenta (lag)

intre

momentul introducerii germenului in mediul de cultura (inoculare)

momentul in care celulele acestuia incep sa se multiplice

nr. bacteriilor din inocul

raman neschimbate

scad temporar

cultura nu este vizibila la microscop

bacteriile acumuleaza in celula

metaboliti esentiali

sisteme enzimatice necesare cresterii

perioada de adaptare la noile conditii de cultivare (de viata)

mediu nutritiv

temperatura

pH

aeratie

timp

cateva ore

mai scurt cu cat noul mediu este mai apropiat de cel vechi

transvazarea inoculului

prima situatie

inoculul provine dintr-o cultura aflata in curs de multiplicare

mediu nutritiv cu aceeasi compozitie

isi pastreaza ritmul rapid de dezvoltare

cazul

transvazarii inoculului in intermediar

pentru obtinerea unor cantitati mai mari de inocul

a doua situatie

inoculul provine dintr-o cultura aflata in curs de multiplicare

mediu nutritiv cu alta compozitie

perioada de adaptare

crestere neevidenta de la inceput

faza de multiplicare exponentiala (crestere logaritmica)

precedata de o perioada scurta (cca. 2h)

accelerare a ritmului de crestere

multiplicarea se produce cu o viteza progresiva marita

diviziunile sunt sincronizate

nr. celulelor

se dubleaza brusc

la intervale de timp regulate

progresie geometrica

crestere exponentiala

scurt timp - 2-3 ore

tendinta de multiplicare rapida scade progresiv

epuizarea substantelor nutritive

acumularea de produse de catabolism cu efect inhibitor

celulele de tip embrionar

dimensiuni mai mari

citoplasma

mai omogena

nu contine materiale de rezerva

afinitate pentru colorantii bazici

continut ridicat de ARN

cele mai potrivite pentru lucrari de genetica

perioada de post-lag

spre sfarsitul fazei de multiplicare logaritmica

incetinirea

desincronizarea cresterii populatiei

acum sunt amorsate biosintezele in culturi continui

faza stationara maxima

numarul celulelor viabile

maxim

ramane constant

ore - cateva zile

insotita de

epuizarea substantelor nutritive

acumularea unor produsi toxici

celulele nu se mai multiplica

faza de declin

scaderea progresiva a numarului celulelor viabile

celule

batrane

cu fenomene de involutie

in unele cazuri fenomene de autoliza

metode de apreciere a cresterii unui microorganism

determinarea substantelor uscate a masei celulare

determinarea conc. sursei de carbon din mediu

determinarea nr. total de celule, cu ajutorul celulelor de numarat

determinarea gradului de turbiditate a suspensiei bacteriene in functie de timp

Dinamica procesului de crestere la fungi

cresc sub forma de colonii

miceliu 10-15 m

se poate pleca de la

inocul de spori

fragment micelian

mai multe faze

faza initiala de lag

cateva ore

germinarea sporilor (inoculare cu suspensie de spori)

regenerarea hifelor rupte si lezate (inocul vegetativ)

faza de crestere liniara

pe suprafata mediului apare o colonie

circulara

creste liniar cu timpul

forma unei retele fine de hife

faza de invechire

incetinirea vitezei de crestere

efectul daunator al produsilor de metabolism

mai repede in cazul mediilor mai bogate in substante nutritive

Variatia concentratiei componentelor mediului de biosinteza

au fost elaborate modele matematice in scopul reprezentarii cat mai apropiate de realitate a cineticii de desfasurare a unui proces de biosinteza

Mono, Komo, Verhoft

Descriu ecuatia variatiei in timp a concentratiei de celule in mediul de biosinteza

Variatia vitezei specifice de dezvoltare respecta in acest caz cinetica Michaelis-Menten

Viteza specifica de dezvoltare depinde de concentratia unui component din mediul de cultura cu rol limitativ

Elementul limitativ

Sursa de carbon (glucoza)

Sursa de azot (aminoacidul esential)

Pe baza ecuatiei variatia vitezei specifice de dezvoltare se poate calcula timpul necesar dublarii concentratiei de celule microbiene

Viteza specifica de dezvoltare calculata este mai mare decat cea reala

Variatia in timp a concentratiei de microorganisme este supusa efectelor

inhibitorii

ale substratului

ale produsului finit

efecte exercitate de mai multe substante

de inductie

de represie

modelarea proceselor metabolice

urmareste obtinerea de

biomasa celulara

metaboliti

prin

viteza de dezvoltare a microorganismelor

concentratia de microorganisme

stadiul culturii de microorganisme

folosirea particularitatilor proprii ale culturii

Influenta factorilor de mediu asupra cresterii microorganismelor

factori de mediu

conc. substratului

calitatea si cantitatea inoculului

temperatura

pH-ul mediului de biosinteza

agitarea

concentratia oxigenului dizolvat

Influenta concentratiei substratului asupra cineticii dezvoltarii microbiene

Marirea conc. de substrat din mediu determina cresterea nr. celule microbiene pana la o limita

Fenomen subordonat actiunii inhibitorilor

Inhibitorii actioneaza prin

Modificarea potentialului chimic al

Substratului

Intermediarilor metabolici

Produsului finit

Modificarea permeabilitatii peretelui celular cu reducerea transportului substantelor nutritive

Modificarea activitatii enzimelor metabolice

Disocierea agregatelor metabolice

Modificarea parametrilor functionali

Capacitatea de reproducere

Mobilitatea

Biosinteza unor metaboliti

Mecanismele inhibitiei

Reactie chimica cu una sau mai multe componente celulare

Adsorbtia (complexarea) de enzime (coenzime)

Interventia in secvente ale reactiilor biochimice

Interventia in disocierea complexelor enzimatice

Modificarea parametrilor fizico-chimici ai mediului de biosinteza

pH

tarie ionica

constanta dielectrica

capacitatea de solvatare

interventia in functiile celulare de control

concentratia optima de substrat in momentul initial si pe parcurs

conc. inhibitoare a glucozei10-15%, dulceata, siropuri

Influenta dimensiunilor inoculului asupra proceselor biotehnologice

calitatea si cantitatea inoculului

cantitate mare

declansarea unei rapide dezvoltari

reducerea riscului de contaminare

3-10% din volumul total al culturii

raport optim de inoculare

definirea starii fiziologice

varsta

aspect microscopic

efectele marimii si varstei inoculului

bacterii

Marimea inocului influenteaza stadiile ulterioare ale culturii

inocul mare - se micsoreaza faza de lag

datorita formarii si acumularii unor metaboliti intermediari esentiali - difuzeaza rapid

cantitate prea mare

autoinhibitie

datorat sensibilitatii celulelor bacteriene fata de unii produsi metabolici intermediari

cantitate prea mica

faza de lag poate fi prelungita la infinit

dezvoltare anormala a microorganismului

initierea dezvoltarii unui inocul

concentratie critica de metale grele

Bacillus subtilis - Mn

levuri

marimea inocului influenteaza faza de lag si stadiile ulterioare ale culturii

fungii

necesara standardizarea inoculului vegetativ pentru acest grup de microorganisme

inocul sub forma de suspensie de spori - ritm rapid de dezvoltare

autoinhibitie (autostimulare) a germinarii sporilor - substante produse in

timpul germinarii

fazele ulterioare

cantitatea inoculului influenteaza

miceliul

marime

forma

randamentul in metaboliti

raportul de inoculare judicios

dezvoltarea masei miceliene

consum mare de carbohidrati

cultura ineficienta

Efectele temperaturii asupra cresterii microorganismelor

diferenta intre temperatura mediului inconjurator si din interiorul celulei - nula

variatiile temperaturii

randamentul de transformare a substratului

cerintele nutritive

compozitia biomasei

viteza de crestere microbiana

domeniul de temperatura in care ating viteza maxima de crestere

criofile (10C)

mezofile

microorganisme industriale

25 - 30C

termofile

mecanismul de actiune afecteaza

procesele metabolice

compozitia biomasei in

proteine

lipide

ARN

Efectele pH-ului asupra cresterii microorganismelor

Cateva directii de influentare

Domeniul optim de pH

Drojdii 4-5 ---- 2; 8.

Valori mici ale pH (3-4) - risc scazut de contaminare

Efectul pH asupra randamentului de conversie a substratului

Domeniu foarte strict de pH

Ac. Citric

< ------ ac. citric

> ------ ac. oxalic, gluconic

deviatii ale pH de la valoarea optima

efecte nedorite

datorate

consumarea unui nutrient

producerea unui acid de catre microorganism

corectarea abaterii

adaugarea unor substante chimice

pH sub cel optim

NaOH

KOH

Amoniac gazos

Amoniac solutie

Ioni de Na, K

pH peste cel optim

HCl

Ac. sulfuric

Ac. azotic

ion Clorura

saruri greu solubile

corectia poate determina coroziune

pH-ul determina efecte de disociere a acizilor si bazelor

actioneaza la nivelul suprafetelor celulei

modifica proprietatile

de aderare la diverse materiale

de floculare

Concentratia de oxigen dizolvat

culturile aerobe

oxigenul necesar

oarecare exces

transferul de oxigen din faza gazoasa in faza lichida are loc cu viteze mari

in biosinteza in laborator (baloane agitate) aeratia depinde de

viteza de rotatie (translatie) a agitatorului

marimea baloanelor

volumul de mediu de cultura din balon

cresterea turbulentei prin sicane

eficienta aerarii - concentratia de oxigen dizolvat - determinata prin

metode sulfit

masurarea vitezei maxime de transfer a oxigenului din aer in mediu

metoda polarografica

determinarea concentratiei oxigenului dizolvat in mediu

utilizarea electrodului cu membrana

masurarea oxigenului dizolvat

determinarea ratiei consumului de oxigen

folosirea analizorului paramagnetice de oxigen

analizeaza si compara compozitia aerului

ce iese din bioreactor

ce intra in bioreactor

conducerea unui proces

cunoasterea

modului de variatie in timp a necesarului de oxigen

rata consumului de oxigen

sporeste rapid la o valoare maxima din primele stadii

este momentul atingerii concentratiilor ridicate de celule

apoi scade

necesarul de oxigen - mediul de biosinteza utilizat

Penicillium - oxigen dublu - glucoza (zaharoza - simplu)

Factori care influenteaza transferul de oxigen

Agentii tensioactivi - micsoreaza coeficientul de transfer

Concentratia de microorganisme

Conc. mari - vascozit. creste - eficienta sistemului de aerare scade

Sistemul de agitare - agitare eficienta - dispersie buna a bulelor

Echipament de aerare - conducte perforate - bioreactoare de volum mare

Suprapresiunea favorizeaza marirea conc. de oxigen - 0,5 - 1 atm.

Micsoreaza riscul de infectie

Prelucrarea mediilor de biosinteza

Prelucrarea primara

Filtrarea

Centrifugarea

Decantarea

Concentrarea fazei lichide

Dezagregarea celulelor

Extractia

Uscarea

Atomizarea

Precipitarea

cu solventi organici

cu saruri anorganice

ultrafiltrare pentru

purificari

concentrari

echipamente complexe si specifice

dificultati ale separarii produselor din lichid

produse termolabile

dificultati eliminate prin cunoasterea proprietatilor fizico-chimice ale produselor

solubilitatea in

apa (solutii diluate de saruri)

solventi polari (metanol, etanol, acetona)

solventi slab polari (cloroform, hidrocarburi)

stabilitatea in solutie in functie de efectul

pH

temperatura

solutii tampon

solventilor organici

stabilitatea in stare solida in functie de temperatura si efectul umiditatii

proprietati fizice

gradul de dializa

adsorbtia pe substante solide

migrarea in camp electric

sedimentarea in ultracentrifuge

proprietati chimice

stabilitatea fata de enzime

stabilitatea la actiunea unor agenti chimici

metode de separare din biomasa

extractia cu solventi organici

separarea pe schimbatori de ioni

cromatografie

adsorbtie

operatiile cele mai utilizate in biotehnologia medicamentelor

filtrarea

concentrarea

dezagregarea celulara

atomizarea

Filtrarea mediilor de biosinteza

probleme datorate

compozitia chimica a mediului

materialul biologic

adjuvanti de filtrare

formeaza paturi microscopice cu micsorarea dimensiunilor porilor

maresc vitezei de filtrare

reduc consumul de materiale

mai multe scheme

aplicarea pe materialul filtrant (panza, hartie) a unui strat subtire de material adjuvant

amestecarea adjuvantului cu suspensia de filtrat

raclarea permanenta a stratului adjuvant cu ajutorul unor cutite pentru mentinerea stratului la o valoare constanta (cazul filtrelor rotative)

se foloseste foarte mult filtrarea sterilizanta

prefiltrare grosiera

apoi filtrarea sterilizanta

filtre din

acetat de celuloza

azbest

polimeri sintetici

Dezagregarea celulelor de microorganisme

necesara pentru cazul in care substantele biologicactive sunt intracelulare

diverse procedee

fizice mecanice

mori coloidale

mori vibratoare

agent de racire pentru mentinerea sistemului la o anumita temperatura

fizice nemecanice

inghetare lenta

soc osmotic

vibratii ultrasonice - 20.000 Hz

chimice

pentru distrugerea componentelor lipoproteice din membrane se folosesc

detergenti cationici

detergenti aminici

solventi organici

preparate enzimatice

E. coli - bacteriofagi

Tesut muscular - enzime proteolitice

Drojdia de bere - autoliza la 30C, 2-3 zile

Concentrarea mediilor de biosinteza

Se are in vedere termolabilitatea produselor

Evaporarea in vacuum la temperaturi scazute (25-50C) - liofilizare

Procedee de concentrare atermica

Ultrafiltrarea

Separarea pe baza diferentei de volum molecular cu ajutorul unei membrane

Avantaje

Concentrarea la temperaturi scazute

Micsoreaza

fenomenele de autodigerare

pierderile in activitate prin denaturare termica

nu    necesita modificari de faza (evaporari, condensari)

nu utilizeaza substante chimice

purifica solutiile biologice prin indepartarea unor componente cu volum molecular inferior

Osmoza inversa

Atomizarea

Uscarea prin atomizare

Utila pentru materialele care in faza initiala sunt lichide

Solutii

Suspensii

Paste subtiri

Se realizeaza o ceata de lichid din particule de 2 - 200 m

Uscare rapida incat materialul nu se incalzeste

Se obtine o pulbere - nu este necesara maruntirea

Intr-o prima concluzie biotehnologiile farmaceutice industriale sunt alese si optimizate in functie de acesti doi mari factori, raportati la criteriul economic (pretul de cost):

medii

solide

lichide

culturi

de suprafata

submerse

procesele biotehnologice industriale

determina o dezvoltare

abundenta

egala

agitare mecanica

aerare corespunzatoare