COLORAREA

Este etapa prin care se urmareste cresterea contrastului dintre diferitele componente tisulare prin modificarea indicilor de refractie ai substratului morfologic cu ajutorul colorantilor

Tehnica de colorare depinde de natura fixatorului utilizat si de tesutul pe care dorim sa il examinam.

Substantele folosite pentru colorare se numesc coloranti.

COLORANTUL HISTOLOGIC

Este o substanta chimica colorata de obicei de natura organica care poate intra in celula atasandu-se la nielul componentelor celulare si permitand astel diferentierea lor optica.

Nu toate substantele colorate sunt coloranti.

In molecula unui colorant se pot identifica una sau mai multe

grupari cromofore - purtatoare de culoare

grupari auxocrome - capacitatea de a colora

Colorantii se fixeaza de substrat prin legaturi electrochimice si de hidrogen in functie de gruparile auxocrome.

GRUPARILE AUXOCROME

1. Ionizate ( principale ) - formeaza legaturi electrochimice cu substratul
2. Neionizate ( secundare) - formeaza legaturi de hidrogen cu substratul. Acest tip de legatura mareste stabilitatea colorantului.

CLASIFICAREA COLORANTILOR

1. Dupa natura lor
1. Naturali

i. vegetali : hematoxilina ,safranina , orceina , turnesolul

ii. animali :carminul

2. Sintetici : albastru de metil
1. Dupa caracterele chimice
1. Acizi - sunt de obicei saruri de acizi organici unde gruparea auxocroma principala este incarcata electric negativ. El se ataseaza pe un substrat morfologic incarcat electric poziti
2. Bazici - gruparea auxocroma principala incarcata electric pozitiv deci se a atasa pe un substrat morfologic negativ
3. Neutri - grupari auxocrome principale incarcate eletric pozitiv si negativ ei fiind solutii apoase de coloranti bazici si acizi intr-o anumita proportie.

Din punct de vedere chimic celulele sunt alcatuite din :

1. apa
2. saruri minerale
3. glucide
4. lipide
5. proteine

Primele patru sunt fie indepartate in etapele care preced includerea la parafina fie hidrolizate. Pentru ca aceste substante sa fie pastrate in celula sunt necesare fixari speciale care sa transforme aceste substante solubile in substante insolubile. De exemplu tetraoxidul de osmiu insolubilizeaza lipidele.

Proteinele , desi sufera modificari conformationale in structura tertiara si cuaternara in cursul etapelor care preced colorarea , ele nu sunt extrase reprezentand astfel substratul molecular la nivelul carora se fixeaza colorantii prin legaturi electrochimice si de hidrogen.

Proteinele sunt alcatuite din secvente de aminoacizi.

In functie de tipul gruparilor ionizabile din structura proteinele sunt

1. acide
2. bazice
3. neutre

Cand pH mediului este identic cu punctul izoelectric al mediului respectiv ambele grupari sunt ionizate.

In mediul acid ramane ionizata gruparea amino; in aceste conditii proteinele se comporta ca baze avand afinitate pentru coloranti acizi, deci au caracter acidofil. Majoritatea proteinelor citoplasmatice sunt bazice deci au caracter acidofil colorandu-se cu coloranti acizi : de exemplu EOZINA care coloreaza citoplasma in roz-rosu.

In mediu bazic ramane ionizata gruparea carboxil si proteinele se comporta ca acizi avand afinitate pentru coloranti bazici deci au caracter bazofil. Nucleul avand caracter bazofil se va colora cu coloranti bazici - ex. Hemalaunul care coloreaza nucleul in albastru inchis- violet.

CONCLUZIE

In coloratiile histologice generale si in parte in coloratiile histologice speciale substratul molecular al colorarii e reprezentat de proteinele de constitutie care dupa natura lor si in functie de conditiile de colorare , pun la dispozitia colorantului cationul amino ce fixeaza colorantii acizi cu grupari auxocrome negative sau anionul carboxil ce fixeaza colorantii bazici cu grupari auxocrome pozitive.

ETAPELE COLORARII

1. deparafinarea - pentru ca solutiile colorate fie apoase fie alcoolice nu sunt suficient de penetrante pentru a fii utilizate pe sectiunile impregnate la parafina. Se realizeaza cu solventi de tipul hidrocarburilor benzenice. Pentru aceasta se trec preparatele prin 3 bai succesive de 2-5 min. in functie de solubilitatea parafinei de grosimea , de temperatura preparatului
2. hidratare - eliminarea solventilor parafinei facand astfel posibila colorarea. In acest scop se trece sectiunea prin 3 bai succesive fiecare cu alcool etilic sau metilic in concentratii descrescande. Daca solutia de colorare este apoasa se trece in continuare sectiunea in apa distilata.
3. mordansare (la nevoie)
4. colorarea propriu-zisa - se face cu solutii colorante apoase sau alcoolice

4. spalare - daca sectiunile trebuie sa fie montate intr-un mediu anhidru pentru indepartarea excesului de colorant si se efectueaza cu apa distilata
5. deshidratare - obligatorie pentru majoritatea colorantilor histologici deoarece acestia sunt diluati fie in apa fie in alcool diluat. Se realizeaza cu alcool in concentratie crescanda.
6. clarificare - se face cu xilol fiind necesara pentru indepartarea alcoolului.

METODE DE COLORARE

1. Pot fi
1. Vitale      - prin folosirea unui colorant vital care este incorporat de animal in timpul vietii. Substanta colorata incalzita la temperatura corpului se injecteaza i.v. sau intraperitoneal ,operatie care se repeta cateva zile. Dupa sacrificarea animalului se recolteaza cateva piese care se expun la aer pana ce apare colorarea. Ea persista numai atata timp cat celulele supravietuiesc in vitro.
2. Permanente - pentru colorarea preparatelor permanente.
2. Dupa nr. de coloranti utilizati :
1. Simple - foloseste un singur colorant
2. Combinate (policroma) - se folosesc 2 sau mai multi coloranti

i. Succesiva

ii. Simultana ex . : hemalaun - eozina van Gieson , azan

3. Dupa mecanism
1. directa - rezulta din simplu contact dintre colorant si substrat
2. indirecta - necesita prezenta unui mediator sau MORDANT , intre colorant si substrat. Acesta fixeaza colorantul de componentele celulare. Complexul format intre colorant si mordant se numeste LAC.
1. progresive - prin incercari succesive sub control microscopic pana se ajunge la momentul optim de colorare aceasta oprindu-se prin spalare
2. regresive prin actiunea prelungita a colorantului pana la obtinerea unei supracolorari apoi se actioneaza cu un agent chimic decolorant numit DIFERENTIATOR a carui actiune este oprita prin spalare in momentul in care au ramas colorate numai structurile pe care vrem sa le evidentiem.. aceasta metoda de colorare nu este reversul precedentei . prin utilizarea diferntiatorului se pot evidentia structuri care nu pot fii puse in evidenta prin colorarea cu metoda precedenta. Aceasta se explica prin faptul ca diferentiatorul este si mordant. Ex. Coloratia Nissl.
5. Poate fi:
1. Ortocromatica - substratul se coloreaza in aceeasi culoare ca si cea a colorantului
2. Metacromatica - substratul se coloreaza in alta culoare ca cea a colorantului

IMPREGNARI METALICE

Sub actiunea unor reductori se produce un fin precipitat de metal care se depune pe diferitele elemente de tesuturi putand pune in evidenta structuri care in mod obisnuit nu se coloreaza cu coloranti

Metalul este pus in contact cu tesutul sub forma unor solutii saline . Reducerea este datorata in parte actiunii proprii a tesutului in parte actiunii substantelor chimice reducatoare si sau agentilor fizici.

Metalele cele mai folosite sunt : Ag Au , Os , Hg.

METODE DE IMPREGNARE METALICA

Prin reducerea sarii argentice de catre o componenta celulara si se obtine o alta sare argentica care este apoi redusa la Ag metalic sarea argentica este redusa daca tesutul insusi contine o substanta cu proprietati reductoare puternice . Acestea pot fii prezente in mod natural in tesut sau pot fii produse prin tratamente chimice inainte ca sarea de Ag sa fie aplicata. Substantele biologice care au astfel de proprietati sunt de tip fenolic.demonstrarea lor prin reactie de impregnare argentica se numeste REACTIE ARGENTAFINA. depozitul de Ag metalic poate fii format cu ajutorul unui agent reducator adaugat FORMALINA . Ag. se depune pe un component organic particular al sectiunii numit ARGIROFIL. aceasta este denumita REACTIE ARGIROFILA.

Aceasta metoda este folosita pentru evidentierea elementelor din tesutul epitalial conjunctiv si in cercetarea sistemului nervos.

COLORATIA HEMALAUN EOZINA

Este coloratia histologica cea mai des utilizata in laboratoarele de histologie si anatomo-patologie.

Utilizeaza 2 coloranti

1. hemalaunul - colorant bazic
2. eozina - colorant acid

HEMALAUNUL

Se obtine din hematoxilina o substanta de natura vegetala si incolora extrasa cu eter din scoarta unui arbore. Prin maturare se transforma in HEMATEINA de culoare galben-rosietic dar lipsita de capacitatea de a colora. Aceasta este supusa procesului de mordansare cu ALAUN DE Fe si se obtine HEMALAUNUL substanta colorata cu proprietati de colorant. Acesta este un colorant bazic care coloreaza nucleul celulei deoarece se combina cu radicalii fosfat acizi ai acizilor nucleici principalii constituenti chimici nucleari.

TEHNICA COLORATIEI HEMALAUN EOZINA

Bateria de colorare contine

1. hemalaun
2. eozina
3. hidrocarburi benzenice
4. alcool

Acestea se folosesc in tratamentele pre- si post- colorare.

ETAPE

1. Deparafinarea - consta in dizolvarea parafinei cu solventi de tipul hidrocarburilor benzenice de ex. xilol. Se trec preparatele prin 3 bai succesive de 3 - 5 min. fiecare.
2. Hidratarea - consta in trecerea preparatului prin 3 bai succesive ce contin alcool in concentratii descrescande. In practica cand vrem sa coloram in acelasi timp mai multe preparate , folosind aceeasi baterie de colorare , lamele sunt introduse cu un decalaj ce se respecta pe tot parcursul procesului. Daca solutia coloranta este apoasa se trece in continuare sectiunea prin apa distilata
3. Colorarea
1. Prima data in hemalaun timp de 3 - 5 min , dupa care este spalat cu apa pentru a intrerupe actiunea colorantului
2. Al doilea colorant - eozina - timp de 1 - 2 min , dupa care sectiunea se spala pentru a indeparta excesul de colorant
4. Deshidratarea - cu alcool in concentratii crescande pana la alcool absolut
5. Clarificarea - pentru indepartarea alcoolului cu xilol
6. Montarea - in balsam de Canada

REZULTATE

1. nuclei - albastru - violet
2. citoplasma - roz- rosu

COLORATIA HEMALAUN - EOZINA CU ALBASTRU DE METIL

Este o coloratie tricroma ce utilizeaza trei coloranti

1. hemalaun
2. eozina
3. albastru de metil

REZULTATE

1. Nuclei - violet
2. Citoplasma - albastru - cenusiu
3. Fibrele de colagen - albastru intens

COLORATIA VON GIESON

Este o coloratie tricroma ce foloseste trei coloranti

1. hematoxilina ferica
2. acidul picric
3. fuxina acida

REZULTATE

1. Nuclei - negri
2. Citoplasma - galben
3. Fb. de colagen - rosu intens

COLORATIA MASSON

Este o coloratie tricroma ce foloseste

1. hematoxilina ferica
2. solutia coloranta A ce contine fuxina acida
3. solutia coloranta B ce contine albastru de anilina

REZULTATE

1. Nuclei - negru
2. Citoplasma - rosu - violet deschis
3. Fb. de colagen - albastru intens

COLORATIA MALLORY

Se utilizeaza :

1. fuxina acida
2. albastru Mallory ( contine albastru de anilina si orange G )

REZULTATE

1. Nuclei - rosu intens
2. Citoplasma - rosie
3. Fb. de colagen si reticulina - albastru
4. Tesut muscular neted - violet
5. Tesut muscular striat - rosu - portocaliu

COLORATIA AZAN

Se utilizeaza :

1. azocarmin C
2. albastru Heidenhein , cu anilina si orange G

REZULTATE

Nuclei - rosu - viu

Citoplasma - rosu

Fb. de colagen si reticulina - albastru deschis

Tesut muscular striat - rosu , orange sau galben

COLORATII CITOLOGICE

Sunt utilizate pentru evidentierea anumitor organite celulare

METODA CAJAL DA FANO

Utilizata pentru evidentierea complexului Golgi

REZULTATE

1. Nuclei - necolorati
2. Aparatul Golgi - retea perinucleara de culoare neagra
3. Citoplasma - aurie

METODA HEMATOXILINA FERICA REGAUD

Folosita pentru evidentierea mitocondriilor

REZULTATE

1. Nucleu - necolorat
2. Nucleol - negru
3. Mitocondrii - ca niste puncte negre

TEHNICI DE EXAMINARE A TESUTULUI EPITELIAL

IMPREGNAREA ARGENTICA RANVIER

Este folosita pentru evidentierea interstitiului dintre celulele epiteliului din seroase - limitele intercelulare apar net in culoarea neagra

TEHNICI SPECIALE DE EXAMINARE A TESUTULUI CONJUNCTIV

COLORATIA CU ALBASTRU DE TOLUIDINA

Se evidentiaza granulatiile din mastocite prin coloratie metacromatica in rosu - violet

METODE PENTRU EXAMINAREA FIBRELOR CONJUNCTIVE

1. Fibrele de reticulina - se examineaza folosind o metoda electiva - IMPREGNAREA ARGENTICA - si apar colorate in negru
2. Fibrele elastice - se poate utiliza coloratia cu
1. Rezorcin fuxina - albastre
2. Orceina - cafeniu-roscat

TEHNICI SPECIALE PENTRU EXAMINAREA TESUTULUI MUSCULAR

METODA HEIDENHEIN

Metoda are rezultate mai bune cand fibra este sectionata longitudinal , cand se evidentiaza structura periodica a miofibrilelor. Se remarca alternanta de zone clare si intunecate.

Cand fibra este sectionata transversal apare ca o formatiune punctiforma de culoare neagra.

TEHNICI SPECIALE PENTRU EXAMINAREA TESUTULUI NERVOS

1. Metoda Nissl - este o metoda regresiva , metacromatica si se foloseste pentru evidentierea corpusculilor Nissl , care apar ca o retea punctiforma violeta in toata citoplasma , iar nucleul - negru

REZULTATE

imagine de ansamblu - albastru deschis

nuclei - albastru palid cu periferia intens colorata

nucleol - albastru-violet

2. Impregnarea argentica - este o metoda folosita pentru evidentierea

neurofibrilelor - IMPREGNAREA RAMON Y CAJAL

prelungirile nervoase - IMPREGNAREA ARGENTICA GOLGI

microglia - IMPREGNAREA ARGENTICA RIO HORTEGA

3. Metoda cu acid osmic - pentru evidentierea tecii de mielina care va aparea impregnata in negru
4. Metoda cu hematoxilina cromica floxina - este utilizata pentru evidentierea granulelor de neurosecretie care apar sub forma unor compusi bazofili colorati in albastru