Cromatografia pe gel permeabil

Cromatografia pe gel permeabil sau cromatografia de excludere difuziune

este o tehnica cromatografica al carei mecanism de separare se bazeaza pe diferenta de dimensiuni moleculare ale componentelor probei de analizat; se-pararea componentelor se mai datoreaza si intarzierilor relative determinate de difuzia in porii fazei stationare.

Practic nu are loc distributia componentelor de separat intre faza mobila si cea stationara cu ajutorul diferitelor forte intermoleculare, ca in procesele cromatografice propriu zise, ci separarea componentelor cu ajutorul mate rialelor cu porozitate bine definita, care consta in excluderea moleculelor mari care depasesc dimensiunile porilor si accesibilitatea totala sau partiala a mole-culelor mai mici in interiorul porilor.

Mecanismul elementar de separare in CGP se explica prin faptul ca parti-culele de umplutura poseda canale conice in care patrund moleculele compo-nentelor de separat, considerate sferice.

Cu cat dimensiunile moleculelor componentelor vor fi mai mici, cu atat ele

vor patrunde mai adanc in porul conic, timpul de retinere al acestora fiind mai

mare decat in cazul moleculelor de dimensiuni mai mari, care patrund doar partial sau nu patrund deloc in porii granulelor de umplutura.

Timpii de retinere diferiti provoaca intarzieri inegale ale componentelor in

coloana cromatografica producandu-se in acest fel separarea lor.

Fluxul de faza mobila antreneaza permanent moleculele de dimensiuni mari in timp ce moleculele mai mici, care patrund mai mult in porii granu-lelor de gel vor fi retinute, deci intarziate, in masura gradului de difuzie in interiorul porilor.

Moleculele componentelor vor fi eluate din coloana cromatografica in or-dinea descrescatoare a dimensiunilor lor, respectiv a maselor lor molare, adica intai cele mari, apoi cele medii, iar in final cele mici.

Componentele separate sunt identificate din efluent prin spectrofotometrie in ultraviolet, refractometrie, ionizare in flacara, spectrofotometrie in infrarosu sau spectrofotometrie de absorbtie atomica.

CGP nu este o metoda absoluta; interpretarea cantitativa a rezultatelor ne-cesita calibrarea aparatului si trasarea curbei de calibrare pentru sistemul gel - solvent respectiv, folosind etaloane cu masa molara cunoscuta.

Faze stationare

In CGP se folosesc ca faze stationare diverse materiale solide, caracterizate printr-o structura poroasa, perfect controlabila si reproductibila.

La alegerea fazei stationare trebuie avut in vedere sa se selectioneze acea umplutura cu dimensiuni ale porilor care sa corespunda domeniului de mase molare (dimensiunilor moleculare) ale componentelor de separat.

In cazul in care nu se poate acoperi intreg domeniul de dimensiuni mole-culare, cum este cel al probelor foarte complexe, cu o faza stationara de o anu-mita porozitate, se procedeaza la cuplarea mai multor coloane in serie, fiecare continand materialul adecvat.

Materialele folosite pentru umplerea coloanelor in CGP trebuie sa indeplineasca o serie de conditii:

sa nu fie adsorbante;

sa posede stabilitate chimica;

sa aiba proprietati fizico mecanice adecvate, care sa permita folosirea

unor viteze mari de curgere a fazei mobile

sa fie compatibile cu solventii folositi;

particulele sa fie sferice, uniforme si de dimensiuni mici, pentru a realiza

rapid echilibrul si pentru a rezista la comprimare;

sa fie ieftin.

Se cunosc doua tipuri de materiale folosite ca faze stationare:

Xerogelurile, de tipul polimeri reticulati, care se umfla in prezenta unui solvent, formand un mediu poros relativ mare, porii fiind constituiti din spa-tiile dintre lanturile polimerice ale retelei. Din aceasta categorie cele mai importante sunt gelurile dextranice reticulate cu epiclorhidrina, al caror repre-zentant principal este Sephadexul, care poseda un numar mare de grupe OH, care ii confera un puternic caracter hidrofil. In practica se comercializeaza diverse tipuri de Sephadex, dintre care tipul G este cel mai cunoscut, posedand grade diferite de reticulare, respectiv de umplere, ceea ce il face apt pentru un domeniu larg de separare.

In functie de scopul separarii, calitatea si dimensiunile Sephadexului sunt diferentiate: in cromatografia de inalta rezolutie se foloseste Sephadex tip G superfin, cu diametrul particulelor uscate de 10 mm, iar in scopuri prepa-rative se foloseste tip G fin, mediu si mare, cu diametrul particulelor uscate de 20 150 si 100 mm.

Aerogelurile sunt materiale rigide, solide poroase, care permit patrunderea solventului, dar care nu-si schimba forma, deci nu se umfla; in aceasta categorie intra silicagelul si sticla poroasa, sub denumirea comerciala de Porasil, Merckogel, Bioglass.

Hibrizii xerogel - aerogel sunt materiale intercalate intre cele doua cate-gorii mai sus mentionate, cu o structura destul de rigida, dar care se umfla in prezenta solventilor organici. Din aceasta categorie fac parte gelurile poli-stirenice de tip stiren divinilbenzeni, al caror reprezentant mai cunoscut este Styragelul.

Faze mobile

Avand in vedere faptul ca in CGP faza mobila nu are contributii in rea-lizarea rezolutiei separarii, alegerea ei se face in functie de viscozitatea si indicele de refractie al acesteia.

La selectionarea fazei mobile trebuie avut in vedere solubilitatea ei; un bun solvent trebuie:

sa dizolve proba de analizat;

sa aiba caracteristici chimico structurale apropiate cu gelul pentru a l u -

mecta, evitand in acest fel adsorbtia componentelor; solventul trebuie sa umfle gelul poros, marimea porilor fiind functie de natura solventului care imbiba gelul;

sa aiba viscozitate corespunzatoare; solventii cu viscozitate ridicata nu

sunt adecvati deoarece impiedica difuzia componentelor de separat, scazand rezolutia separarii; pe de alta parte, solventii cu viscozitate scazuta permit folosirea unor coloane lungi, pentru o cadere de presiune data, ceea ce se traduce printr-o eficienta crescuta de separare a coloanei;

sa fie compatibili cu tipul de detector folosit: pentru detectorii refractro -

metrici, bazati pe masurarea indicelui de refractie, este indicat a se folosi sol-venti care sa prezinte valori ale acestei caracteristici mult diferentiate de cele ale componentelor separate; in cazul folosirii detectorilor spectrofotometrici este indicata folosirea unor solventi care nu absorb in domeniul de lungimi de unda pentru care este calibrat detectorul.

Gama solventilor folositi ca faza mobila in GCP este mare, cei mai des uti-lizati fiind apa, cloroformul, tetrahidrofuranul si dimetilformamida; tetrahidro-furanul, datorita domeniului larg de solubilitate si a indicelui de refractie scazut, se remarca printr-o frecventa utilizarea ca eluent al coloanelor CGP.

De mentionat ca in cazul gelurilor de tip polistirenic (Styragel) trebuie evitata folosirea solventilor acetona si alcooli.

In general, pentru a preveni fenomenul de adsorbtie a componentelor pe gel, se indica intrebuintarea solventilor polari.

Aparatura

Aparatura CGP este simpla, asa dupa cum se prezinta in figura 5.3.

Figura 5.3       Schema de principiu a unei instalatii de separare prin cromatografie pe gel permeabil rezervor pentru solvent; 2 pompa; 3 coloana de separare; 4 coloana de rferinta ;5 -ssitem de detectie; 6 inregistrator; 7 colector de fractiuni ; 8 colector de solvent pentru circuitul de referinta).

Coloanele cromatografice sunt confectionate din sticla (pentru presiuni de operare sub 3,5 bari) sau otel pentru presiuni de lucru mai mari de 3,5 bari; dimensiunile lor variaza in limitele: diametrul 6 - 40 mm, iar lungimea intre 10 -150 cm, functie de scopul separarii, analitic, respectiv, preparativ.

In cazul folosirii coloanelor din sticla se procedeaza la acoperirea lor inte-rioara cu solutie de 5 % dimetildiclorsilan in cloroform, pentru a evita influ-enta peretilor asupra procesului de separare.

Sistemul de pompare trebuie sa asigure un flux continuu de solvent, cu debit variabil, in limitele 0,1 - 0,5 ml / minut; pulsatiile pompei deranjeaza sistemul de detectie, motiv pentru care aparatele CGP sunt echipate cu amor-tizoare de pulsatii.

De mare importanta in construirea unei instalatii CGP este realizarea unor legaturi (conexiuni) intre diversele parti componente de asa maniera incat sa asigure etanseitatea perfecta, evitand pierderile de solvent.

Instalatiile CGP au in componenta lor si un vas de degazare a solventului, care are scopul de a elimina aerul dizolvat din solvent; prezenta aerului in solvent faciliteaza formarea canalelor preferentiale in stratul de gel, datorita bulelor, ceea ce duce la micsorarea capacitatii de separare a coloanei.

Introducerea probei de analizat in aparat se realizeaza cu ajutorul unor dispozitive speciale.

Folosirea CGP in scop preparativ implica marirea dimensiunilor coloa-nelor de separare; acest lucru induce dificultati, in sensul ca folosirea coloa-nelor cu diametrul mai mare de 15 mm atrage dupa sine micsorarea capacitatii de separare datorita neomogenitatii umpluturii, si in special a segregarii particulelor de gel: cele cu dimensiuni mari au tendinta de a se acumula langa peretele coloanei.

O instalatie CGP pentru scopuri preparative este formata din o baterie de 4 coloane din otel, cu lungimea de 122 cm, diametrul de 6 cm, umplute cu geluri de diferite porozitati, functie de natura probei de analizat.

Viteza de curgere a fazei mobile este de 50 ml / minut, iar cantitatea de proba introdusa este de 100 ml, de concentratie 1 %.

Referitor la separarea prin CGP prezentam unele aspecte evidentiate din activitatea practica:

modificarea vitezei de curgere prin coloana CGP, pentru probe cuprin -

zand componente cu domeniu larg de mase molare, induce modificarea formei cromatogramei, pozitia picurilor ramanand neschimbata;

marimea si distributia particulelor de gel influenteaza eficienta de separa-

re a coloanei; s-a constatat ca cea mai buna eficienta se obtine pentru particule de gel cu diametrul mediu mai mare sau egal cu 0,01 cm;

marirea eficientei coloanei se obtine cand raportul dintre diametrul coloa-

nei si cel al particulei scade;

capacitatea de rezolutie creste liniar cu cresterea lungimii coloanei; pen -

tru acest motiv aparatele CGP sunt echipate cu baterii de coloane legate in

serie;

efectul concentratiei probei de analizat este mai pronuntat cand distributia

maselor molare este ingusta si cand aceasta caracteristica are valori ridicate;

timpul de injectie influenteaza forma cromatogramei, volumul de eluat

crescand cu cresterea timpului de injectie;

temperatura modifica volumul de eluat, prin influenta ei asupra solubili -

tatii si volumului hidrodinamic al componentei dizolvate; cresterea tempera-turii mareste valoarea volumului eluat, precum si porii gelului, micsorand astfel volumul interstitial al coloanei.

Performanta procesului de separare cromatografica este dirijata de triada de factori independenti: puterea de rezolutie, viteza de elutie, cantitatea de proba analizata, care pot fi dispusi in varfurile unui triunghi echilateral; majorarea unui parametru atrage dupa sine micsorarea celorlalti doi, realizarea unui compromis intre acesti factori asigura obtinerea unei performante mari a procesului de separare cromatografica.

Aplicatiile CGP

De regula, CGP reprezinta o treapta intermediara, mai avansata, in schema de separare a diverselor amestecuri, realizand separarea componentelor dupa marimea moleculelor lor, fiind plasata dupa CSL de adsorbtie pe silicagel si alumina; se obtin subfractiuni constituite din componente inrudite din punct de vedere chimico-structural, relativ omogene.

Subfractiunile separate prin CGP sunt analizate detaliat din punct de vede-re chimico structural prin metode spectrale: spectrometria de masa, rezonanta magnetica nucleara etc.

Dintre numeroasele aplicatii ale CGP, amintim: separarea oligozaharidelor pe Sephadex G 50, folosind ca faza mobila solutie de acid acetic 0,1 molar, proteine, pe Sephadex G 100, cu acid acetic 50 %, steroizi, peptide, antibiotice, hidrocarburi aromatice policiclice etc.