Determinarea sensibilitatii germenilor fata de substante cu actiune antibacteriana

Determinarea sensibilitatii germenilor fata de substante cu actiune antibacteriana

Sensibilitatea germenilor fata de antibiotice si chimioterapice se stabileste in mod curent prin metode difuziometrice si prin metoda dilutiilor seriate.

Metode difuzimetrice

Metodele difuzimetrice se executa pe medii solide si au la baza proprietatea antibioticelor de a difuza in mediul de cultura, pe diferite suprafete de la locul in care sunt depuse. Testul este cunoscut si sub denumirea de antibiograma. Antibiograma se poate efectua in scop clinic, in scop epidemiologic si in scop stiintific.

In majoritatea tarilor, in laboratoarele de diagnostic s-a acceptat pentru antibiograma metoda standardizata recomandata de O.M.S., care se bazeaza pe utilizarea microcomprimatelor care contin substante antibacteriene, din care substanta activa difuzeaza in mediul de cultura solid pe care se dezvolta tulpina bacteriana studiata.

Pentru efectuarea testului sunt necesare urmatoarele materiale:

- cultura bacteriana obtinuta prin izolarea germenilor in stare pura, in mediul lichid de cultura (bulion sau bulion Muller -Hinton). Aceasta cultura, in varsta de 18 - 24 de ore se poate utiliza ca atare sau se poate dilua in bulion steril pentru a realiza o concentratie de germeni ca inocul pe mediul solid;

- microcomprimate cu antibiotice, la noi in tara, laboratoarele de diagnostic utilizeaza microcomprimate standardizate, alese din trusele de lucru livrate de Uzina de medicamente Bucuresti;

- mediul de cultura, se recomanda mediul special pentru antibiograma, respectiv geloza Muller - Hinton;

- germeni martori de referinta, care se pot utiliza in scop de cercetare sau de control, fiind preluati din colectii bacteriene, de exemplu: tulpina de E. coli ATCC 25922, tulpina de Staphylococcus aureus ATCC 25423, tulpina de Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 = de la Institutul Dr. I. Cantacuzino Bucuresti.

Tehnica de lucru

In prealabil se obtine o cultura tanara de 18 - 24 ore, in mediu lichid, a germenului de studiat. Pentru obtinerea de bune rezultate tulpina trebuie sa fie izolata in cultura pura.

Din acest moment se trece la pregatirea mediului pentru antibiograma. Astfel, mediul solid Muller - Hinton se lichefiaza si se repartizeaza in placi Petri in strat gros de 4 mm. Dupa solidificarea mediului placile Petri se lasa la termostat cu capacul intredeschis, timp de 10 - 15 minute, pentru evaporarea apei de condens.

Daca cultura in mediul lichid are o concentratie prea mare in germeni se poate dilua cu mediul lichid steril. Aceasta cultura sau dilutia ei se inoculeaza pe mediul Muller - Hinton din placile Petri, prin inundarea suprafetei mediului si apoi, dupa cateva minute, se aspira excesul de cultura. Insamantarea trebuie facuta astfel incat sa se obtina in final colonii apropiate, dar nu confluente.

Dupa uscarea suprafetei mediului insamantat placa Petri se mentine cu capacul intredeschis, timp de 10 - 15 minute la termostat, se depun cu o pensa fina (oftalmoscopica) microcomprimatele cu substante antibacteriene, respectandu-se distanta de 30 mm intre microcomprimate si 15 mm de la marginea placii Petri. In acest mod pe o placa Petri cu diametru de 100 mm se pot grupa 5-6 microcomprimate.

Dupa 10 - 15 minute (timp de predifuziune) de la plasarea microcomprimatelor, placile Petri se incubeaza la termostat la 37C, urmand o prima citire la 6 - 8 ore si interpretarea definitiva la 18 - 20 ore. Interpretarea se face in functie de diametrul zonei de inhibitie, masurat in mm cu rigla, in doua - trei directii de la comprimat.

Exprimarea rezultatelor se face fie direct prin transcrierea diametrului zonei de inhibitie in mm, cu indicarea limitelor valorilor exprimand sensibilitate sau rezistenta, fie prin traducerea acestei valori in atribute calitative: tulpini rezistente, cu rezistenta intermediara sau tulpini sensibile, conform anumitor criterii specificate in tabele pentru fiecare substanta antibacteriana in parte.

In interpretarea rezultatelor nu se iau in considerare urmatoarele rezultate:

- cultura foarte fina ce poate apare in zona microcomprimatelor cu sulfamide din cauza diferentei de timp intre aparitia culturii (sunt necesare cateva generatii de crestere) si inceputul procesului de inhibitie;

- colonii foarte mici, punctiforme, vizibile numai cu lupa la marginea zonei circulare de inhibitie (mai ales la cloramfenicol), cauzata de roirea tulpinii;

- zona de crestere foarte fina pe aria de inhibitie (mai ales la cloramfenicol), cauzata de roirea germenilor Proteus, in prezenta unei zone circulare de inhibitie foarte net vizibila;

In schimb se vor lua in considerare urmatoarele aspecte:

- colonii mari, bine dezvoltate, aparute in interiorul zonei de inhibitie, acestea reprezinta mutante rezistente in cadrul unei populatii predominant sensibile; astfel de colonii se vor repica, reidentifica si retesta pentru sensibilitate, notandu-se totodata si numarul lor;

- cultura net vizibila, chiar daca prezinta opacitate mai redusa, in cazul in care aceasta este dispusa circular si exista o zona de inhibitie completa, se va nota numai diametrul interior al inhibitiei totale, daca cultura rezistenta cu opacitate mai redusa este prezenta pe toata aria, se va nota diametrul zonei de inhibitie partiala, cu specificarea prezentei culturii rezistente.

Situatiile de mai sus sunt generate de mutante rezistente si precum in cazul unor bacterii cu viteza de multiplicare diferita in cadrul unei populatii heterogene.

De asemenea, in interpretarea rezultatelor trebuie avute in vedere urmatoarele limite sau precautii:

- rezistenta la polimixina si colimicina este uneori inexacta, eroarea fiind cauzata de un inocul prea bogat asociat cu un coeficient redus de difuziune a acestor antibiotice, astfel de situatii se controleaza prin metoda dilutiilor;

- unele tulpini de stafilococ pot apare ca fals sensibile la meticilina in conditiile termostatarii la 37C, rezistenta la acest antibiotic se deceleaza mai bine la 30C sau prin adaugarea la mediu a 5% NaCI, cu conditia folosirii unui inocul bogat;

- tulpinile de Pseudomonas si de stafilococ cu un grad redus de rezistenta la gentamicina vor fi greu de diferentiat de tulpinile sensibile, care dau zone de inhibitie cu 3 - 6 mm mai reduse decat tulpinile de referinta.

In concluzie, desi in interpretarea rezultatelor exista unele posibilitati de eroare, de neconcordanta cu situatia existenta in clinica, totusi testul antibiogramei prin metoda difuzimetrica ramane un test rapid, destul de eficient pentru alegerea unor medicamente utilizate in scopul tratamentului unor infectii bacteriene.

De remarcat ca pe langa metoda difuzimetrica prin intermediul microcomprimatelor, mai exista alte variante si sisteme de executie a metodei. Astfel, se pot utiliza rondele de hartie de filtru imbibate in solutii de antibiotice sau direct antibiotice sub forma de pulberi sau solutii depuse in cilindrii de sticla (prin teava fuzibila), sau in godeuri excavate in mediul solid din placa Petri.

Antibiograma prin metoda dilutiilor

Aceasta metoda are avantajul unei evaluari cantitative exacte si astfel permite stabilirea dozei minime utile in cazuri deosebite, ca si definirea exacta a concentratiei minime inhibante (CMI) sau a concentratiei minime bactericide (CMB).

Principiul metodei consta in punerea in contact a germenului de testat cu dilutii crescande din agentul antimicrobian, in conditii standard de lucru.

Metoda poate fi realizata prin doua variante tehnice, respectiv:

- dilutii seriate in bulion;

- dilutii seriate in mediul gelozat.

Indiferent de procedeul folosit, metoda dilutiilor este mai laborioasa decat metoda difuzimetrica si necesita pregatirea prealabila a solutiilor stock de antibiotice si chimioterapice.

Prepararea solutiilor stock

In acest scop se utilizeaza substante antimicrobiene preparate de firme cunoscute, special pentru antibiograma.

Nu este recomandat sa se utilizeze la prepararea solutiilor medicamentele de uz clinic, deoarece acestea contin pe langa substanta activa si alte ingrediente. Concentratiile uzuale in substanta activa a solutiilor stock folosite pentru antibiograma sunt de 10000 pana la 1280 mcg / ml. Pentru fiecare substanta activa trebuie ales agentul diluant specific. Solutiile stock, avand concentratii mari de substanta activa nu necesita sterilizarea, daca prepararea lor s-a facut cu material si manopera sterila.

De la aceste solutii stock se obtin dilutiile seriate in mediul de cultura. Dilutiile pornesc de regula de la limita superioara de 100 -120 mcg / ml, rareori de la 400 mcg /ml si pot ajunge pana la 0,1 mcg / ml.

In cazul metodei dilutiilor in bulion se pune in contact inoculul din germenul de testat cu dilutii descrescande din agentul antimicrobian - in mediul lichid (bulion Muller - Hinton, sau bulion special cord - creier).

Astfel, in tuburile cu bulion in care s-au executat dilutiile de antibiotic se inoculeaza cate 0,1 ml din dilutia de 1 / 1000 a culturii de 20 de ore in bulion a germenului testat.

Dupa incubare de 18 - 24 de ore la 37C se interpreteaza rezultatele, comparand dezvoltarea culturii fata de tubul martor in care nu se introduce antibiotic.

Titrul bacteriostatic corespunde cu cantitatea minima de antibiotic, care inhiba total dezvoltarea culturii (CMI).

In vederea stabilirii concentratiei minime bactericide (CMB) se transfera cate 0,1 ml sau o ansa plina in placi cu geloza simpla sau geloza cu sange fara antibiotic, din toate tuburile in care s-a constatat inhibitia cresterii.

Metoda dilutiilor in agar.

Ca mediu gelozat se foloseste geloza Muller - Hinton care poate fi suplimentata cu 5% sange defibrinat de berbec sau de cal pentru a permite dezvoltarea germenilor cu necesitati deosebite de crestere. Mediul este repartizat in cantitatile necesare in balonase separate pentru fiecare placa.

Din solutiile stock de antibiotice se realizeaza solutii descrescande de la 100 sau 120 mcg / ml pana la 0,15 mcg / ml, in geloza topita si racita la cca. 50C. De regula, un volum de antibiotic trebuie adaugat la 9 volume de mediu. De exemplu 10 ml solutie de antibiotic de 100mcg / ml se amesteca in 90 ml de mediu obtinandu-se astfel 100 ml de mediu care contine 100 mcg / ml substanta activa care se poate turna in placi Petri si asa mai departe.

Dilutiile se pot efectua si dupa alte scheme de lucru. Pe suprafata placilor cu mediu gelozat si antibiotic se aplica inoculul sub forma de spoturi de 5 - 8 mm cu ajutorul unei anse calibrate, ce elibereaza 0,001 - 0,002 ml. Inoculul provine din dilutia culturii de 20 - 24 de ore in bulion a germenului de testat.

Se inoculeaza prima data placile cu concentratii mici de antibiotice si apoi in continuare in ordine crescanda a continutului in substanta antimicrobiana. Pe o placa se pot testa 6-8 culturi.

Ca martor se foloseste intotdeauna o placa fara antibiotice. Incubarea placilor se face la 37C, pentru 16 - 20 de ore.

Dupa incubare placile se citesc notandu-se, dupa caz, intensitatea culturilor, numarul de colonii sau absenta culturii.

Concentratia minima inhibanta (CMI) reprezinta dilutia cea mai joasa de agent antimicrobian care inhiba cresterea. Nu se ia in considerare prezenta unei singure colonii.

Alaturi de metodele standard pentru determinarea sensibilitatii tulpinilor bacteriene la antibiotice si chimioterapice tot mai frecvent se utilizeaza in laboratoarele de diagnostic unele metode care permit o interpretare rapida si chiar automata a rezultatelor.

Astfel, exista trei categorii de metode:

- metoda difuzimetrica cu citire rapida;

- metoda microdilutiilor;

- metode automate.

Dintre metodele difuzimetrice cu citire rapida amintim metodele bazate pe reducerea hemoglobinei, pe folosirea rezazurinei ca indicator redox si a trifeniltetrazoliumclorid (TTC). Prin aceste metode interpretarea rezultatelor se poate face la 5 - 8 ore. Rezultatele acestei primei citiri au ca coeficient de potrivire de 80 - 85%, cu citirea in ziua urmatoare, citire care este obligatorie pentru un rezultat definitiv.

Metoda microdilutiilor

Reprezinta o simplificare a metodei cantitative de determinare a sensibilitatii germenilor microbieni la antibiotice si chimioterapice.

Metoda este accesibila laboratoarelor de diagnostic, mai ales ca ea se practica in placi de plastic cu godeuri in care repartizarea solutiilor de substante cu actiune antibacteriana se poate face cu pipete automate.

In prezent laboratoarele pot beneficia de placi cu godeuri in care substantele antibacteriene sunt gata reprezentate congelate (sistemul SENSITITRE).

Interpretarea rezultatelor se face usor prin urmarirea turbiditatii din godeuri, dupa un timp scurt de incubatie de 3 - 4 ore.

Testarea sensibilitatii germenilor la antibiotice prin metoda microdilutiilor este un procedeu de mare utilitate, dar necesita un control de calitate cu tulpini bacteriene de referinta, foarte riguros.

Determinarea valorii antibacteriene a substantelor antiseptice si dezinfectante

Valoarea antimicrobiana a unei substante antiseptice sau dezinfectante se exprima in raport cu o alta substanta si anume fenolul, prin coeficientul sau indicele fenolic. Indicele fenolic reflecta cu cat o substanta este mai activa sau mai slaba in comparatie cu fenolul.

Pentru determinarea indicelui fenolic se pregatesc urmatoarele materiale:

- cultura de 24 de ore in bulion din germenii fata de care se determina valoarea antibacteriana a substantei de cercetat;

- o solutie de 2% sau 4% din substanta a carei valoare antibacteriana se cerceteaza;

- eprubete sterile;

- eprubete cu bulion steril.

Tehnica de lucru

Din solutia antiseptica de cercetat se fac dilutii seriate. Din fiecare dilutie se amesteca 1 ml cu cate 1 ml din cultura bacteriana, in bulion de 24 de ore. Dupa 5 minute de contact intre germeni si substanta de cercetat se fac transplantari cu ansa in bulion, din fiecare eprubeta a dilutiei seriate, pentru a controla daca germenii au fost distrusi sau nu in acest interval de timp. Aceeasi manopera se efectueaza la 10 minute. In paralel se lucreaza la fel si cu fenolul.

Stabilirea indicelui fenolic se face astfel: dupa 24 de ore se noteaza dilutia minima de fenol si dilutia maxima din substanta care omoara o suspensie microbiana, in 10 minute, dar nu si in 5 minute. Pentru calcularea coeficientului sau indicelui fenolic se impart cele doua cifre si anume cifra dilutiei active a substantei examinate cu cifra dilutiei active de fenol.

Indicele fenolic = ultima dilutie activa a substantei de cercetat / ultima dilutie activa de fenol.

CONDUITA STABILIRII UNUI DIAGNOSTIC BACTERIOLOGIC

Recoltarea, transportul si pastrarea materialului patologic

Materialele si produsele care se expediaza la laborator pentru diferite examene microbiologice sunt:

- animale in viata (specii mici sau tineret), care prezinta simptomele unei boli microbiene;

- cadavre de animale (specii mici sau tineret);

- diferite produse patologice recoltate de la animale in timpul vietii (secretii, excretii, sange, urina);

- produse patologice, organe (sau fragmente de organe) recoltate de la cadavre;

- frotiuri.

Indiferent de natura materialului si de scopul examenului, se vor respecta urmatoarele norme de lucru:

- expedierea in cel mai scurt timp catre laborator a probelor recoltate si asigurarea unei temperaturi scazute in timpul transportului (aproximativ 0C);

- recoltarea sa fie executata in asa fel incat materialul sa fie expus cat mai putin infectarii cu germeni din mediul ambiant, in cazul materialelor provenind din infectii virotice se vor folosi lichide conservante (exemplu: solutie 5% glicerina in ser fiziologic), pe langa asigurarea de temperaturi scazute in timpul transportului,

- ambalarea materialelor patologice in vederea transportului se va face in asa mod incat sa se asigure o cat mai stricta etenseitate, pentru a evita imprastierea germenilor;

- probele vor fi insotite de note anamnetice, cat mai detailate din partea medicului din teren;

- probele de sange pentru serodiagnostic vor fi recoltate in conditii cat mai curate si sa aiba serul bine exprimat;

- materialul care trebuie trimis pentru examenul bacteriologic depinde de specia microbiana a carei prezenta este banuita sau este necesar sa se obtina un rezultat din partea laboratorului.

Examene efectuate direct din materialul patologic

In cazul in care se prezinta la laborator un cadavru, organ sau alt material patologic in vederea examenului bacteriologic acesta se inscrie intr-un registru, i se da un numar de ordine dupa care se examineaza. Daca nu se examineaza imediat se va pastra la frigider. In executarea diferitelor examene se respecta urmatoarea ordine:

- Examenul anatomopatologic macroscopic, in cazul in care exista leziuni atipice, neconcludente, se recolteaza fragmente de organe in vederea examenului histopatologic;

- Examenul bacteriologic direct, frotiurile se coloreaza prin metoda Gram sau, uneori, prin metoda Giemsa, cand caracterele germenului indica posibilitatea prezentei unei capsule. In cazul unor leziuni nodulare sau focare cu continut cazeos se fac frotiuri colorate prin metode Ziehl - Neelsen (bacili tuberculosi).

- Paralel cu examenul bacterioscopic direct se fac insamantari pe medii de cultura. Alegerea mediului de cultura este conditionata de rezultatele examinarii frotiurilor. In cazul cand acestea nu ofera nici un reper se fac intotdeauna insamantari pe medii aerobe (bulion - agar) si anaerobe (bulion cu ficat - geloza Veillon), simple si cu ser. Pentru bacilul tuberculozei insamantarile se fac indiferent de rezultatul examenului bacterioscopic pe mediul Lwenstein.

In afara acestor examene obligatorii mai sunt posibile si alte probe de diagnostic din materialul patologic cum ar fi inocularile experimentale care se pot realiza direct din materialul patologic (broiaje din organele cele mai bogate in germeni) sau din culturile obtinute prin insamantare.

Examene efectuate din culturi

Rezultatele culturilor se citesc de regula la 24 de ore de la insamantare. Daca la 24 de ore mediile sunt inca sterile se continua observarea lor 2 - 3 zile, dupa care se scot de sub observatie. Pentru bacilii tuberculozei, mediile se tin sub observatie timp de doua luni.

La citirea mediilor insamantate se pot intalni urmatoarele situatii:

- mediile sa ramana sterile, in acest caz materialul patologic din care s-a facut insamantarea se considera bacteriologic steril;

- sa creasca o singura specie bacteriana, in cultura pura, in acest caz s-a izolat o tulpina care urmeaza sa fie identificata (stabilirea genului, speciei, grupului sau tipului);

- sa se obtina o cultura mixta, in acest caz trebuie sa se obtina fiecare specie din acest amestec in cultura pura, dupa care se recurge la identificarea acestora.

Identificarea tulpinilor microbiene

Dupa izolarea tulpinilor microbiene se face identificarea acestora, respectand urmatoarea ordine:

- examenul caracterelor culturale pe medii lichide si solide;

- examenul caracterelor morfologice a germenilor din culturi pe frotiuri colorate uzual prin metoda Gram sau prin alte coloratii, dupa caz. Uneori examenul caracterelor morfologice si culturale este suficient pentru a identifica genul si in unele cazuri chiar si specia, dar in majoritatea cazurilor este nevoie si de cercetarea celorlalte grupe de caractere;

- examenul caracterelor biochimice se face pentru identificarea majoritatii cocobacililor Gram negativi dar si pentru identificarea altor specii;

- examenul caracterelor serologice se face pentru identificarea salmonelelor, brucelelor, a bacilului carbunelui etc.;

- examenul patogenitatii pentru animalele de laborator se poate face direct din materialul patologic sau din culturile obtinute, atat calitativ, cat si cantitativ. Selectionarea testelor de diagnostic in vederea stabilirii genului si a speciei bacteriene se face pe baza rezultatelor obtinute la examenul caracterelor morfologice si culturale. Identificarea unui germen este de multe ori o operatie foarte dificila si in acest caz se recurge la determinatoare. In cazul in care specia nu se incadreaza in nici una din speciile trecute in determinatoare se poate admite izolarea unei specii noi, care poate fi descrisa. Incadrarea acesteia in sistematica se poate face insa cu aprobarea forurilor internationale competente.