Alcaloizi

ALCALOIZI

Cu toate ca denumirea de alcaloid nu corespunde clasificarii actuale a substantelor organice, bazata pe teoria structurii, ea este mentinuta conventional, deoarece cuprinde un numar mare de principii azotate.

Alcaloizii pot contine in structurile lor si atomi de oxigen.

Dupa Hegnauer alcalozii se pot clasifica astfel:

a-alcaloizi propriu-zisi, denumire rezervata substantelor naturale vegetale cu azotul sub forma heterociclica, care includ in structura lor nuclee ale unor aminoacizi ciclici: prolina, histidina, fenilalanina si triptofanul.

b-protoalcaloizi, substante de origine vegetala cu azotul in afara ciclului, denumite adeseori amine biogene, care din punct de vedere biogenetic provin prin decarboxilarea aminoacizilor. ( expl: efedrina, mescalina etc. )

c-pseudoalcaloizii, sunt compusi care au azot in heterociclu dar care nu provin din aminoacizi. ( alcaloizi terpenici si sterolici ).

Exista si alte metode de clasificare ale alcaloizilor:

-clasificare in functie de numarul heterociclilor din molecula si de felul legaturilor dintre ei :

1-alcaloizi cu un singur nucleu heterociclic: higrina, coniina, lobelina, piperina, izopeletierina, pilocarpina;

2-alcaloizi cu mai multe nuclee heterociclice care, la randul lor, pot fi impartiti in mai multe grupe:

a-cu nuclee izolate:nicotina, anabazina etc.

b-cu structura diheterociclil-metanica: chinina, chinidina, cinconina formate dintr-un nucleu chinolinic si unul chinolizidinic unite pprintr-un atom de carbon;

c-cu structura heterociclil-fenil-metanica: papaverina, berberina, tubocumarina etc;

d-cu nuclee condensatre ( heterociclici policondensati ):

d1-benzocondensate: gramina, bufotenina, berberina, tubocumarina, papaverina, narcotina, chinina;

d2-biheterociclice condensate: atropina, scopolamina, cocaina, pseudopeletierina;

d3-poliheterociclice condensate: camptotecina, morfina, yohimbina, strichnina, brucina, reserpina, vincamina vincamina, ergotamina, cafeina, teobromina, teofilina etc.

Aceasta clasificare nu are caracter exhaustiv si este relativa.

-clasificare dupa originea biosintetica si structura chimica:

-alcaloizi derivati de la ornitina cu nucleu pirolidinic, tropanic si pirolizidinic;

-alcaloizi derivati de la lizina, cu nucleu piridinic, piperidinic si chinolizidinic;

-alcaloizi derivati de la acidul antranilic cu nucleu acridinic;

-alcaloizi derivati de la fenilalanina cu nucleu: izochinolinic, benzilizochinolinic      bisbenzilizochinolinic,ftalidizochinolinic,aporfinic,morfinanic,diizochinolinic,ben-zofenentridinic, emetinic, galantaminic, colchicinic etc;

-alcaloizi derivati de la triptofan, cu nucleu indolic simplu ( derivati de triptamina, tip fizostigminic ) si complex ( tip harmanic, tip ergolinic, tip ajmalicinic, yohimbinic, reserpinic, ajmalinic, chinolinic, stichninic, ibogainic, aspidospermini si eburnaminic;

-alcaloizi derivati ai histidinei, cu nucleu imidazolic;

-alcaloizi diversi, cu nucleu purinic etc;

-alcaloizi derivati ai acetilcoenzimei A cu nucleu terpenic si cu nucleu sterolic.

In prezentul tratat vom respecta prima clasificare, adica clasificare dupa Hegnauer.

Caractere comune ale alcaloizilor:

a-     contin azot, de obicei in heterociclu, mai rar in structura neciclica;

b-    alcaloizii propriu-zisi asa cum rezulta si din denumirea acestei grupe de compusi azotati, prezinta caracter bazic, ceea ce inseamna proprietatea de a forma saruri cu acizi minerali si cu o serie de acizi carbonici.

c-     produsii, care prezinta interes farmaceutic, exercita o actiune farmacolo-

gica pronuntata, asupra organismul unor animale de experienta si asupra organismul uman.

Proprietati fizico-chimice.

Bazele alcaloidice cu oxigen in molecula sunt substante solide, cristalizate, mai rar lichide ( arecolina ), incolore, cu unele exceptii, gustul lor este amar si nu prezinta miros.

Bazele alcaloidice neoxigenate ( nicotina, coniina ) sunt lichide uleioase, incolore sau galbui, volatile, adica se pot antrena vu vapori de apa. Poseda miros caracteristic neplacut. Au gust amar.

In mare parte alcaloizii baze sunt insolubile sau greu solubile in apa. Sunt solubile in solventi organici nepolari ( vezi tabel )

Ist ii pag 320

Sarurile alcaloidice se dizolva in apa si sunt insolubile in solventi organici nepolari.

Alcoolul solubilizeaza atat bazele libere cat si sarurile alcaloidice, deci este un solvent neselecti

Sunt optic activi, cea mai mare parte a lor sunt levogiri ( ( - ) hiosciamina,

( - ) cocaina etc ); mai rar dextrogiri sau racemici ( atropina ).

Din punct de vedere farmacologic cei valorosi sunt levogirii.

Proprietatea chimica caracteristica a alcaloizilor este alcalinitatea, proprietate variabila in functie de structura chimica, fiind atenuata sau chiar neutralizata de unii substituenti cu caracter acid ( functiile carbonil sau oxidrilii fenolici ).

Unele baze alcaloidice oxigenate sunt foarte slab alcaline ( hidrastina ), altele lipsite de bazicitate ( cafeina ), iar alcaloizii quaternari sunt baze puternice (cheletrina, berberina ).

Bazele alcaloidice fenolice au caracter acid, solubilizandu-se in hidroxizi alcalini ( morfina ). Un caracter slab acid il au si unele baze purinice ( teobromina si teofilina ) datorita hidrogenului de la gruparile =NH libere.

Alcaloizii neoxigenati sunt baze tari si albastresc hartia de turnesol ( nicotina ).

Unele baze alcaloidice esteri ( atropina, cocaina, aconitina ), instabile in timp, alcalinitatea lor putand conduce la modificari structurale si, deci la atenuarea sau disparitia actiunilor lor farmacologice. De aceea, alcaloizii se conserva sub forma de saruri ale acizilor minerali ( clorhidric, bromhidric, sulfiric, nitric ) sau ale acizilor organici ( tartric ).

Alcaloizii lipsiti de bazicitate nu dau saruri cu acizii, sunt stabili si se folosesc in farmacie ca atare. ( expl.:cafeina baza purinica neutra se foloseste ca atare - forme farmaceutice solide- sau in amestec de parti egale, fie cu benzoatul de sodiu, fie cu acidul citric, pentru solutii medicamentoase in asociere cu alte ingrediente active, stabile, fie in mediu alcalin, fie in cel acid.

Datorita bazicitatii lor, alcaloizii dau saruri stabile cu acizii minerali sau organici.

Sarurile alcaloidice sunt cristalizate, solubile in apa, ionizeaza puternic, iar bazele lor alcaloidice sunt deplasate din combinatiile lor native cu baze tari ( hidroxid de sodiu, de potasiu, de amoniu ), precipitand in mediu apos ( cu unele exceptii prezentate mai sus ).

Extractia alcaloizilor.

Se cunosc metode: generale si specifice.

In ambele cazuri trebuie sa se tina seama de urmatorii parametri:

A -gradul de maruntire al produsului al produsului vegetal;

B -forma sub care se gasesc alcaloizii in celula vegetala;

C -raportul produs vegetal/solvent;

D -solubilitatea si stabilitatea chimica a alcaloizilor.

A In functie de metoda de extractie ( macerare, percolare, refluxare, agitare mecanica ) se alege gradul de maruntire si solventul folosit.

Folosind solventii polari ( apa si alcoolul diluat ), extractia se va produce prin difuziune-osmoza

In cazul solventilor organici nepolari se impune un grad de maruntire avansat, prin zdobirea celulelor si punerea in contact direct a alcaloizilor cu solventul (extractie-dizolvare ).

Farmacopea Romana indica un grad de maruntire, sita V sau VI, in general pentru toate produsele vegetale ce contin alcaloizi. Acesta poate sa se schimbe la anumite produse vegetale, de expl:Ipecacuanhae radix (VII ), Colae semen ( IV ) etc.

Pentru cantitati mai mari de 5 g produs vegetal cu alcaloizi, in timpul pulverizarii este obligatorie masca dubla de tifon, umectat cu apa pentru a impiedica contactul pulberei fine cu mucoasele nazala si bucala.

B. Forma sub care se gasesc alcaloizii in produsul vegetal determina alegerea celei mai adecvate metode de extractie. Alcaloizii se gasesc localizati in interiorul celulelor, asociati sub forma de saruri organice, complecsi cu tanoizii, mai rar liberi sau adsorbiti la suprafata elementelor de infrastructura.

C -- Raportul produs vegetal/solvent este de obicei 1/10 in cazul primei extractii, cand o parte din solvent este retinuta din materia prima vegetala. La a doua si a treia extractie, succesive, se folosesc cantitati mai mici de solvent (1/5 sau 1/4 ).

D -- Solubiltatea bazelor alcaloidice este un parametru obligatoriu pentru o extractie corespunzatoare, iar acidul mineral sau organic se alege astfel incat sarea rezultata sa aiba cea mai mare solubilitate ( acidul tartric pentru alcaloizii din Secalae cornutum ). Sunt cazuri in care se evita un anumit solvent care se poate descompune in mediu alcalin cu eliberarea de acid clorhidric ce perturba procesul de extractie a bazei, sau poate forma combinatii greu disociabile ( de expl. cloroformul.)

Stabilitatea chimica a alcaloizilor impune aplicarea de tehnici corespunzatoare ( extractii la rece sau la cald ). De exemplu, alcaloizi esteri (atropina, reserpina ), in prezenta bazelor tari, mai ales la cald se saponifica si rezulta compusi farmacologic inactivi;in prezenta amoniacului unii alcaloizi se izomerizeaza cu formare de compusi insolubili ( morfina ); unii alcalozi esteri se descompun chiar prin simpla incalzire cu apa ( cocaina, aconitina ). Emetina, fizostigmina se descompune la aer si lumina s.a.

Metoda generala de extractie a alcaloizilor, este metoda Stas-Otto, cu cele doua variante ale sale ( extractia cu solventi nepolari si extractia cu solventi polari ).

Extractia alcaloizilor cu solventi nepolari in mediu alcalin ( varianta I ).

Principiul metodei consta in eliberarea bazelor alcaloidice din sarurile lor native prin folosirea unei baze tari si extractia acestora cu un solvent organic adecvat ( vezi tabelul ). Dupa distilarea solventului, totalul alcaloidic brut este supus operatiunilor de purificare.

Tehnica de lucru.

Produsul vegetal, adus la gradul de maruntire corespunzator, se umecteaza cu hidroxid de sodiu 5-10% ( R ), amoniac 5-10% ( R ) sau alta baza indicata in tehnica de lucru pentru fiecare alcaloid in parte, cand are loc deplasarea bazelor alcaloidice, conform reactiei generale de mai jos:

R s N ⁺- H R₁ COO^- R s N + R₁ - COONa + H₂O

Dupa uscarea produsului vegetal alcalinizat prin etalare in strat subtire pe placi de sticla, bazele alcaloidice sunt extrase cu solventul organic nepolar indicat (sau amestec de solventi ) prin macerare, percolare, refluxare sau agitare mecanica. Solutia extractiva organica, filtrata pe sulfat de sodiu sicc. Se concentreaza in vid. Se obtine totalul alcaloidic brut, care este supus, apoi, operatiunilor de purificare.

Extractia alcaloizilor cu solvent apolar in mediu alcalin Ist. Scema 1 p 323

Extractia alcaloizilor cu solventi polari ( varianta II ).

Extractia alcaloizilor nativi din materia prima vegetala se poate realiza cu solventi polari: apa, alcool diluat sau alcool ( varianta II.a )

In cazul in care alcaloizii nativi sunt greu solubili in solventii amintiti, se folosesc acizi minerali diluati ( 1-5% ), mai rar acizi organici sau alcool acidulat cu acizi minerali ( 1-5% ). Se formeaza saruri alcaloidice mai solubile, extractia avand randamente superioare ( varianta II.b )

a) Extractia alcaloizilor cu apa sau alcool ( varianta II.a )

Tehnica de lucru.

Produsul vegetal, maruntit corespunzator, se supune extractiei prin refluxare (cu apa ) sau percolare, macerare sau agitare mecanica ( cu alcool ). Solutia extractiva, separata de reziduul vegetal ( filtrare prin vata sau tifon ) se prelucreaza diferit, in functie de solventul ales. Cand se foloseste apa ca solvent, extractele apoase se alcalinizeaza cu o baze tare ( pH = 8 -12 ), iar bazele alcaloidice precipitate se trec intr-un solvent apolar. Prin distilare in vid se obtine totalul alcaloidic brut, care se supune operatiilor de purificare.

Schema 2 Ist p 324

Extractia alcaloizilor cu solvent polar ( apa, alcool, alcool diluat ).

b) Extractia alcaloizilor cu solvent polar acidulat ( varianta II.b )

Tehnica de lucru.

Produsul vegetal maruntit se supune extractiei la rece sau la cald cu solventul acidulat, folosind procedee adecvate ( macerare, percolare, agitare mecanica sau refluxare ). Se obtin, fie extract apos, fie extract alcoolic, care se prelucreaza conform schemei indicate, prin care se obtine un total alcaloidic cu un grad avansat de purificare. Totodata, prin grade de alcalinizare diferite, putem separa bazele alcaloidice tertiare de cele cuaternare.

Purificarea totalului alcaloidic brut, obtinut prin una din metodele aratate mai sus ( shemele 1-3 ), are ca principiu trecerea succesiva a alcaloizilor din baze in saruri si din saruri in baze. De regula, reziduul alcaloidic brut este constituit din totalul alcaloidic ( doi sau mai multi alcaloizi in amestec ) existent in materialul vegetal prelucrat. De aceea, se impune atat purificarea totalului alcaloidic cat si separarea alcaloizilor din amestec.

Se utilizeaza cristalizarea fractionata a unor combinatii cu solubilitati diferite in anumiti solventi, cromatografia pe coloana in gradient de pH, fractionarea Craig, obtinerea unor combinatii bine definite si usor de separat din amestec ( picrati, reineckati, stifnati etc). Dupa purificari, alcaloizii puri se trec sub forma de saruri cristalizate, stabile, solubile ( ex: nitrati de strichnina, sulfati de atropina, clorhidrat de morfina, fosfat de codeina etc. )

Scema 3. Extractia cu solvent polar acidulat ( varianta II.b. ) Ist p 325

Antrenarea cu vapori de apa a bazelor alcaloidice volatile.

Este o metoda folosita pentru alcaloizii neoxigenati, volatili, al carei principiu se bazeaza pe antrenarea sau distilarea cu vapori de apa. Bazele alcaloidice sunt retinute in vasul de culegere sub forma de saruri stabile, nevolatile, cristalizate. Urmeaza etapele de purificare avansata prin procedeele aratate mai sus. Dezavantajul acestei metode consta in temperatura ridicata pe tot parcursul distilarii, care poate influenta negativ stabilitatea chimica a unor alcaloizi.

Reactii de identificare.

Se cunosc a- reactivi generali :1 de precipitare; de 2 culoare si

b- reactivi specifici

Reactiile de precipitare se efectueaza pe sarurile alcaloizilor ( deci in mediu apos ), iar cele de culoare pe rezidiile bazelor alcaloidice.

a.1. Reactivi general de precipitare:

ioduri complexe;

acizi anorganici complecsi;

saruri ale unor metale grele;

combinatii anorganice sau organice.

Toti alcaloizii, cu unele mici exceptii, dau cu acestia precipitate albe, galbene, portocalii, brune si mai rar alte culori.

Tabel.Reactivi de precipitare cu ioduri complexe

Tabel.Reactivi de precipitare - acizi anorganici complecsi sau combinatii anorganice

Tabel.Reactivi de precipitare -- metale grele

Tabel.Reactivi de precipitare cu unele combinatii anorganice.

Tabel.Reactivi de precipitare cu unele combinatii organice. Ist. 326

a. 2. Reactivi general de culoare.

Aproape toti alcaloizii baze dau coloratii diferite cu acestia, in functie de structura lor chimica. Ist 327-328

Obtinerea solutiei de analizat:

0,5-1 g produs vegetal pulverizat ( V; VI ) se umecteaza cu 1-2 ml hidroxid

de sodiu 10% ( R ) sau amoniac 10% ( R ) si se agita puternic timp de 2-3 minute cu 5-6 ml solvent apolar adecvat, conform tabelului.

Dupa filtrare( prin vata sau tifon) si spalarea reziduului vegetal cu inca 1-2 ml din acelasi solvent, solutia se trateaza cu cca. 1 g sulfat de sodiu anhidru. Dupa filtrare, se adauga 1,5 - 2 ml acid clorhidric 2-10% si se agita in palnia de separare timp de 1-2 minute. Solutia apoasa acida ( clorhidrati de alcaloizi ) separata si mentinuta pe baia de apa pentru indepartarea urmelor de solvent organic, serveste la identificarea alcaloizilor cu unul din reactivii de precipitare.

2. 0,5-1 g produs vegetal pulverizat ( V ) se refluxeaza cu 8-10 ml acid clorhidric 5-10% timp de cateva minute. Dupa filtrare si racire, proba se alcalinizeaza cu o baza tare, sol 5-10% ( pH = 8-10 ) si se extrage de 2-3 ori cu cate 8-10 ml solvent organic apolar, prin agitare energica in palnie de separare. Solutiile extractive organice se reunesc, se trateaza cu 1-2 g sulfat de sodiu anhidru, se filtreaza, dupa care se procedeaza ca mai sus ( 1 )

3. 0,5 produs vegetal pulverizat ( V ) se extrag prin refluxare cu 8-10 ml alcool. Dupa filtrare ( tifon sau vata ) se poate repeta operatia de extractie cu inca 2-3 ml alcool. Solutiile reunite se distila in vid pana la sec; reziduul se trateaza cu 10-15 ml apa fierbinte, se filtreaza prin vata, se alcalinizeaza la pH 8-10, dupa care bazele alcaloidice se extrag cu un solvent organic apolar, adecvat. In continuare se procedeaza ca mai sus ( 1 ).

Precipitare cu reactivii Mayer sau Bertrand.

Dupa obtinerea solutiei de analizat cu una din metodele amintite mai sus, se repartizeaza in cateva eprubete mici, una din ele servind drept martor; in probele de analizat se adauga cate 1-2 picaturi dintr-unul din reactivii de precipitare ( Mayer, Bertrand etc. ). Obtinerea unui precipitat sau a unei opalescente arata prezenta alcaloizilor.

Pentru reactiile de culoare, se trateaza rezidiile continand baze alcaloidice, cu 1-2 picaturi dintr-unul din reactivii de culoare ( vezi tabelul ).

Martorul in acest caz este culoarea reziduului alcaloidic fara adaos de reacti

Identificare prin CSS

Faza fixa: silicagel G, Kieselgel GF₂₅₄ in start de 0,225 mm, placi activate cel putin 30 minute la 105-110 C.

Faza mobila:

toluen-acetat de etil-dietilamina ( 70 : 20 : 10 ), pentru majoritatea alcaloizilor;

amoniac 25%-metanol ( 1,5 : 100 );

amoniac 25%-benzen-dioxan ( 5 : 50 : 40 : 5 );

acetat de etil-metanol-apa ( 100 : 13,5 : 10 );

toluen-cloroform-etanol ( 28,5 : 57 : 14,5 );

cloroform-metanol ( 85 : 15 );

toluen-metanol ( 86 : 14 );

n-heptan-etilmetilcetona-metanol ( 58 : 34 : 8 );

n-propanol-acid formic-apa ( 90 : 1 : 9 );

ciclohexan-cloroform-acid acetic glacial ( 45 : 45 : 10 );

acid acetic glacial-etanol-apa ( 30 : 60 : 10 );

acetona-apa amoniac 25% ( 90 : 7 : 3 );

cloroform-etanol-amoniac 25% ( 96 : 4 : 0,1 );

toluen-acetona-alcool etilic-amoniac 25% ( 45 : 45 : 7 : 3 )

cloroform-acetona anhidra-amoniac 25% ( 25 : 24 : 1 );

cloroform-etanol ( 99 : 1 ).

Prepararea solutiei de analizat: exista mai multe metode:

a. 1 g produs vegetal ( V, VI ) se agita 5-10 minute cu 10 ml acid sulfuric 0,1 N si se filtreaza. Se adauga filtratului 1 ml amoniac 25% si se completeaza cu apa la 10 ml. Se extrage cu 10 ml eter fara peroxizi iar faza eterica separata se filtreaza pe cca. 1 g sulfat de sodiu anhidru. Reziduul eteric se dizolva in 0,25 ml metanol si din solutia alcoolica se aduc la start ( punctiform sau in banda ) cate 10-20ml.

b.       1 g produs vegetal pulverizat ( V, VI ) se agta 10-15 minute cu 10 ml alcool diluat. Solutia filtrata serveste pentru separarea cromatografica, din care se pipeteaza cate 10-20 ml.

c.        1-2 g produs vegetal ( V, VI ) se degreseaza cu eter, dupa care se aplica una din cele doua variante ale metodei Stas-Otto ( vezi obtinerea solutiei de analizat ). Solutia extractiva apolara se evapora la sicitate, iar reziduul se dizolva in 0,5 ml metanol ( sau amestec de parti egale metanol-cloroform ); la punctele de start se aplica cate 5-25ml.

Solutii etalon:

1-10 mg alcaloid pur dizolvat in 10 ml metanol, din care se pipeteaza 1-10 ml solutie.Dupa developarea si uscarea cromatogramelor, se marcheaza in UV 365 nm fluorescenta unor alcaloizi.

Reactivi de revelare:

R. Dragendorff-Munier si acid sulfuric 0,1 N;

R. Wasicky, incalzire la 105-110 C pana apar spoturi colorate;

Acid sulfuric concentrat si incalzire la 110 C timp de 6-7 minute;

R. Bouchardat si acid clorhidric 50% in metanol.

Determinari cantitative, pot fi:

gravimetrice,

volumetrice,

fizice sau fizico-chimice si

biologice.

Metoda gravimetrica.

Aceasta metoda se aplica in special alcaloizilor cu structuri necunoscute si consta in cantarirea directa a totalului alcaloidic purificat sau a precipitatelor cu reactivi specifici, cu greutate moleculara mare. Extractia alcaloizilor din materialul vegetal se face printr-una din variantele metodei Stas-Otto, iar operatiunile de purificare conduc la valori mai mici decat cele reale. Totodata, uscare rezidiilor pentru aducere la pondere constanta, poate determina o usoara descompunere a alcaloizilor ( coloratie usor-galbuie ) si deci o pierdere din continutul alcaloidic.

Cantarirea directa a alcaloizilor se realizeaza in cazul cand produsul vegetal contine o cantitate destul de mare ( peste 0,5 g%) de alcaloizi, pentru ca eroarea sa fie mai mica ( expl. cafeina, teobromina, teofilina, colchicina ).

In cazul cand produsul vegetal contine o cantitate redusa de alcaloizi care au o greutate moleculara mica, se procedeaza la precipitarea alcaloizilor cu reactivi care au o greutate moleculara mare pentru a evita erorile prea mari la cantarire. Cel mai folosit este reactivul Bertrand ( acid silicotungstic ) cand se obtine combinatia:

12 ( WO₃.SiO₂.2H₂O ). 4 ( mol.alcaloid.nH₂O ).

In cazul altor alcaloizi ( din Secalae cornutum sau tuber Aconiti ) formula este :

2 ( WO₃. SiO₂). 7 ( mol.alcaloid ).

Pentru efectuarea dozarii, se extrag alcaloizii din produsul vegetal, se purifica, se aduc in solutie acida si se trateaza cu cantitatea determinata de reactiv Bertrand. Se aduce solutia la fierbere, dupa care se lasa in repaus 24-48 ore; se filtreaza si se calcineaza. Dupa cantitatea de WO₃ cantarita, se calculeaza cantitatea de alcaloid, tinand seama de combinatia de mai sus.

Dezavantajele metodei constau in obtinerea unui precipitat cu o compozitie variabila in functie de gradul de aciditate al mediului si de puritatea alcaloidului.

Un alt reactiv utilizat la dozarea gravimetrica prin precipitare este reactivul Mayer-Valzer.

Metoda prezinta un dezavantaj major prin faptul ca precipitatele ce se formeaza prezinta o mare variatie in structura. Putini sunt alcaloizii care dau numai o singura combinatie ( expl. strichnina ).

Metode volumetrice.

Aceste metode sunt cele mai des utilizate, cu toate ca sensibilitatea si selectivitatea sunt inferioare procedeelor spectrofotometrice. De regula, metodele oficinale, prezente in diferite farmacopei, sunt:

titrari in mediu apos si

in mediu neapos.

Metodele volumetrice se bazeaza pe proprietatea bazica a alcaloizilor.

In cazul cand se folosesc metode acidimetrice , titrarea se face direct sau indirect. Direct, se titreaza cu acid clorhidric sau acid sulfuric 0,02 N sau 0,01 N.( indicator rosu de metil care are un interval de viraj la pH 4,2-6,3 ).

In metodele indirecte peste reziduul alcaloidic purificat se aduce o cantitate exact masurata de solutie titrata de acid: o parte din acest acid reactioneaza cu baza alcaloidica, iar excesul de acid se titreaza cu NaOH sau cu KOH de aceeasi normalitate.

Pentru alcaloizii baze slabe ( hidrastina ) se foloseste ca indicator metil-orange ( interval de viraj la pH 3,1-4,4 ).Uneori amestecurile de indicator prezinta avantaje in recunoasterea punctului de echivalenta ( la determinarea alcaloizilor tropanici se utilizeaza rosu de metil si albastru de metilen ).

Pentru titrarea alcaloizilor in mediu neapos se foloseste acid acetic glacial. Se titreaza cu acid percloric in acid acetic anhidru sau acid percloric 0,1 N in dioxan.

Deoarece solventii anhidri ( acid acetic glacial, anhidrida acetica ) au o afinitate foarte scazuta fata de protoni, se pot titra si alcaloizii slab bazici ( colchicina, cafeina sau saruri de alcaloizi )

In anumite cazuri metodele de titrare sunt combinate cu metode de precipitare ( precipitatul de reinekati alcaloidici se trateaza cu amoniac si tartrat dublu de K si Na, cand se formeaza un complex stabil de crom, la valenta 3, si tartrat; in paralel se elibereaza patru echivalenti de rodanin care se determina argentometric.

Metode fizico-chimice.

Dozarea alcaloizilor se poate realiza:

-colorimetric,

-nefelometric,

-fluorimetric,

-polarografic,

-cromatografic,

-prin schimb de ioni,

-prin metode polarimetrice.

Metodele colorimetrice sunt mult utilizate si au la baza o reactie de culoare. Un dezavantaj il prezinta alcaloizii secundari din amestecul de dozat care pot crea dificultati; de aceea se aleg acei reactivi de culoare cu o specifitate ridicata fata de alcaloidul de dozat si sa nu interfereze cu alti derivati inruditi structural. Se mai utilizeaza si reactivi de precipitare; precipitatul se separa si se dizolva intr-un solvent, rezultand o solutie colorata care se fotocolorimetreaza.( reinekatii solubilizati in acetona dau solutii roz-rosii ).

Precipitatele obtinute cu acid fosfomolibdenic sau silicowolframic se pot reduce cu reducatori puternici la albastru de molibden sau albastru de wolfram, intensitatea coloratiei corespunzand cantitatii de alcaloid care a fost inclus in precipitat. Gradul ridicat al intensitatii culorii determina aplicarea acestei metode in microanalize.

O metoda fotometrica rapida a alcaloizilor este precipitarea acestora cu acid picric, dizolvarea picratului in cloroform si determinarea absorbantei la lungimea de unda corespunzatoare. Metoda se aplica in cazul unor amestecuri de substante medicamentoase dintr-un preparat farmaceutic.

O metoda de dozare mult aplicata este de cea de formare de complecsi alcaloid-colorant, combinatii solubile in cloroform sau benzen ( colorantii singuri sunt insolubili in acesti solventi apolari). Solutia unor saruri de alcaloizi ( morfinanic ), adusa la o anumita valoare pH cu o solutie tampon, se trateaza cu un exces de colorant ( albastru de brom-timol, verde de brom-crezol, eozina etc. ) si complexul alcaloid-colorant se extrage cu cloroform si se separa.

Faza cloroformica se aciduleaza cu un amestec de acid sulfuric-metanol si se citeste extinctia fata de un martor. Natura complexului format nu este inca cunoscuta.

Metodele fluorimetrice au la baza transformarea alcaloidului purificat in combinatii fluorescente cu ajutorul unor reactivi chimici ( hidrastina prin oxidare devine fluorescenta ).

Metodele nefelometrice au la baza o reactie de precipitare a alcaloizilor in solutii foarte diluate si se compara tulbureala obtinuta cu o proba etalon a unei solutii de concentratie cunoscuta. Pentru calcul se tine seama de legea lui Beer. Aceste metode se pot folosi in cazul alcaloizilor din familia Solanaceae, Opium si Stryhni semen.

Metodele polarografice se aplica la alcaloizi si la toate substantele reductibile sau oxidabile la electrozi. Prin metoda polarografica se inregistreaza anumite curbe de intensitate-tensiune in scopuri analitice. Daca la doi electrozi introdusi intr-un electrolit ( solutia unei substante organice ) se aplica o tensiune crescanda, la o anumnita valoare a tensiunii ( tensiune de descompunere ) se formeaza un curent de difuziune ( prin miscarea ionilor substantei organice ). Intensitatea curentului este proportionala cu concentratia substantei organice. Deoarece inaltimea treptei de polarizare depinde si de pH-ul solutiei, se folsesc solutii tampon ( azot gazos in solutie ).

Determinarea polarografica poate fi combinata cu metode analitice cantitative. In scopul eliminarii substantei care da treapta caracteristica pe polarograma la o tensiune constanta, se adauga o solutie titrata. La alcaloizi se aplica reactii de precipitare ( alcaloizii din Opium, Ipecacuanhae radix, Strychni semen etc. ).

Metodele cromatografice au la baza aplicarea unei tehnici de cromatografiere adecvate in care se evidentiaza spoturile alcaloidice. Pe baza relatiilor matematice intre structura alcaloizilor si valorile Rf si in functia de natura developantilor se stabileste cantitatea de alcaloid din proba luata in lucru.

Metoda de dozare cromatografica Hais-Macek este o metoda generala de analiza a alcaloizilor dintr-un amestec, prin separarea lor, determinarea valorilor Rf, dupa care urmeaza reactii caracteristice suplimentare si alte probe specifice.

Faza fixa:

Exemplu:

Hartie cromatografica imbibata cu formamida ce contine 1% acid acetic, uscata la aer, pe care se aplica etalonul ( banda 1 ) si doua spoturi din solutia de analizat ( benzile 2 si 3 ).

Etalonul este un amestecde solutii de codeina, narceina si heroina.

Faza mobila: cloroform.

Dupa developare, banda 2, care corespunde uneia din probele de analizat, se pulverizeaza cu reactiv Dragendorff-Munier. Se determina grupa din care face parte alcaloidului respectiv, dupa Rf, astfel:

grupa I-alcaloizi cu Rf-uri cuprinse intre 0 si 0,2 ( inferioare codeinei )

grupa II-alcaloizi cu RF-uri de la 0,2 la 0,35 ( inferioare narceinei ),

grupa III-alcaloizi cu valori Rf intre 0,35 si 0,80 ( alcaloizi plasati deasupra heroinei ).

Banda 3 se examineaza in lumina Wood si, daca sunt spoturi cu fluorescenta albastra, se pulverizeaza cu o solutie PABA ( p-dimetilaminobenzaldehida ); daca se obtin spoturi violete sunt datorate alcaloizilor din Secalae cornutum, care se incadreaza in grupa independenta .

Dozarea cromatografica a alcaloizilor ( Hais-Macek ) Ist 332.

Pentru dozarea alcaloizilor se procedeaza la :

1 -- decuparea spoturilor din banda cromatografica, dizolvarea alcaloidului si aplicare unei metode de dozare specifice;

2 -- pulverizarea benzii cromatografice cu reactiv Dragendorff si evaluarea cantitaiva prin colorimetrarea directa pe hartie cromatografica, folosind fotometre speciale, construite pe principiul densitometriei. Inaintea determinarii propriu-zise, benzile cromatografice sunt imersate intr-un amestec de brom-naftalina si ulei de parafina ( devin transparente, usurand colorimetrarea ).

In unele cazuri este utilizata electroforeza pe hartie deoarece alcaloizii sunt dotati cu sarcina electrica de diferite valori si migreaza in campul electric. Dupa pulverizare cu reactivul Dragendoff, evaluarea cantitativa se face tot densitometric.

Metode prin schimb de ioni.

Solutia cu alcaloizi se trece peste o coloana de rasina cationica, cu ioni de magneziu. Ionii de magneziu schimbati cu cationii alcaloidici, sunt eluati, titrati complexometric si se calculeaza apoi echivalentul de alcaloid corespunzator ionilor de magneziu dozati.

Metodele biologice

Prin ele se determina actiunea farmacologica cea mai semnificativa a alcaloidului.

Dezavantajul acestor metode consta in gradul inalt de subiectivitate al materialului biologic utilizat, care determina erori pana la 30%.

V . seria 1. Produse vegetale cu alcaloizi NEHETEROCICLICI.

( cu atom de N in catena laterala ).

V . 1 . 1. EPHEDRAE HERBA

Definitie, provenienta.

Partile aeriene ale diferitelor specii de Ephedra / familia Ephedraceae/.

Singura specie din flora noastra spontana este Ephedra distachya L, circel.

Obtinerea produsului.

Se recolteaza partile aeriene verzi ale diferitelor specii de Ephedra.

Caractere macroscopice.

Fragmente de tulpini si ramuri tinere de culoare verde deschis, sau verde cenusie, lungi de 3-8 cm cu un diametru de 1-2 mm, prevazute cu noduri din loc in loc. Zona dintre noduri este striata lungitudinal, la fiecare nod se afla o teaca formata din frunze mici solzoase.

Fructul rosu.

Gustul este astringent, slab amar.

Mirosul este usor camforat.

Caractere microscopice.

Sectiunea transversala prin tulpina, prezinta la exterior o epiderma puternic cutinizata, urmata de un parenchim cu pachete de fibre clerificate,intre care este dispus tesutul asimilator palisadic format din 3-4 randuri de celule. Tesutul lacunar prezinta rare pachete de fibre sclerificate. Tulpinile subtiri prezinta fascicole libero-lemnoase dispuse in cerc, marginite de calote mici de fibre periciclice lignificate. Tulpinile dezvoltate, au cilondrul central format din zone compacte, circulare de lemn si liber, protejate de pachete de fibre periciclice dispuse in calote. In centrul sectiunii se afla parenchimul medular, in care se observa celulele ce contin pigmenti portocalii.

Pulberea se caracterizeaza prin fragmente de epiderme cu stomate, insotite de trei celule anexe, numeroase fibre sclerificate si parenchim cu inulina.

Reactii de identificare.

a.      Reactia K e l l y : 2 g p. se amesteca cu o mica cantitate de nisip umectat cu o solutie de carbonat de sodiu 10 % ( R ), dupa care se epuizeaza cu cloroform. Solutia extractiva se epuizeaza apoi cu acid clorhidric 10 % ( R ), solutia apoasa acida rezultata incalzandu-se cateva minute cu carbune acti Dupa filtrare si alcalinizare cu hidroxid de sodiu ( R ) se adauga 0,1 ml sol. Sulfat de cupru 2 %(R) Apare o coloratie albastra sau violeta. Daca coloratia nu apare, se procedeaza la epuizarea solutiei alcaline cu eter, urmata de evaporarea la sicitate asolventului, cand prezenta alcaloizilor este data de culoarea roz a reziduului.

b.      Sectiunile practicate cu un brici inmuiat in acid tartric 2 % ( R ) in tulpinile proaspete si mentinute apoi 12 ore in acid tartric ( R ), tratate cu reactiv Bouchardat ( R ) pun in evidenta prezenta proteinelor. Daca sectiunile sunt prinse direct in reactiv Buchardat ( R ) se localizeaza aminele alcaloidice prezente in tesutul palisadic, sub forma unui precipitat brun-rosietic.

Identificare prin CSS.

Prepararea solutiei de analizat: 1 g p. se extrage la cald repetat cu cate 15 si 10 ml alcool. Dupa racire si filtrare se completeaza se completeaza cu alcool la 25 ml prin spalarea reziduului vegetal.

Solutia de referinta: 0,01 g efedrina se dizolva in 10 ml alcool.

Faza fixa: placi de silicagel 60 F 254 sau 60 G.

Faza mobila: toluen- acetat de etil- dietilamida ( 70 : 20 : 10 ).

Reactivi:

a-ninhidrina ( R ); b-iodoplatinatul de potasiu ( R ); reactiv Dragendorff cu azo-tit de sodiu ( R ).

Rezultate : cu reactivul a) efedrina apare cu o culoare luminoasa pe un fond rosu-violet, culoarea spotului poate deveni mai violeta in functie de extinderea acestuia; cu reactivii b) si c ) se obtin numai zone slab colorate care in timp dispar; cu reactivul b) efedrina da spoturi colorate in rosu- violet; in acest sistem izomerii pseudoefedrina si norpseudoefedrina nu separa.

V . 1 . 2 . COLCHICI SEMEN

Seminte de brandusa de toamna.

Definitie, proventienta.

Semintele speciei Colchicum autumnale L ./ familia Liliaceae /, brandusa de toamna, ceapa ciorii, balura, ruscea de poiana.

Obtinerea produsului.

TN p 129

Caractere macroscopice. TN 129

Caractere microscopice. TN 131

Reactii de identificare:

0,50 g p. pulverizat se fierbe 1-2 minute cu 5 ml acid sulfuric N ( R ) si se filtreaza. Filtratul se trateaza cu 5 ml NH₃ conc. Si se extrage apoi cu 5 ml cloroform. Solutia extractiva cloroformica se concentreaza la reziduu. Reziduul se ia cu 1 ml HCl conc.,cand datorita colchicinei, se coloreaza in galben. Prin incalzire la fierbere pe baia de apa timp de 5 minute, si tratarea solutiei formate cu 1 ml solutie Fe Cl₃ 0,5% ( R ) in prezenta colchicinei apare o coloratie verde. Culoarea se compara cu proba martor obtinuta dintr-un ml HCl conc. Si 1 ml solutie Fe Cl₃ ( R ).

Prin demetilare colchicina trece in colchiceina, gruparea OH fenolic a acesteia reactioneaza cu ionii Fe ³⁺ si formeaza un complex colorat in verde.

Formula Ist 397

Identificare prin CSS.

Prepararea sol. A: 1 g p. pulverizat se extrage la cald repetat cu cate 15 si 10 ml alcool. Dupa racire si filtrare se completeaza cu alcool la 25 ml prin spalarea reziduului vegetal.

Solutia de referinta: 0,01 g colchicina dizolvata in 10 ml alcool.

Faza mobila:

a-acetat de etil-metanol-apa ( 100 :13,5 : 10 )

b-toluen-metanol ( 86 : 14 )

Cu faza mobila b dupa parcurgerea a 15 cm, placile se usuca si se repeta elutia in aceleasi sens ( parcurs util 15 cm ).

Reactivi:

a-Dragendorff cu azotit de sodiu ( R );

b-acid clorhidric 10 % in etanol ( R ).

Rezultate: in solventul b colchicina migreaza la Rf cca 0,15 si se coloreaza cu reactivul Dragendorff cu azotit de sodiu in brun si galben limoniu cu reactivul acid clorhidric 10% in etanol ( in vizibil ).

Etalonul comercial de colchicina contine o impuritate care migreaza deasupra colchicinei si se coloreaza cu reactivul Dragendorff cu azotit de sodiu in violet.

V . 1 . 3 . CAPSICI FRUCTUS

Ardei iute

Definitie, provenienta.

Produsul este format din fructele mature ale speciei Capsicum annum var. longum L, C. frutescens / familia Solanaceae / ardei rosu, paprica, piper rosu, piparus.

Obtinerea produsului.

Caractere macroscopice.

Caractere microscopice. TN 133-134

Identificarea capsaicinei.

a- Pulberea de Capsicum annum examinata in U. prezinta o fluorescenta agalben-citrin, cu o nuanta slaba pentru varietatile iuti si mai puternica pentru variatile dulci.

b- 0,20 g pulbere se extrag prin agitare, intr-un pahar Erlenmayer cu 5 ml acetona si se lasa in repaus 10 minute. Solutia se filtreaza si se trateaza cu 0,2 ml HCl conc. Si 0,05 g metavanadat de amoniu cristalizat ( R ), se agita, apare o coloratie verde ( capsaicina ).

c- 0,20 g pulbere se trateaza intr-o capsula cu acid sulfuric concentrat, pulberea se coloreaza la inceput in albastru inchis apoi in brun-verde ( capsantina ).

Identificare prin CSS.

Prepararea solutiei A:1 g p.pul se extrage la cald repetat cu cate 15 si 10 ml alcool. Dupa racire si filtrare se completeaza cu alcool la 25 ml prin spalarea reziduului vegetal.

Solutie de referinta: 0,01 capsaicina se dizolva in 10 ml alcool.

Faza mobila:

a-     toluen- acetat de etil ( 70 : 30 );

b-     eter etilic.

Reactivi:

a-     acid sulfanilic diazotat ( R );

b-     2-6 diclorochinocloroiodura ( R );

Rezultate: cu solventul a capsaicina separa la Rf cca 0,4, spotul respectiv colorandu-se in rosu cu reactivul acid sulfanilic diazotat, si in albastru dupa pulverizare cu reactivul b si expunere la vapori de amoniac ( in vizibil ); la frontul de solvent migreaza carotenoidele.

Conditii de puritate.

Pulberea de Capsici fructus poate impurificata cu pulbere de Lini semen sau cu amidon.

V . seria 2 Produse vegetale cu alcaloizi cu nucleu PIRIDINIC si PIPERIDINIC

Acesti alcaloizi au importanta terapeutica mica, fiind raspanditi in familiile Solanaceae, Convolvulaceae, Apiaceae, Lobeliaceae.

Majoritatea acestor alcaloizi sunt lichide, volatile, cu miros caracteristic. Sunt antrenabile cu vapori de apa. Se dizolva usor in solventi polari.

V . 2 . 1 . LOBELIAE HERBA

Definitie, provenienta.

Partea aeriana inflorita de la specia Lobelia inflata / familia Lobeliaceae /, uscata dupa recoltare.

Obtinerea produsului.

Se recoltreaza partea aeriana a splantei in perioada de inflorire, apoi se usuca de preferinta la umbra, dupa care de obicei se comprima in pachete dreptunghiulare invelite in hartie.

Caractere macroscopice.

Produsul alcatuit din fragmente de tulpini si frunze amestecate cu flori si chiar cu fructe, are o culoare verde sau verde-cenusie. Tulpina de culoare rosie-violeta, spre varf este unghiulara, prevazuta cu peri aspri.

Frunzele inferioare, lugi pana la 7 cm, sunt simple, penat nervate, cele superioare mai mici. Florile au corola bilabiata de culoare albastra sau liliachie. Fructul o capsula veziculoasa si umflata ( de unde deriva si numele inflata ). Produsul are un miros si gust caracteristic la inceput slab, apoi iute.

Caractere microscopice.

Sectiunea transversala prin tulpina prezinta o zona libero-lemnoasa continua, circulara, delimitata de un parenchim medular ingust si o lacuna centrala. Liberul prezinta pachete de fibre lignificate. Caracteristice sunt laticiferele abundente in zona liberiana si mai rare in parenchimele cortical si medular.

Sectiunea transversala prin frunza prezinta o structura heterogen-asimetrica cu tesutul palisadic alcatuit dintr-un rand de celule. Fascicolul libero-lemnos este bicolateral, zona liberiana continand laticifere.

Perii tectori, prezenti pe tulpini si frunze, sunt unicelulari si conici, cu cuticula neteda.

Reactii de identificare. ( reactii generale ai alcaloizilor- vezi partea generala ).

Identificare prin CSS ( vezi partea generala )

Determinare cantitativa. ( vezi partea generala ).

V . 2 . 2 . NICOTIANAE FOLIUM

Frunza de tutun

Definitie, provenienta.

Frunzele recoltate de la speciile Nicotiana tabacum L. si Nicotiana rustica L., tutun / familia Solanaceae /, uscate la aer sau supus unui proces de fermentare.

Obtinerea produsului.

Frunzele se recolteaza cand sunt complt dezvoltate, prin detasare de pe ramuri, sau prin taierea intregii plante de pe care se vor separa apoi numai frunzele. Modul de uscare sau fermentare pt aromatizare, difera de la o regiune la alta.

Caractere macroscopice.

Frunze mari, ovale, rari lanceolate, sesile sau scurt petiolate, cu marginea intreaga si varful obtuz. Sunt aspre la atingere, datorita numerosilor peri tectori de pe ambele epiderme.

Dimensiuni: lungime; 6,5-7,5 cm; litime: 2,5-4 cm

Are culoare cafenie, mirosul este caracteristic, iar gustul amar neplacut si acru.

Carctere microscopice.

Sectiune transversala prezinta o structura heterogen-asimetrica si fascicol liberolemnos bicolateral, specific familiei Solanaceae. Pe ambele epiderme sunt prezenti peri tectori pluricelulari, uniseriati si peri glandulari cu piciorul format din 1-8 celule si glanda pluricelulara, alungita. Mezofilul contine oxalat de calciu sub forma de nisip, rar ursine. Epiderma este alcatuita din celule sinuate avand cuticula striata.

Reactii de identificare. ( vezi partea generala

Identificare prin CSS. (vezi partea generala )

Determinare cantitativa. ( vezi partea generala ).

V . seria 3 Produse vegetale cu ALCALOIZI TOPANICI

Alcalozii cu nucleu tropanic reprezinta cel mai important grup de de compusi proveniti de la ornitina.

Acesti alcaloizi sunt alcaloizi esteri derivati ai tropanolului ( atropina, hiosciamina, meteloidina si scopolamina ) si pseudotropanolului ( cocaina si derivati, convolvina ) raspanditi in specii din familiile: Solanaceae, Erytroxylaceae, Convolvulaceae, Brassicaceae etc.

Formule: atropina, scopolamina cocaina CIULEI VOL2 P 371

Proprietati fizico-chimice.

Sunt substente solide ( doar scopolamina este lichid vascos ), incolore, cristaline, fara miros, cu gust foarte amar, optic active ( de obicei levogire ) unele racemizandu-se cu usurinta prin incalzire sau in timpul extractiei. Astfel, hiosciamina ( izomer levogir ), se transforma in atropina ( compus racemic ). Sunt insolubile in apa, solubile in alcool, cloroform, eter, eter de petrol, benzen, acetonaa si alti solventi organici. Scopolamina formeaza cu apa un monohidrat cristalin, solubil in apa indeosebi la cald.

Hidrolizeaza in prezenta alcalilor, acizilor si chiar a apei.

Cu acizii minerali formeaza saruri ( sulfat de atropina, bromhidrat de scopolamina, clorhidrat de cocaina etc. ) solubile in apa, alcool acetona, glicerina, insolubile in eter si alti solventi apolari.

Cocaina sub actiunea acizilor minerali sau a hidroxidului de bariu pune in libertate metanol si benzoil-ecgonina.

Extractie. Avand in vedere ca sunt alcaloizi esteri se pot folosi procedee blande de exxtractie. ( agitare la rece cu acizi minerali diluati pentru extractia alcaloizilor saruri sau agitarea cu solventi apolari a alcaloizilor baza din produsul vegetal alcalinizat cu hidroxid de amoniu sau carbonat de sodiu. ( vezi partea generala ).

Reactii de identificare. Sunt pozitive reactiile de precipitare Mayer si Bertrand. Caracteristic alcaloizilor tropanici este reactia de culoare Vitali.

a.         Reactia Vitali: principiul metodei consta in nitrarea alcaloizilor cu acid azotic fumans la cald, dizolvarea reziduului in acetona si tratarea acestuia cu poatsa alcoolica ( R ). Se obtine o coloratie violacee a carei durata este prelungita de acetona. Reactia este data de toti alcaloizii care au o grupare CH₂OH libera sau un radical fenil ( hiosciamina, atropina, apoatropina, scopolamina, cocaina si derivatii ei ), deoarece se formeaza esterii nitro si/sau numai nitroderivatii corespunzatori.

Formule Ist 2 p 337.

Identificare prin CSS sau CH.

Prepararea solutiei A: 1 g p. pulverizat ( Belladonnae radix et folium, Stramonii folium ) sau 2 g ( Hyosciami folium ) se agita cu 10 ml acid sulfuric 0,05 M timp de 5 minute si se filtreaza. Filtratul se dilueaza cu 10 ml apa, se alcalinizeaza cu 1 ml hidroxid de ammoniu conc. Si se agita cu 10 ml eter. Dupa separarea celor 2 faze, solutia extractiva etericase deshidrateaza pe sulfat de sodiu anhidru, se filtreaza si se concentreaza pe baie de apa pana la sec. Reziduul se dizolva in 0,25 ml metanol. Se aduce la start in banda.

In cazul extractelor si produselor farmaceutice cu alcaloizi tropanici cantitatile luate in studiu depind de continutul acestora in alcaloizi totali. Greutatea probei de analizat trebuie sa corespunda la 1-2 mg alcaloid

Drageurile sau tabletele continand alcaloizi se pulverizeaza si se extrag prin agitare cu 5 ml metanol, timp de 5 minute la 60 C. Se centrifugheaza si se concentreaza la reziduu. Acesta se dizolva in 1 ml metanol. La nevoie se centrifugheaza.Cantitatea de solutie depusa la start variaza intre 10-100 ml, in functie de continutul in alcaloid al probei care trebuie sa fie de minim 10 mg alcaloid / 1ml solutie.

Substante de referinta: hiosciamina, atropina, scopolamina, cocaina-solutii 0,01% in alcool sau in alt solvent adecvat.

Faza mobila:

a-     toluen-acetat de etil-dietilamina ( 70 : 20 : 1 )

b-     acetat de etil-acid formic-acid acetic glacial-apa ( 100 : 11 : 11 : 27 )

c-     acetona-apa-amoniac conc. ( 90 : 7 : 3 ).

Reactivi:

Dragendorff-Munier ( R ) sau Dragendorff cu nitrit de sodiu ( R ) 0,35-0,40 pentru scopolamina ( in solventul a ) sau de 0,10-0,15 pentru hiosciamina/atropina si cca. 0,80 pentru scopolamina ( in solventul c ).

Revelarea cu reactiv Dragendorff continand azotit de sodiu ( R ) confera stabilitate culorii spoturilor cu alcaloizi tropanici si o intensificare a acestuia numai in cazul hiosciaminei/atropinei.

Prezenta flavonoidelor si a cumarinelor in aceste preoduse alaturi de alcaloizii tropanici le usureaza identificarea. Astfel, din Scopoliae rhizoma separa la Rf cca. 0,20 scopoletozida ( flurescenta albastra ), iar la frontul de solvent migreaza acidul cafeic ( fluorescenta albastra ).

Din Belladonnae radix in afara spotului cu Rf'=0,20 ( scopoletozida ) mai separa o zona mai putin intens fluorescenta ( albastru inchis sau albastru-verzui ) intre start si Rf cca 0,5 ( esculozida ). Din frunzele de Atropa belladonna mai separa si clorofila ( fluorescenta rosie in U V-365 nm ) la frontul de solvent.

Din Belladonnae folium., Hyoscyami folium si Stramonii folium sau separat spoturi cu fluorescenta portocalie ( Rf cca. 0,40 )= rutozida, albastra ( Rf cca.0,45 )= acid clorogenic si portocalie ( Rf cca. 0,05-0,10 )= 7 glucosil-3-ramnogalactozide ale kempferolului si cvercetolului.

Determinare cantitaiva. Se folosesc metode volumetrice de titrare indirecta a bazicitatii alcaloizilor totali ( extrasi si purificati prin treceri succesive din sare in baza si extractie cu solventi adecvati ) dupa indepartarea bazelor volatile prin incalzire la 105 C.

Dozarea alcaloizilor totali ( conf. F R pagina )

Dozarea alcaloizilor totali si a scopolaminei se bazeaza pe izolarea preparativa prin CSS a scopolaminei din totalul alcaloidic si titrarea bazicitatii ( direct si indirect ) atat a totalului alcaloidic, cat si a scopolaminei.

Tehnica de lucru: 5,000 g p. uscat si maruntit se trateaza cu 150 ml apa acidulata cu 45 picaturi acid sulfuric 10% ( R ) ( cca. 3ml ); se agita timp de 1 ora, apoi se filtreaza la vid, spaland produsul vegetal din palnie cu cate 5 ml apa acidulata de 2-3 ori. Filtratul rezultat se alcalinizeaza cu solutie de hidroxid de amoniu 10% (R) la pH=9 si se extrage in palnie de separare cu cloroform ( 3 x 60 ml ). Extractul cloroformic se filtreaza prin sulfat de sodiu anhidru, iar filtratul se evapora pana la un volum de cca. 5 ml, dupa care se aduce cantitativ ( prin repetate spalari ) intr-un balon cotat de 25 ml si se completeaza la semn cu cloroform ( solutia A ).

Determinarea totalului alcaloidic se efectueaza prin titrare directa: 15 ml sol.A se evapora la sec iar reziduul se mentine 60 minut la 100-105 C. Se dizolva reziduul dupa racire intr-un ml de alcool etilic, se diliueaza cu 20 ml apa proaspat fiarta si racita si se titreaza la microbiureta de 5ml cu solutie acid clorhidric 0,01N pana la coloratie rosie in prezenta rosului de metil.

1 ml HCl 0,01 N................0,00303 g scopolamina

Pentru titrarea indirecta se iau 15 ml sol. A care se evapora la sec, iar reziduul se mentine 60 minute la 100-105 C. Dupa racire, reziduul se dizolva 5 ml cloroform se adauga 5 ml acid sulfuric 0,01N se incalzeste pe baia de apa pana la indepartarea cloroformului si se dilueaza cu apa proaspat fiarta si racita. Dupa racire se trateaza cu hidroxid de sodiu 0,01 N pana la coloratie galbena in prezenta rosului de metil ca indicator.

1 ml H₂SO₄ 0,01 N............0,00303 g scopolamina baza

Produsul vegetal trebuie sa contina minimum 0,2 g% alcaloizi exprimati in scopolamina.

Pentru determinarea scopolaminei se folosesc: solutie etalon de bromhidrat de scopolamina, solutie 1 % in metanol, placi cromatografice 20/20cm, silicagel G Merck tip 60 avand grosimea stratului de 0,35-0,50 mm activate 1 ora la 100-105 C, sistem de solventi: cloroform-metanol ( 1 : 1 ).

Mod de lucru:10 ml sol., extract masurata, se evapora pe baia de apa pana la un volum de 0,5-1 ml, care se pipetaeaza pe linia de start sub forma unei benzi cu lungimea de 12 cm. Balonul se spala de patru ori cu cantitati mici de cloroform ( 0,3 ml ) care se aduc pe linia de start. In paralel se spoteaza0,02 ml solutie etalon de scopolamina ( corespunzator la 200 mg ). Se introduce placa intr-un vas cromatografic saturat cu sistemul de solventi si se lasa sa se migreze pe o distanta de 14-14 cm. Se scoate placa si se usuca la temperatura camerei pana la indepartarea solventului, dupa care se repeta developarea in acelasi conditii. Cromatograma obtinuta se usuca la temperatura camerei cca. 10-15 minute. Se identifica scopolamina etalon prin pulverizare cu reactiv Dragendorff a placii cromatografice dupa acoperirea zonei corespunzatoare probei de analizat. Fata de pozitia spotului corespunzator solutiei etalon se delimiteaza zona de absorbant corespunzatoare probei, se trece cantitativ intr-un balon de 50 ml, se adauga 50 ml metanol absolut si se refluxeaza la refrigerent ascendent timp de 10 minute. Se decanteaza iar supranatantul se filtreaza intr-un balon de 100 ml. Se repeta extractia silicagelului prin refluxare cu 25 ml metanol absolut timp de 10 minute. Solutia metanolica se filtreaza intr-un balon cotat de 100 ml si se spala silicagelul si filtrul de doua cu cate 10 ml metanol absolut. Solutiile metanolice reunite se evapora la sec. Daca se observa urme de silicagel, reziduul se reia cu cloroform, se filtreaza, se spala filtrul si balonul, solutia cloroformica evaporandu-se la sec. Se titreaza prin acelasi procedeu utilizat la dozarea totalului alcaloidic ( direct si indirect ). Produsul vegetal uscat, trebuie sa contina minimum 0,1g % scopolamina.

V . 3 . 1 . BELLADONNAE FOLIUM ET RADIX

Definitie, provenienta

Obtinerea produsului

Caractere macroscopice

Caractere microscopice NT p 135

Reactii de identificare ( vezi partea generala )

Identificare prin CSS (vezi partea generala )

Determinare cantitativa ( vezi partea generala ).

V . 3 . 2 . STRAMONI FOLIUM

Definitie,provenienta.

Obtinerea produsului.

Caractere macroscopice.

Caractere microscopice. TN p 138

Reactii de identificare ( vezi partea generala ).

Identificare prin CSS ( vezi partea generala )

Determinare cantitativa. ( vezi partea generala )

V . 3 . 3 . HYOSCYAMI FOLIUM

Definitie, provenienta.

Obtinerea produsului.

Caractere macroscopice.     

Caractere microscopice.

Reactii de identificare ( vezi partea generala )

Identificare prin CSS ( vezi partea generala )

Determinare cantitativa (vezi partea generala )

V . 3 . 4 . COCAE FOLIUM

Definitie, provenienta.

Obtinerea produsului.

Caractere macroscopice.

Caractere microscopice

Reactii de identificare ( vezi partea generala )

Identificare prin CSS ( vezi partea generala )

Determinare cantitativa ( vezi partea generala )

V . seria 4 . Produse vegetale cu ALCALOIZI IZOCHINOLINICI si CHINOLINICI

Alcaloizii izochinolinici alcatuesc un grup de principii active in a caror structura izohinolina- uneori partial hidrogenata, alteori componenta a unui schelet policiclic.

Dupa structura lor chimica se impart in urmatoarele grupe:

alcaloizi izochinolinici; exemple: - hidrastinina

alcaloizi benzilizochinolinici;      - papaverina

alcaloizi ftalidizochinolinici;      - hidrastina

alcaloizi aporfinici;      - glaucina

alcaloizi diizochinolinici;      - berberina

alcaloizi morfinanici;      - morfina

alcaloizi benzofenentrinici      - chelidonina

alcaloizi bisbenzilizochinolinici      -D-tubocurarina

Formule Ist pag. 347

Proprietati fizico-chimice.

Sunt substante solide, cristalizate, incolore ( papaverina, morfina ) sau colorate ( berberina-galben, sanguinarina-rosu ), insolubile in apa rece, rareori solubile la cald ( berberina, hidrastina, codeina ), cu grade diferite de solubilitate in solventi organici.

Sunt solubule in:

metanol: morfina ;

etanol: morfina, codeina, papaverina, narcotina, berberina, chelidonina tebaina etc.

cloroform: papaverina, codeina, tebaina, cefelina, tebaina, hidrasina, narcotina, berberina, narceina, cotarnina, emetina;

eter etilic: hidrastina, berberina, cotarnina, chelidonina, cheleritrina, emetina;sanguinarina, emetina;

benzen: codeina, narcotina, narceina, hidrastina, tebaina, berberina, cotarnina, chelelitrina,cefelina;

toluen: codeina;

eter de petrol: narcotina;

alcool amilic: morfina, chelidonina, chelelitrina;

acid acetic: narcotina, papaverina, morfina, cefelina;

acizi diluati: cotarnina, chelelitrina;

solutii alcaline: ( NH₄OH )-codeina, narcotina, cotarnina,

(Ca ( OH )₂- morfina,

( Na OH )- berberina.

Alcaloizii saruri sunt solubili in solventi apolari, solubili in apa si in alcool.

Prezenta oxidrililor fenolici imprima alcaloizilor respectivi solubilitatea in solutii alcaline si caracter reducator.

Extractia si purificarea se face in diferite moduri, folosind solvent apolar ( pentru alcaloizii baze tertiare ) sau solvent polar ( pentru alcaloizii saruri si baze cuaternare ). Se recomanda sa se foloseasca solventul selecti

Reactii de identificare. Folosim solutiile apoase ale alcaloizilor din care alcalizii sunt pusi in evidenta prin reactivi de precipitare ( R. Mayer, R. Bouchardat, R. Dragendorff, R. Bertrand ). Se formeaza compusi cristalizati ce permit caracterizarea microchimica a unora dintre ei.

Reactiile specifice unor alcaloizi vom prezenta la produsele ceii contin.

Identificare prin CSS. ( vezi partea generala ).

Determinare cantitativa. De obicei se folosesc metode titrimetrice si spectrofotometrice.

V . 4 . 1 . OPIUM

Opiu

Definitie, provenienta. Este sucul laptos ( latexul ) ce se scurge in urma lezarii capsulelor imature ale diferitelor varietati de Papaver somniferum L/ familia Papaveraceae/ mac de gradina, uscat in conditii naturale. Continutul minim in morfina anhidra este 11%, raportat la substanta uscata.

Obtinerea produsului. Pentru obtinerea opiului, la 8-12 zile dupa caderea petalelor, cand capsulele au ajuns la dimensiuni definitive ( dar nu s-au ingalbenit ), se scarifica cu ajutorul unor cutite sau lame speciale. Inciziile se fac in asa fel incat sa ajunga pana la jumatatea pericarpului. ( grosimea acestuia este de circa 1 mm ) pentru a deschide laticiferele. Inciziile se practica de obicei dupa amiaza sau spre seara. Latexul alb apare sub forma unei picaturi pe suprafata capsulelor, care in contact cu aerul se intaresc si se brunifica in decurs de cateva ore. A doua zi dimineata, picaturile de latex se strang cu ajutorul unor spatule speciale. Felul cum se practica inciziile variaza de la o tara la alta, sau chiar in functie de regiunea producatoare. In unele locuri se fac incizii paralele, in altele una singura.

Opiul brut, recoltat, se tine la umbra, pentru uscare partiala, apoi se da forme diferite. Pentru a se evita aderarea turtelor sau bucatilor intre ele, adeseori se invelesc in frunze, se presara cu seminte etc.

Caractere macroscopice.

Opiul se prezinta sub forma de bucati neregulate sau turte rotune, conice , de marimi diferite. La exterior sunt de culoare bruna inchis sau bruna-negricioasa moi, in stare proaspata si dure dupa uscare. Pe suprafata lor se intalnrsc frecvent fragmente din frunzele de mac, fructe tetragonale de stevie sau staniol.

Fractura este granulara de culoare bruna-deschis sau bruna-roscata . Mirosul este puternic caracteristic, gustul amar intepator si putin agreabil.

Prin incalzire in flacara se topeste. Prin ardere degaja un fum care produce narcoza.

Pulberea are aspect amorf, de culoare cafenie.

Caractere microscopice.

In pulberea de opiu inglobata in glicerina si examinata la microscop se observa numeroase fragmente neregulate de latex, de culoare bruna, cu aspect granular, fragmente din epicrpul capsulelor cu celule cu peretii ingrosati insotite de stomate. Uneori se pot observa si fragmente de vase.

Reactii de identificare.

Se bazeaza pe proprietatile reducatoare ale morfinei imprimate de hidroxilul fenolic si pe prezenta acidului meconic.

Morfina reduce:

- solutia de nitrat de argint amoniacal;

- acidul iodic si

hexacianoferatul ( III ) de potasiu.

Prepararea solutiei de analizat: 0,01 g pulbere de opiu se macereaza cu 10 ml acid clorhidric 2 % ( R ), la cald, 30 minute. Se filtreaza.

Obtinerea albastrului de Prusia : la 1 ml macerat se adauga 1-2 pic. hexacianoferat ( III ) de potasiu ( R ), 2-3 pic. acid clorhidric 10% ( R ) si 1-2 picaturi clorura de fier ( III ) ( R ). Se formeaza hexacianoferatul ( II ) de fier ( III ) de culoare albastra. Reactia poate servi si la dozarea colorimetrica a morfinei.

Formule Ist 350

Cu reactivul Marqui ( R ) 3-4 picaturi adaugate la 1 ml macerat se formeaza o coloratie rosie purpurie care trece prin violet in albastru. Reactia este data de morfina ( rosu purpuriu ), codeina ( violet intens ), tebaina ( slab violet ) si papaverina ( roz-violet ).

Separarea morfinei de ceilalti alcaloizi: 0,01 g pulbere de opiu se alcalinizeaza cu 1-2 picaturi de hidroxide de amoniu diluat ( R ) ( precipita toti alcaloizii ) si se estrage cu 5 ml cloroform ( morfina este insolubila ). Se filtreaza si se evapora solventul. Reziduul cristalin, alb cenusiu obtinut contine toti alcaloizii, in afara de morfina. La adaugarea de 1-2 picaturi reactiv Marqui ( R ) apare o coloratie violeta (codeina ) sau albastra - verzuie ce vireaza prin roz-violet la galben-brun papaverina ).

Reactia acidululi meconic : 1 ml macerat se aciduleaza cu 2-3 picaturi de acid clorhidric diluat ( R ) si se 1-2 pic. clorura de fier ( III ). Dupa incalzire se formeaza o coloratie rosie datorita acidului comenic rezultat din decarboxilarea acidului meconic.

Identificare prin CSS.

Prepararea solutiei A: 0,05 g pulbere de opiu se tritureaza cu 5 ml etanol 70%. Se transvazeaza intr-o eprubeta si se mentine 30 minute in baie de apa la 60 C agitand intermitent. Se filtreaza. Filtrul se spala cu mici cantitati din solventul respectiv care se adauga ulterior peste solutia extractiva, pana la obtinerea a 5 ml solutie. Se aplica la start 0,2-0,5 ml.

Solutii de referinta: in cate 5 ml etanol 70% se dizolva 5 mg morfina, 2,5 mg narcotina ( noscapina ); 0,4 mg papaverina; 0,2 mg codeina; 0,2 mg tebaina; 0,1 mg narceina. Se aplica la start cate 0,2 ml din aceste solutii.

Faza fixa: Silicagel GF₂₅₄ Merck, placi activate.

Faza mobila:

toluol-acetona-etanol ( 45 : 45 : 7 : 3 );

acetona-xilol-metanol-amoniac ( 49,5 : 41,5 : 15 : 4 )

toluol-acetona-etanol-amoniac ( 40 : 40 : 6 : 2 );

toluol-acetat de etil-dietilamina ( 70 : 20 : 10 ).

Ractivi:

a)     U.V 254 nm;

b)     Dragendorff-Munier ( R );

c)     acid sulfuric 97% ( R ); cu mentinerea placilor la 110 C timp de 5-7 minute

dupa pulveriazre;

d)     reactiv Marqui ( R ).

In U. la 365 nm papaverina are o fluorescenta albastra, iar cu reactivul Dragendorff-Munier toti alcaloizii dau spoturi portocaliu-rosietice.

Valorile Rf ale alcaloizilor separati in solventul 1- Dupa E. Stahl.

Ist.351 tab 8

In solventul 4 morfina si codeina migreaza mai usor atingand valori Rf mai mari decat in solventul 3.

Valorile Rf ale alcaloizilor separati insolventii 3 si 4. ( dupa Wagner ).

Ist. P 351.

Determinare cantitativa,

se poate efectua:

titrimetric;

iodometric;

colorimetric;

cromatografic.

Metoda titrimetrica se bazeaza pe separarea selectiva a morfinei de alcaloizii secundari si pe dozarea bazicitatii sale cu acid clorhidric sau sulfuric 0,1 N ( indicator rosu de metil )-conform FR IX-a pag 522.

In FR- X-a dozarea se face in mediu neapos.

Separarea si purificarea morfinei se realizeaza prin precipitarea alcaloizilor secundari cu hidroxid de calciu ( morfinatul de calciu este solubil ), apoi a morfinei cu hidroxid de de amoniu si prin indepartarea impuritatilor cu eter sau cloroform ( morfina este insolubila in acesti solventi ).

Iodometric morfina se datoreaza prin reducerea acidului iodic la iod metaloidic care se tireaza cu tiosulfat de sodiu.

Metodele colorimetrice se bazeaza tot pe proprietatile reducatoare ale morfinei si folosesc ca substante reducatoare hexacianoferatul ( III ) de potasiu pentru formarea albastrului de Prusia , ori fosfowolframatul de sodiu ( reactiv Folin ) sau molibdatul de sodiu si wolfram ( reactiv Folin-Ciocalteu ). In cazul acestor metode acidul meconic si alte substante cu caracter reducator sunt indepartate prin absorbtie pe florisil.

Conditii de puritate.

Produsul vegetal Opim pulvis se poate impurifica cu pulberi de diferite fructe, amidon, nisip. Idendificarea acestor impuruficati se face prin examen microscopic si prin determinarea cantitativa a morfinei, substantelor solubile in cenusii.

Extractia si izolarea alcaloizilor din Opiu. ( metoda Schwayzer ).

Extractia se face cu ajutorul apei prin agitare la temperatura camerei ( cea mai mare parte a narcotinei nu se solubilizeaza ). Dupa separarea precipitatului in filtrat se adauga clorura de calciu ( 1/10 din greutatea probei de opiu ) si se incalzeste la 60-65 C. Precipita meconatul si sulfatul de calciu, alcaloizii romanand in solutie sub forma de clorhidrati. Se filtreaza. Solutia rezultata se concentreaza sub presiune scazuta, pana la volum si se lasa in repaus. Cristalizeaza clorhidratii de morfina si codeina ( amestecul lor = sarea lui Gregory ). Precipitatul cristalin ( A ) este retinut prin filtrare si prelucrat pentru separarea celor doi alcaloizi din amestec,iar filtratul(B ) este folosit la izolarea altor alcaloizi ( papaverina, tebaina, narcotina ).

Separarea morfinei de codeina din sarea lui Gregory ).

Precipitatul cristalin A se dizolva in apa ( pentru 1 g precipitat se folosesc 10 ml apa ) apoi se adauga amoniac ( R ) pana la pH=7,5-8 cand precipita morfina. Se retine prin filtrare, se transforma in clorhidrat si se purifica cu hidroxid prin cristalizare.

Codeina ramasa in solutia amoniacala se precipita cu hidroxid de sodiu 10 % in exces ( pH= 9-10 ). Precipitatul retinut se dizolva in acid fosforic 1% ( R ) si se purifica prin cristalizare.

Izolarea papaverinei, tebainei si narcotinei din filtratul B: dupa separarea precipitatului alcatuit din amestecul celor doi alcaloizi ( morfina, codeina ), solutia amoniacala se dilueaza cu 1 volum apa si se adauga un exces de amoniac ( R ) ( pH= 9-10 ). Precipita tebaina, papaverina, narcotina si narceina. Se filtreaza. Precipitatul se suspenda in hidroxid de potasiu 1 % ( R ) ( pana la consistenta de pasta ) si dupa 10-15 min. de contact se dilueza cu apa. In aceste conditii se dizolva papaverina si tebaina; ramane nedizolvata narcotina care se separa prin filtrare si se purifica prin cristalizare din alcool.

Solutia alcalina lipsita de narcotina se trateaza cu acid acetic si acetat bazic de plumb. Precipita papverina care dupa filtrare este solubilizata in acid clorhidric 1 % ( R ) si se cristalizeaza prin concentrarea libera sau sub presiune scazuta a acestei solutii.

Din solutia plumbica se indeparteaza plumbul cu acid sulfuric 1 % ( R ), iar din filtrat se precipitatebaina cu amoniac, se filtreaza apoi se recristalizeaza din alcool.

Schema Ist 353

V . 4 . 2 . PAPAVERIS IMMATURI FRUCTUS

Capita Papaveris

Capete ( capatani ) de mac

Definitie, provenienta.

Fructele recoltate inainte de maturitate de la diverse varietati de Papaver somniferum L., familia Papaveraceae, macul de gradina. Se mai numesc si opiu diluat din cauza continutului redus de alcaloizi ( 1 % morfina anhidra ).

Obtinerea produsului.

Caractere macroscopice.

Caractere microscopice. N. 163

Reactii de identificare. Se pot executa pe solutii extractive sau sectiuni.

Prepararea solutiei de analizat: 1 g capita Papaveris pulvis ( sita V ) se macereaza pe baia de apa la 60 C, timp de 30 minute, cu 10 ml acid clorhidric 1 % ( R ), agitand intermitent. Se filtreaza. Dupa racire solutia apoasa acida se extrage de 2 ori cu cate 3-4 ml eter. Solutia eterica ( E ) serveste la identificarea acidului meconic. Solutia apoasa acida epuizata cu eter se alcalinizeaza cu hidroxid de amoniu 10 % ( R ) si se extrage mai intai cu alcoolul amilic ( solvent selectiv pentru morfina ( solutia A ), cu benzen ( extrage codeina, tebaina, narcotina, narceina ) (solutia B ), apoi cu cloroform ( extrage papaverina ) ( solutia C ).

Identificarea m o r f i n e i.

Reziduul rezultat din concentrarea a 1-2 ml sol. A la adaugarea de 2-3 pic. reactiv Marquis ( R ) se coloreaza in rosu purpuriu care in timp devine violet intens, apoi albastru.

Daca reziduul este tratat cu 2-3 picaturi reactiv Fr hde ( R ) se obtine o coloratie violeta care trece succesiv in albastru, verde, galben si roz in final, datorita reducerii preogresive a acidului molibdic.

Identificarea celorlati alcaloizi ( tebaina, narcotina ).

1-2 ml sol. B se concentreaza la rezidu ; prin adaugare de 2-3 picaturi reactiv Fr hde ( R ) se formeaza o coloratie verde.

In aceleasi conditii cu reactivul Marquis ( R ) se obtine o coloratie rosie-violeta.

Identificarea p a p a v e r i n e i.

Reziduul rezultat din concentrarea solutiei C, prin tratare cu 2-3 picaturi reactiv Marquis ( R ) se coloreaza mai intai in verde-albastrui, apoi in violet, verde si galben-brun.

Identificarea a c i d u l u i m e c o n I c.

Solutia eterici ( E ) se agita cu 1 ml clorura de fier ( III ) 1 % ( R ). Dupa separare stratul apos se coloreaza in rosu ( meconat feric ).

Identificare prin CSS.

Prepararea solutiei A: 1 g produ vegetal pulverizat ( sita V ) se macereaza pe baia de apa la 60 C timp de 1 ora, cu 10 ml etanol 70%, sub agitare. Se filtreaza. Sedepun la start in banda cate 0,2-0,5 ml.

Faza fixa: silicagel HF₂₅₄ sau F₂₅₄ Merck, placi activate.

Faza mobila:

1 - toluol - acetona - etanol ( 45 : 45 : 7: 3 );

2 - acetona - xilol - metanol - amoniac (49,5 : 41,5 : 15 : 4 );

3 - toluol - acetona - etanol - amoniac ( 40 : 40 : 6 : 2 );

4 - toluol - acetat de etil - dietilamina ( 70 : 20 : 10 ).

Reactivi:

a - U. 254 nm;

b - Dragendorff- Munier ( R );

c - acid sulfuric 97 % ( R ) cu mentinerea placilor la 110 C timp de 5-7 minute dupa pulverizare;

d - reactiv Marquis ( R ). In UV la 365 nm papaverina are o fluorescenta albastra.

Cu reactivul Dragendorff - Munier toti alcaloizii dau spoturi portocaliu-rosietice.

Rf-urile sunt incluse in tabelul prezentat anterior.

V . 4 . 3 . IPECACUANHAE RADIX

Radacina de ipeca

Definitie, provenienta.

Radacinile plantei Cephaelis ipecacuanha Willd. ( sin. Uragoga Ipecacuanha Baillon ), familia Rubiaceae, cu cel putin 2 % alcaloizi totali exprimati in emetina.

Obtinerea produsului.

Caractere macroscopice.

Caractere microscopice. N 166

Reactii de identificare.

Sunt pozitive reactiile de precipitare cu reactivii generali ai alcaloizilor.

Prin oxidare cu cloramina sau clorat de potasiu se obtin compusi de culoare portocalie. Reactioneaza alcaloizii cu grupari oxidril-fenolice libere ( cefelina, psihotrina ).

Cu acid sulfomolibdenic in prezenta acidului clorhidric se formeaza zone concentrice verzi si purpurii.

Prepararea solutiei A: 0,5 g pulbere de ipeca se extrage de doua ori cu cate 5 ml acid clorhidric 2 % ( R ). Solutiile reunite se filtreaza. Filtratul se aduce cu NH₄OH 10% ( R ) la pH 8-9. Dupa racire se extrage cu eter ( 2x5 ml ). Stratul eteric separatde cel apos se deshidrateaza prin mentinere pe sulfat de sudiu anhidru.

3 ml solutie eterica se concentreaza la reziduu. Acesta se dizolva in 2 ml acid clorhidric diluat. Se divizeaza in trei eprubete. Una serveste ca martor, iar in celelalte doua se adauga 1-2 picaturi reactiv Mayer sau 1-2 picaturi reactiv Bertrand. In prezenta alcaloizilor se obtin precipiate sau opalescente, albe sau galbui.

3 ml solutie eterica se concentreaza la reziduu, intr-o capsula. Dupa dizolvarea reziduului in 1 ml acid clorhidric 10 % ( R ) si adaugarea catorva cristale de cloramina ( R ) sau clorat de potasiu ( R ) apare o coloratie portocalie ( cefelina, psihotrina ).

2-3 picaturi solutie eterica se aduc pe o hartie de filtru. Dupa evapoarea eterului se adauga 1-2 picaturi din amestecul acid sulfuric N ( R ) si permanganat de potasiu 0,1 N ( 5:2, v/v ). In U. alcaloizii din ipeca dau fluorescenta albastra ( cefelina, psihotrina ).

3 ml solutie eterica se concentreaza in capsula pe baia de apa. Reziduul se trateaza cu 1-2 picaturi acid sulfomolibdenic ( R ) si 1-2 picaturi acid clorhidric conc. ( R ) formeaza zone concentrice verzi si purpurii.

Identificare prin CSS.

Obtinerea solutiei A: 0,10 g Ipecacuanhae radix pul. ( V ) se umecteaza cu 3-4 picaturi amoniac 10% ( R ) si se extrage, dupa uscare, cu 5 ml amestec etanol-cloroform ( 1 : 4 ). Se agita intermitent timp de 30 minute. Se filtreaza si se evapora pe baia de apa. Reziduul se dizolva in 1ml amestec etanol-cloroform ( 1 : 4 ). Se aplica la start 15 m

Solutii de referinta: solutii etanolice 0,5% de clorhidrat de emetina si clorhidrat de cefelina. Se aduc la start cate 0,5 ml.

Faza fixa: silicagel G 60, placi activate

Faza mobila:

1) - clorura de metilen - metanol ( 85 : 15 ) ;

2) - toluen - acetat de etil - dietilamina ( 70 : 20 : 10 ), camera saturata ;

3) - cloroform - metanol (85 : 15 ).

Reactivi:

a)     U. 365 nm;

b)     Dragendorff-Munier

c)     Iod sol.cloroformica 0,5 % ( R ).

In solventul 3 separa cefelina la Rf = 0,20, emetina la Rf= 0,40 ( Wagner ); sub cefelina migreaza psihotrina ( fluorescenta bleu ); in regiunea emetinei apare o- metil-psihotrina ( fluorescenta galbena ).

Cefelina si emetina dau fluorescenta albastra in U., galben albicios ( emetina ) sau rosu brun ( cefelina ) cu reactivul c in vizibil.

Cele doua spoturi se deosebesc intre ele prin raportul emetina-cefelina (2-3:1)

Dupa FR X pagina 556-557 se procedeaza astfel:

Faza fixa: silicagel G ( R );

Faza mobila: amoniac conc - metanol - cloroform ( 0,5 : 6,5 : 93

Solutia A: 0,1 pulbere de radacina de ipeca ( V ) se umecteaza cu 0,05 ml amoniac concentrat ( R ), se adauga 5 ml cloroform ( R ), se agita intr-o palnie de separare timp de 30 minute si se filtreaza. 1 ml filtrat se dilueaza cu cloroform la 25 ml, intr-un balon cotat.

Pe linia de start a placii cromatografice se aplica 10 ml solutie, pe o distanta de 2 cm, sub forma de banda. Placa cromatografica se introduce in vasul cromatografic cu developant, se lasa pana cand acesta a migratpe o distanta de aproximativ 14 cm de la linia destart, se scoate si se usuca la aer. Dupa evaporarera developantului se pulverizeaza uniform cu iod ( R ) 10 g/l in cloroform ( R ) si se tine in etuva, la 60 C, timp de 10 minute. Dupa racire se examineaza in U. la 366 nm.

Pe cromatograma trebuie sa apara urmatoarele pete:

o pata cu fluorescenta albastru-deschis, cu Rf de apromaxitiv 0,36 (cefelina );

o pata cu fluorescenta galbena, cu Rf de aproximativ 0,55 ( emetina ).

Pe cromatograma mai poate sa apara o pata pe linia de start.

Pe kieselgel GF₂₅₄ in solventul cloroform-metanol ( 85 : 15 ) se obtin urmatoarele rezultate - dupa Stahl.

Ist volii 366

Determinare cantitativa. ( conform F.R.X ).

2,5 g pulbere de radacina de ipeca ( VII ) se agita cu 70ml eter ( R ), intr-un balon cu dop rodat, timp de 5 minute. Se adauga 2 ml amoniac 100mg/l ( R ) si se agita timp de 1 ora. Se adauga 2 ml apa, se agita energic si se lasa in repaus pana la separarea stratului eteric. Solutia eterica decantata se filtreaza prin vata intr-un balon de distilare. 36 ml solutie filtrata ( 2 g pulbere ) se distileaza in baia de apa la aproximativ 45 C pana la sicitate. Reziduul se dizolvain 1 ml alcool 90 ; se indeparteaza alcoolul pe baia de apa. Balonul cu reziduu se tine in etuva, la 105 C, timp de 5 minute. Reziduul se dizolva, prin incalzire pe baia de apa, in 1 ml alcool (R), in prealabil neutralizat. Se adauga 20,0 ml acid sulfuric 0,01 mol/l, rosu de metil solutie (I) si excesul de acid sulfuric 0,01 mol/l se titreaza cu hidroxid de sodiu 0,02 mol/l pana la coloratie galbena.

1 ml acid sulfuric 0,01 mol/l corespunde la 0,0048 g emetina.

OBSERVATIE. Cand se prescrie Ipecacuanhae radix se foloseste pulbere de radacina de ipeca. Daca pulberea de radacina de ipeca contine mai mult de 2,0% alcaloizi totali, aceasta se dilueaza cu lactoza la concentratie de 2,0%.

V . 4 . 4 . CHELIDONII HERBA

Rostopasca

Definitie, provenienta.

Partea aeriana inflorita a plantei Chelidonium majus L. rostopasca, iarba de negi, iarba randunichii familia Papaveraceae, uscata dupa recoltare. Contine cel putin 0,4 % alcaloizi totali exprimati in chelidonina.

Obtinerea produsului.

Se recolteaza partile aeriene in perioada de inflorire, dupa care se usuca la temperatura ambianta.Fiind o planta toxica se vor lua toate masurile de precautie la recoltare, mai ales la uscare si ambalare.

Caractere macroscopice.

Tulpini cilindrice, ramificate, prevazute cu peri lungi si rari. Frunze alterne, sesile sau pedunculate, penat-partite in 5-7 lobi rotunjiti, crenelati pe margine, cu lobul terminal mai mare si de obicei trilobat, de culoare verde pe fata superioara si verde-cenusie pe fata inferioara. Florile, reunite in inflorescente umbeliforme, asezate la varfurile ramurilor, au la baza pedunculilor bractee scamiforme; caliciu format din doua sepale caduce, corola formata din patru petale ovate de culoare galbena, numeroase stamine,ovar unilocular, bicarpelat si multiovular care se transforma la maturitate intr-o capsula siliculiforma cu seminte ovale, brune.

Caractere microscopice.

Sectiunea transversala a tulpinii prezinta o epiderma cu peri tectori pluricelulari, 2-3 straturi de celule colenchimatoase, alungite tangential si 5-6 straturi de fibre lignificate, galbene, cu lemn larg; fasciculule libero-lemnoase, colaterale, sunt dispuse circular si insotite de lacticifere articulate in regiunea liberiana, cu un continut galben-brun.

Sectiunea transversala a frunzei prezinta o epiderma superioara cu celule izodiametrice, rotunjite sau ondulate. Epiderma inferioara este formata din celule ondulate, cu numeroase stomate de tip anomocitic. Parenchimul palisadic este format dintr-un singur strat de celule; parenchimul lacunar, format din 4-6 straturi de celule, este bogat in spatii intercelulare. Fascicolul libeo-lemnos, colateral, este inconjurat de un periciclu colenchimatos si insotit de numeroase laticifere in regiunea liberiana, cu un continut galben-brun.

Reactii de identificare

Precipitare cu reactivii Mayer sau Bertrand. ( vezi partea generala ).

Identificare prin CSS.

Prepararea solutiei A: 1 g produs vegetal pulverizat ( sita V ) se agita 30 minute cu 20 ml amestec eter-etanol - amoniac ( R ), ( 45 : 4 : 1 ). Se filtreaza. Filtratul se deshidrateaza pe sulfat desodiu anhidru si se distila pana la reziduu. Acesta se dizolva in 1ml eter ( sunt solubile: chelidonina, cheleritrina, sangvinarina ). Din solutie se depun la start in banda continuu 0,05-0,1 ml.

Solutii de referinta: se obtin prin dizolvarea a cate 0,01 g substanta pura in cate 10 ml solvent ( eter pentru chelidonina si protopina, etanol pentru clorurile de sanguinarina, cheleritrina, coptizina si berberina. )

Faza fixa: silicagel G Merck tip 60 si 60 F₂₅₄ ( placi activate ).

Faza mobila:

1 ) cloroform - etanol ( 75 : 3 );

2 ) xilen - metiletilcetona - etanol - dietilformamida ( 20:20:3:1)

3 ) xilen - acetat de etil ( 8 : 2 )

4 ) n-propanol - acid formic - apa ( 90 : 1 : 9 )

5 ) acetat de etil - metanol - apa ( 100 : 13,5 : : 10 )

6 ) toluen - metanol ( 86 : 14 ).

Solventii 1-3 se folosesc pentru placi de silicagel Merck tip 60, solventii 4-6 pentru silicagel 60 F₂₅₄.

Valorile Rf ale alcalozilor separati in solventul 4 ( Wagner )

Tabel Ist 363

Identificare prin metoda CSS dupa FR X.

Faza fixa : Silicagel G ( R )

Faza mobila : n-propanol - acid formic anh. - apa ( 90 : 1 : 9 ).

Solutia A : La 0,75 g pulbere de rostopasca ( VI ) se adauga 200 ml acid acetic ( R ) 120g/l, intr-un balon, se acopera cu o palnie si se tine in baia de apa timp de 30 minute agitand des. Dupa racire, se dilueaza cu acid acetic ( R ) 120g/l la 250 ml si se filtreaza; se indeparteaza primii 20 ml filtrat. 50 ml filtrat se alcalinizeaza cu amoniac concentrat ( R ) pana la pH 9-10 si se agita de doua ori cu cate 30 ml cloroform ( R ), intr-o palnie de separare. Solutiile cloroformice reunite se usuca pe sulfat de sodiu anhidru ( R ), se filtreaza si se evapora la siccitate, in baia de apa la aproximativ 40 C, cu ajutorul unui curent de aer. Reziduul se dizolva in 1 ml metanol ( R ).

Pe linia de start a placii cromatografice se aplica 20ml din solutia de mai sus pe o distanta de 2 cm, sub forma de banda.

Placa cromatografica se introduce in vasul cromatografic cu developant, se lasa pana cand acesta a migrat pe o distanta de aproximativ 16 cm de la linia de start, se scoate, se usuca la aer si se examineaza:

n     la lumina zilei;

n     in lumina U. la 366 nm;

n        la lumina zilei dupa pulverizare cu tetraiodobismutat ( III ) de potasiu pentru cromatografie ( R ), uscare la aer timp de cateva minute si pulverizare cu nitrit de sodiu-solutie ( R ).

Inainte de pulverizare, pe cromatograma examinata la lumina zilei si in lumina U. la 366 nm, trebuie sa apara urmatoarele pete :

o pata cu Rf de aproximativ 0,10, de culoare galbena, cu fluorescenta galben-intens;

o pata cu Rf de aproximativ 0,35, de culoare portocalie, cu fluorescenta portocalie ( sanguinarina ).

Pe cromatograma mai pot sa apara urmatoarele pete:

o pata cu Rf de aproximativ 0,15, de culoare galben-luminos, cu fluorescenta galbena ( cheleritrina );

alte pete fluorescente, de culoare galbena, albastra si portocalie, cu Rf mai mare decat al sanguinarinei.

Dupa pulverizare cu reactivii de identificare, pe cromatograma examinata la lumina zilei trebuie sa apara pe langa petele mentionate anterior, urmatoarele pete colorate in brun-roscat;

o pata cu Rf de aproximativ 0,50 ( chelidonina );

alte pete cu Rf mai mare decat al chelidoninei.

Pe cromatograma mai poate sa apara o pata cu Rf de aproximativ 0,25 ( protopina ).

Determinare cantitativa.( dupa FR X ).

10 g pulbere de rostopasca ( VI ) se umecteaza uniform cu un amestec format din 10 ml hidroxid de sodiu 300 g/l ( R ) si 5 ml alcool ( R ). Se lasa lasa la macerat intr-un pahar de laborator acoperit, timp de 4 ore, se aduce cantitativ intr-un cartus de hartie de filtru si se extrage cu cloroform ( R ) intr-un aparat de extractie continua pe baia de apa, timp de 6 ore. Solutia cloroformica se usuca pe sulfat de sodiu anhidru ( R ), se filtreaza cantitativ intr-un balon de distilare si se concentreaza pe baia de apa pana la un volumde aproximativ 5 ml. Se adauga 10,0 ml acid sulfuric 0,01 mol/l si se continua distilarea pana la indepartarea urmelor de cloroform. Pe peretii balonului de distilare se depune o substanta grasa care se indeparteaza prin filtrarea continutului balonului prin vata; balonul si vata se spala cantitativ cu mici portiuni de apa. La filtrat se adauga rosu de metil solutie ( I ) si excesul de acid sulfuric 0,01 mol/l se titreaza cu hidroxid de sodiu 0,02 mol/l pana la coloratie galbena.

1 ml acid sulfuric 0,01 mol/l corespunde la 0,00706 g chelidonina.

V . 4 . 5 . CHINAE CORTEX

Scoarta de China

Definitie, provenienta.

Obtinerea produsului.

Caractere macroscopice.

Caractere microscopice. NT 160

Reactii de identificare.

Alcaloizii din Chinae cortex dau precipitate cu reactivii generali de precipitare ai alcaloizilor.Reactia specifica a chininei este rectia de precipitare cu reactivul Dragendorff cand se obtine un precipitat rosu, solubil in acetona si eter acetic.

Reactiile specifice sunt cele de culoare.

Prepararea solutiei de analizat: 1-2 g Chinae cortex pul ( V ) se trateaza cu 3-6 ml apa si 3-6 picaturi acid clorhidric conc. intr-un vas cu dop. Proba acoperita se incalzeste timp de 10 minute in baia de apa in fierbere. Dupa racire se adauga 5-10 ml cloroform si amoniac 15% pana la pH 9 si se agita puternic 10-15 minute; se adauga 1-2 g pulbere de tragacantha care determina clarificarea si separarea stratului cloroformic. Dupa filtrare prin vata solutia cloroformica obtinuta ( A ) contine alcaloizii baza, in care predomina chinina, va servi pentru urmatoarele reactii:

-- 1-2 ml solutie cloroformica ( A ) se incalzeste pe baia de apa, reziduul se solubilizeaza in 2 ml acid sulfuric 5%. Solutia examinata in lumina U. prezinta o fluorescenta albastra, care dispare in prezenta ionilor de clor, hidroxiacizilor halogenati, hiposulfitilor. Reactia nu este specifica si in cazul cand este pozitiva, se va verifica natura alcaloidului prin cromatografia in strat subtire.

-- 1-2 ml solute cloroformica ( A ) se aduc la reziduu, care se trateaza cu 1-2 ml acid sulfuric diluat pana la dizolvare; se adauga 1 ml tinctura de iod, 1 picatura acid sulfuric concentrat si se incalzeste. Dupa racire se depun cristale verzi, cu luciu metalic ( iodosulfat de chinina ).

-- Reactia Prudhomme: 1-2 ml solutie cloroformica ( A ) se aduc la reziduu, care se dizolva in 3-4 ml acid acid sulfuric diluat, apoi se trateaza cu cateva picaturi solutie 4% eosina ( tetrabromfluoresceina ). Apare un precipitat rosu ( eosinati de chinina si chinidina ), solubil in cloroform. Reactia este sensibila dar este data si de alti alcaloizi ( atropina, pilocarpina, eserina ).

--Reactia taleochinica:

a.( varianta clasica ) 1-2 ml cloroformica ( A ) se aduc la reziduu, dupa care se dizolva in 3 ml alcool, se adauga 0,1 g cloramina ( R ), 1 ml acid clorhidric si se agita timp de 1 minut. Se alcalinizeaza cu amoniac 25% ( R ), adaugat picatura cu picatura; apare o colratie verde ( taleochinina ).

Reactia nu este data de cinconina si cinconidina.

b.     Tehnica Monnet : 2 ml solutie cloroformica ( A ) se trateaza cu 3 ml acid acetic 1 % si se agita. Stratul apos ( acetatii de chinina si chinidina ) prezinta o fluorescenta albastra. Se adauga apoi picatura cu picatura, agitand de fiecare data urmatorii reactivi: apa de brom diluata1% pana la coloratie galbena persistenta si amoniac 10% pana la usoara alcalinizare. Stratul cloroformic se coloreaza in verde. ( taleochinina ). Prin neutralizare cu acid clorhidric ( R ), coloreaza in albastru, iar prin acidulare, trece in violet, apoi in rosu-brun. O noua alcalinizare face sa reapara coloratia verde.

-Proba Grahe: 0,10 g Chinae cortex pul( V ) se incalzesc la flacara intr-o eprubeta uscata, cand se formeaza vapori rosiatici care se condenseaza pe peretii superiori ai eprubetei sub forma unor picaturi mici de gudron rosu-violaceu. Gudronul se dizolva 4-5 ml alcool diluat si se aciduleaza cu 1-2 picaturi acid sulfuric ( R ); solutia prezinta o fluorescenta albastra datorita produsilor de pirogenare ai chininei si chinidinei.

Identificare prin CSS.