METODA DE IDENTIFICARE SI DETERMINARE CANTITATIVA PENTRU HEXAMIDINA, DIBROMOHEXAMIDINA, DIBROMOPROPAMIDINA SI CLORHEXIDINA

METODA DE IDENTIFICARE SI DETERMINARE CANTITATIVA PENTRU      HEXAMIDINA, DIBROMOHEXAMIDINA, DIBROMOPROPAMIDINA SI CLORHEXIDINA

1.SCOP SI DOMENIU DE APLICARE

Acesta este metoda reglementata pentru determinarea cantitativa si calitativa a:

hexamidinei si sarurilor sale, inclusiv izetionatul si 4-hidroxibenzoatul,

dibromohexamidinei si sarurilor sale, inclusiv izetionatul,

dibromopropamidinei si sarurilor sale, inclusiv izetionatul,

diacetatului, digluconatului si dihidroclorurii de clorhexidina in produsele cosmetice

2.DEFINITIE

Concentratiile de hexamidina, dibromohexamidina, dibromopropamidina si clorhexidina determinate prin aceasta metoda sunt exprimate in procente masice (% m/m).

3.PRINCIPIU

Identificarea si determinarea este realizata prin cromatografie de lichid de inalta performanta (HPLC), in faza inversa, cu pereche de ioni, urmata de detectie spectrofotometrica in ultraviolet. Hexamidina, dibromohexamidina, dibromopropamidina si clorhexidina sunt identificate prin timpii lor de retentie in coloana cromatografica.

4.REACTIVI

Toti reactivii trebuie sa fie de puritate analitica si adecvati HPLC, unde este cazul.

4.1. Metanol

4.2. Acid 1-heptansulfonic, sare de sodiu, monohidratat

4.3. Acid acetic, glacial (d₂₀ = 1,05 g/ml)

4.4. Clorura de sodiu

4.5. Faze mobile:

4.5.1.Solvent I : acid 1-heptansulfonic solutie 0,005 M, sare de sodiu, monohidratat (4.2) in metanol (4.1), adus la un pH aparent de 3,5 cu acid acetic glacial (4.3).

4.5.2. Solvent II : acid 1-heptansulfonic solutie 0,005 M, sare de sodiu, monohidratat (4.2) in apa, adus la un pH de 3,5 cu acid acetic glacial (4.3).

Observatie : Daca este necesara imbunatatirea formei picurilor, fazele mobile pot fi modificate si preparate dupa cum urmeaza:

solvent I: se dizolva 5,84 g clorura de sodiu (4.4) si 1,1013 g acid 1-heptansulfonic, sare de sodiu, monohidratat (4.2) in 100 ml apa. Se adauga      900 ml metanol (4.1) si se aduce la un pH aparent de 3,5 cu acid acetic glacial (4.3),

solvent II: se dizolva 5,84 g clorura de sodiu (4.4) si 1,1013 g acid 1-heptansulfonic, sare de sodiu, monohidrat (4.2) intr-un litru de apa si se aduce la un pH de 3,5 cu acid acetic glacial (4.3).

4.6. Diizetionat de hexamidina [C₂₀H₂₆N₄O₂ 2C₂H₆O₄S]

4.7 .Diizetionat de dibromohexamidina [C₂₀H₂₄Br₂N₄O₂ 2C₂H₆O₄S]

4.8. Diizetionat de dibromopropamidina [C₁₇H₁₈Br₂N₄O₂ 2C₂H₆O₄S]

4.9. Diacetat de clorhexidina [C₂₂H₃₀Cl₂N₁₀ 2C₂H₄O₂]

4.10. Solutii de referinta: se prepara solutii 0,05% (m/v) din fiecare dintre cei patru conservanti (4.6 pana la 4.9) in solvent I( 4.5.1)

4.11. 3,4,4'-Triclorocarbanilida (triclocarban)

4.12. 4,4'-Dicloro-3-(trifluorometil)carbanilida (halocarban)

5.APARATURA

5.1.Echipament uzual de laborator

5.2.Cromatograf de lichid de inalta performanta cu detector UV cu lungime de unda variabila

5.3.Coloana analitica: otel inoxidabil, lungime 30 cm, diametru interior 4 mm, umpluta cu m-Bondapack C₁₈, 10      mm, sau echivalent

5.4.Baie ultrasonica

6.IDENTIFICARE

6.1.Preparare proba

Se cintareste circa 0,5 g proba intr-un balon cotat de 10ml si se aduce la semn cu solvent I (4.5.1). Se pune balonul pe o baie ultrasonica (5.4) timp de 10 minute. Se filtreaza sau se centrifugheaza solutia. Se colecteaza filtratul sau supernatantul pentru cromatografie.

6.2.Cromatografiere

6.2.1.Gradient faza-mobila

6.2.2. Se regleaza debitul fazei mobile (6.2.1) la 1,5 ml/min si temperatura coloanei la 35.

6.2.3. Se fixeaza lungimea de unda a detectorului la 264 nm.

6.2.4. Se injecteaza 10ml din fiecare dintre solutiile de referinta (4.10) si se inregistreaza cromatogramele lor.

6.2.5. Se injecteaza 10ml din solutia proba (6.1) si se inregistreaza cromatograma sa.

6.3. Se identifica daca hexamidina, dibromohexamidina, dibromopropamidina sau clorhexidina este prezenta prin compararea timpului (timpilor) de retentie al picului (ai picurilor) inregistrat(e) in (6.2.5) cu cele obtinute din solutiile de referinta in 6.2.4.

7.DETERMINARE

Preparare solutii standard.

Se foloseste drept standard intern unul dintre conservantii (4.6 pana la 4.9) care este absent din proba. Daca aceasta nu este posibil, pot fi folosite ca standard intern, triclorcarbanul (4.11) sau halocarbanul (4.12).

O solutie stoc 0,05% (m/v) in solvent I (4.5.1) de conservant identificat la 6.3.

O solutie stoc 0,05% (m/v) in solvent I (4.5.1) de conservant ales drept standard intern.

7.13. Pentru fiecare conservant identificat, se prepara patru solutii standard prin transferarea intr-o serie de baloane cotate de 10ml a unor cantitati de solutie stoc de conservant identificat (7.1.1) si a unor cantitati adecvate de solutie stoc de standard intern (7.1.2) in conformitate cu tabelul de mai jos. Se aduce fiecare balon la semn cu solvent I (4.5.1) si se amesteca.

7.2.Preparare proba

7.2.1 Se cantareste cu precizie circa 0,5 g ("p" grame) proba intr-un balon cotat de 10ml, se adauga 1,0ml solutie standard intern (7.1.2) si 6ml solvent I (4.5.1) si se omogenizeaza.

7.2.2. Se pune balonul pe o baie ultrasonica (5.4) pentru 10 minute. Se raceste. Se aduce la semn cu solvent I si se omogenizeaza. Se centrifugheaza sau se filtreaza prin hartie de filtru cutata. in functie de caz, se colecteaza pentru cromatografie supernatantul sau filtratul.

7.3.Cromatografiere

7.3.1. Se regleaza gradientul fazei mobile, debitul de curgere, temperatura coloanei si lungimea de unda a detectorului echipamentului HPLC (5.2) la conditiile cerute de etapa de identificare (6.2.1 pana la 6.2.3).

7.3.2. Se injecteaza 10ml solutie proba (7.2.2) si se masoara suprafetele picurilor. Se repeta procesul cu noi portiuni de 10ml solutie proba pana cand se obtin rezultate consistente. Se calculeaza raportul dintre suprafata picului produsa de compusul de analizat si suprafata picului produs de standardul intern.

7.4.Etalonare

7.4.1. Se injecteaza 10ml din fiecare solutie standard (7.1.3) si se masoara suprafetele picurilor

7.4.2. Pentru fiecare solutie standard (7.1.3), se calculeaza raportul dintre suprafata picului hexamidinei,dibromohexamidinei, dibromopropamidinei sau clorhexidinei si suprafata picului standardului intern. Se traseaza o curba de etalonare folosind aceste rapoarte ca ordonata, iar ca abscisa concentratiile corespondente ale conservantului identificat in solutiile standard, in micrograme per mililitru.

7.4.3. De pe curba de etalonare (7.4.2) se citeste concentratia de conservant identificat, corespunzatoare raportului suprafatelor picurilor calculat la 7.3.2

CALCUL

Se calculeaza continutul de hexamidina, dibromohexamidina, dibromopropamidina sau clorhexidina in proba, ca procent masic, folosind urmatoarea formula:

in care:

p = masa in grame a probei pentru testare (7.2.1);

c = concentratia conservantului in solutia proba, in micrograme per mililitru, obtinuta din curba de etalonare;

MW₁ = masa moleculara a formei bazice a conservantului prezent;

MW₂ = masa moleculara a sarii corespunzatoare (vezi punctul 10).

REPETABILITATE (ISO 5725)

Pentru o concentratie de hexamidina, dibromohexamidina, dibromopropamidina sau clohexidina de 0,1% (m/m) diferenta dintre rezultatele a doua determinari efectuate in paralel pe aceeasi proba nu trebuie sa depaseasca 0,0005%.

TABEL DE GREUTATI MOLECULARE