Peretele celular la bacteriile Gram negative

Peretele celular la bacteriile Gram negative

Bacteriile Gram negative se caracterizeaza prin prezenta membranei externe. Analiza filogeniei organismelor procariote pe baza secventierii proteinelor a dus la concluzia existentei unor diferente filogenetice majore intre organismele cu invelis dublu membranar (''didermice'') si cele cu membrana simpla (''monodermice'').

La bacteriile Gram negative, mureina reprezinta numai 2,5-l0% din greutatea uscata a peretelui. Peretele lor este mai complex, datorita unei structuri caracteristice denumita membrana externa a peretelui celular, o replica structurala a membranei plasmatice, care poate fi astfel considerata ca membrana interna (fig. 7).

Fig. 7. Reprezentarea schematica a structurii moleculare a peretelui la bacteriile Gram negative. Proteinele trimere matriceale din membrana externa sunt asociate cu lipoproteine si cu lipopolizaharide (LPS). LPS sunt legate covalent de peptidoglican.

La microscopul electronic, peretele celular apare pluristratificat, datorita structurii trilaminare a membranei externe a peretelui.

Mureina este localizata in stratul cel mai intern al peretelui. Dupa un tratament adecvat, membrana externa se poate indeparta si se obtine sacul mureinic pur, extrem de fin care pastreaza forma originala a celulei si care sugereaza ca mureina ar putea fi o retea bidimensionala (un monostrat molecular), in timp ce la bacteriile Gram pozitive cantitatea de peptidoglican corespunde la 20 de straturi moleculare sau mai mult.

Membrana externa a peretelui contine fosfolipide (35% din greutate), proteine (l5%) si lipopolizaharide (50%).

Proteinele membranei externe se numesc porine, deoarece regleaza permeabilitatea si constituie canalele membranare de transport celular. Initial s-au descris trei tipuri de porine trimerice : OmpF, OmpC si PhoE. Analiza prin metoda cristalografiei cu raze x releva ca porinele sunt proteine transmembranare a caror configuratie secundara este cea de β-pliere. Aproape invariabil, secventele porinelor la capatul C-terminal au fenil-alanina. Rareori restul C-terminal este triptofanul. O celula de E. coli produce circa 10⁵ molecule porine, al caror rol este bariera selectiva de permeabilitate. In mediul hiperosmotic, numarul porinelor diminua.

Cel putin la enterobacterii, dublul strat fosfolipidic al membranei externe este asimetric:

stratul extern contine aproape exclusiv LPS

stratul intern contine aproape exclusiv fosfolipide.

Lipoproteinele leaga ferm membrana externa, de peptidoglicanul profund.

Lipopolizaharidele (LPS) sunt inclavate in membrana externa. Ele sunt de fapt endotoxinele bacteriilor Gram negative (Salmonella, Shigella, Escherichia) (fig. 9). Desi sunt localizate la suprafata celulei, se numesc endotoxine, deoarece se elibereaza numai dupa pierderea integritatii celulei.

Fig. 8. Raporturile macromoleculelor componente ale peretelui celular (dupa Todar, 2004).

Structura chimica a moleculei de LPS

Din punct de vedere chimic, LPS sunt molecule complexe, fiind alcatuite dintr-o fractie lipidica si una polizaharidica. De aici deriva proprietatile amfipatice ale acestui agregat molecular, conferit de grupari polare hidrofile si grupari apolare hidrofobe.

Datorita pozitiei lor externe, LPS se pot extrage din celule, cu fenol 45- 60%.

La microscopul electronic, filamentele LPS au o structura trilaminara, corespunzatoare celor doua straturi poliozidice si stratului lipidic.

Cele mai studiate LPS sunt cele produse se tulpinile de Salmonella. Din punct de vedere structural, molecula LPS are trei regiuni(fig. 9):

o regiune polizaharidica externa (polizaharidul O)

o regiune oligozaharidica intermediara (regiunea R)

o regiune interna hidrofoba, denumita lipidul A, prin care LPS se ancoreaza in membrana externa, printre moleculele fosfolipidice.

Fig. 9. Reprezentarea schematica a structurii moleculei de LPS

Regiunile intermediara si interna ale moleculei LPS au compozitie chimica relativ constanta la diferite specii de bacterii Gram negative.

Polizaharidul regiunii externe este un polimer de unitati oligozaharidice repetitive si confera specificitate serologica de grup, diferitelor variante antigenice de Salmonella. Unitatile oligozaharidice contin 2-4 glucide: D-manoza, D-galactoza, L-ramnoza, o dezoxihexoza, o didezoxihexoza. Didezoxihezozele sunt zaharuri care nu exista in stare libera in natura, dar intra frecvent in structura polizaharidului enterobacteriilor si au primit denumiri care deriva de la speciile de origine: abequoza, tiveloza, paratoza, colitoza.

Variatia antigenica a polizaharidului regiunii externe se amplifica pe urmatoarele cai:

schimbari ale pozitiei legaturilor (de exemplu, 1-4 in loc de 1-6);

configuratii moleculare modificate;

inlocuiri la nivelul diferitelor subunitati repetitive;

deletia sau substitutia unui rest glucidic din subunitatile oligozaharidice.

Regiunea centrala a LPS ("miezul" R) are o variabilitate chimica mult mai restransa si confera specificitate de gen. Oligozaharidul este legat covalent de lipidul A printr-un trizaharid, 2-ceto-3-dezoxioctonat (KDO).

Lipidul A este inserat si ancorat, prin catenele acizilor grasi, cu lipidele membranei externe. Intreaga molecula LPS este astfel orientata, incat polizaharidul O se proiecteaza la exterior si determina specificitatea antigenica a celulei bacteriene.

La Salmonella, lipidul A este alcatuit din dizaharide de D-glucozamina, legate b l'-6 (fig. 10). Perechile de D-glucozamina sunt interconectate l-4', prin punti pirofosfat.

Fig. 10. Structura lipidului A al lipopolizaharidului de Salmonella, cu trizaharidul KDO si cu resturile de acizi grasi.

Gruparile -OH din pozitiile 3, 4 si 6' ale fiecarui dizaharid sunt substituite de acizi grasi (lauric, palmitic, miristoximiristic, hidroximiristic).

Grupul -OH din pozitia 3 se leaga de componenta polizaharidica (acidul 2-ceto -deoxioctanoic) (KDO).

Gruparile -NH₂ ale glucozaminei sunt substituite de acidul D-3-hidroximiristic.

Componenta lipidica confera moleculei LPS, calitatea de toxina. Lipidul A are proprietati endotoxice, evidentiate la mutantele R care sintetizeaza LPS incomplet, caruia ii lipseste polizaharidul O si unele componente ale oligozaharidului regiunii intermediare R.

In mediile naturale, cele mai multe bacterii sintetizeaza polizaharidul O si formeaza colonii S. Cele care nu sintetizeaza polizaharidul O formeaza colonii R. Polizaharidul O nu este factorul determinant al patogenitatii, deoarece formele coloniale R ale B. pertusis, N gonorrhoeae sunt patogene.

Permeabilitatea membranei externe

Membrana externa, ca si celelalte membrane biologice, este alcatuita din stratul lipidic dublu, putin permeabil pentru moleculele hidrofile. Membrana externa contine proteine, denumite porine, ce formeaza canale pentru influxul nutrientilor si pentru eliminarea produselor de catabolism.

Porinele s-au gasit la toate bacteriile Gram negative si chiar la un grup de bacterii Gram pozitive: Corynebacterium-Nocardia-Mycobacterium, care produc un perete celular bogat in lipide, asemanator dublului strat.

Porinele clasice OmpF si OmpC transporta preferential cationi, iar PhoE, transporta anioni.

Moleculele de LPS formeaza baza structurala a membranei externe.

LPS este polianionica datorita sarcinilor negative ale lipidului A si leaga cationi. Moleculele adiacente polianionice de LPS sunt aparent legate electrostatic, una de alta, prin cationi bivalenti (Ca²⁺, Mg²⁺) si formeaza o structura compacta ca un "acoperis de tigla", pe suprafata membranei externe. Situsurile LPS care leaga cationii sunt esentiale pentru integritatea membranei externe, dar in acelasi timp ele reprezinta "calcaiul lui Ahile" al acestei structuri, deoarece antibioticele policationice din grupul polimixinei se complexeaza avid cu LPS si dezorganizeaza membrana externa, marind permeabilitatea pentru agentii cu actiune asupra membranei sau componentelor citoplasmatice. Toti agentii policationici se leaga de LPS anionice, cu o afinitate variabila. Bacteriile Gram negative sunt rezistente la detergentii anionici si neutri, dar sunt sensibile la detergentii monocationici.

Agentii chelatori ai ionilor de Ca²⁺ si Mg²⁺ dezorganizeaza si permeabilizeaza membrana externa.

In clasificarea empirica a bacteriilor, un rol deosebit l-a avut comportamentul lor la coloratia Gram. Caracterul Gram pozitiv sau Gram negativ reflecta deosebirile structurale majore ale celor diviziuni. Coloratia Gram implica tratamentul succesiv al celulelor cu cristal-violet (un colorant bazic), urmat de tratamentul cu solutie de iod si ulterior, extractia cu un solvent organic polar (alcool sau acetona). In celula, cristal-violetul si iodul formeaza un complex insolubil. Celulele care rezista etapei decolorarii si retin complexul insolubil (cristal violet-iod) albastru inchis sunt celule Gram pozitive, iar cele care nu retin colorantul sunt Gram negative

Reactia Gram nu se coreleaza direct cu compozitia chimica a peretelui, ci depinde de structura sa fizica, de starea fiziologica a celulei, de integritatea ei structurala. Astfel, levurile, desi au perete celular gros, dar cu o compozitie chimica diferita de a mureinei, se coloreaza Gram pozitiv.