FIZIOLOGIA SI METABOLISMUL BACTERIILOR

1.1      NUTRITIA BACTERIILOR

Nutritia reprezinta procesul prin care bacteriile îsi asimileaza substantele plastice si energetice necesare metabolismului. Acest proces se realizeaza prin absorbtia nutrientilor.

Nutrientii reprezinta substante organice sau anorganice care sunt necesare cresterii si multiplicarii bacteriilor. Acestia pot proveni din mediul extern sau din organisme vii, dupa solvire (O2, CO2, saruri minerale, etc.) sau digerare pâna la produsi mai simpli (proteinele aminoacizi, polizaharidele monozaharide, lipidele acizi grasi, etc.).

Pentru a-si asigura nutritia, bacteriile au nevoie de surse de energie, de carbon, de azot, de saruri minerale, de factori de crestere, etc.

Analiza compozitiei chimice a bacteriilor demonstreaza ca mai mult de 95 % din greutatea uscata a acestora este reprezentata de asa-numitele macroelemente (carbon, oxigen, azot, sulf, fosfor). Acestea sunt componente ale proteinelor, carbohidratilor, lipidelor sau acizilor nucleici. Sunt necesare pentru metabolismul bacterian în cantitati relativ mari, de ordinul gramelor litrul de mediu de cultura.

Magneziul, potasiul, calciul si fierul din celula bacteriana se gasesc sub forma de cationi. Aceste elemente sunt necesare bacteriilor, pentru a putea fi cultivate, în cantitati de câteva miligrame litrul de mediu.

De asemenea, bacteriile necesita cantitati reduse, de ordinul microgramelor litru, de microelemente sau oligoelemente (cobalt, zinc, molibden, nichel si cupru).

În functie de sursa de energie din mediu pe care o pot utiliza, bacteriile pot fi:

Bacterii fototrofe (fotosintetizante) – folosesc radiatiile luminoase ca sursa de energie;

Bacterii chimiotrofe (chimiosintetizante) – utilizeaza  energia eliberata ca urmare a unor reactii de oxido-reducere la care participa un donor si un acceptor de hidrogen; în functie de natura donorului de hidrogen, pot fi bacterii chimiolitotrofe (limba greaca: lithos = piatra) care obtin energia prin oxidarea substantelor anorganice si bacterii chimioorganotrofe care îsi procura energia prin oxidarea unor substante organice; acceptorul de hidrogen poate fi oxigenul gazos, compusi anorganici sau organici.

Bacteriile chimiotrofe pot obtine energie prin:

Respiratia aeroba – donorul de H⁺ este o substanta organica iar acceptorul de H⁺ este O2; transferul de electroni se face prin lantul respirator (substrat N.A.D. flavoproteina chinona citocrom b citocrom c citocrom a O2) localizat la nivelul membranei citoplasmatice;

Respiratia anaeroba - donorul de H⁺ este o substanta organica iar acceptorul de H⁺ este o substanta anorga-nica diferita de O2 (nitriti, nitrati, sulfati, carbonati, etc.) transferul de electroni se realizeaza tot la nivelul lantului respirator;

Fermentatia - donorul de H⁺ si acceptorul de H⁺ sunt substante organice; acest proces se poate desfasura si în prezenta O2 dar acesta nu intervine în acest proces

În raport cu modul de obtinerea a energiei, se disting:

Bacterii strict aerobe – necesita prezenta O2 în mediu; folosesc respiratia aeroba (figura 15 - a);

Bacterii strict anaerobe – se dezvolta în absenta O2 care le omoara; utilizeaza fermentatia (figura 15 - b);

Bacterii aerobe, facultativ anaerobe – prefera mediile cu O2, unde folosesc doar respiratia aeroba dar se pot dezvolta si în absenta acestuia, obtinând energia prin fermentatie sau respiratie anaeroba (figura 15 - c);

Bacterii microaerofile – se dezvolta cel mai bine în medii cu concentratii scazute de O2 si pot utiliza respiratia aeroba, anaeroba sau fermentatia (figura 15 - d);.

Bacterii anaerobe aerotolerante – se pot dezvolta si în prezenta O2 dar utilizeaza fermentatia (figura 15 - e);

În functie de sursa de carbon , se disting:

Bacterii autotrofe – folosesc dioxidul de carbon

Bacterii heterotrofe – iau carbonul din compusi organici;

Bacterii mixotrofe – pot utiliza substante organice sau anorganice.

Bacteriile patogene sunt chimioorganoheterotrofe

Sursele de azot sunt, mai frecvent, sarurile de amoniu si, într-o mai mica masura, azotul din aminoacizi, peptide, nitriti sau chiar cel atmosferic.

Un rol esential în nutritia bacteriana îi revine membranei citoplasmatice. Aceasta este o membrana biologica selectiva si o bariera osmotica (rezista la presiunea osmotica intracelulara crescuta) intervenind în reglarea schimburilor între bacterie si mediul extern. La acest nivel are loc absorbtia nutrientilor din mediu si eliminarea produsilor de catabolism, procese care se realizeaza pe toata suprafata membranei. Schimburile se fac prin difuzie pasiva în ambele sensuri (apa, ioni, vitamine, zaharuri simple, saruri minerale, etc.) si transfer activ, catalizat enzimatic de permeaze. Hidrolazele intracelulare descompun nutrientii în compusi simpli, utilizati pentru sinteza componentelor proprii. Procesul este stadial rezultând compusi intermediari cu grad tot mai mare de stabilitate chimica. În fiecare stadiu intervin enzime distincte. De asemenea, membrana citoplasmatica reprezinta sediul enzimelor respiratorii implicate în producerea de energie prin fosforilare oxidativa, contine dehidrogenaze, citocromi, alte proteine ale sistemului transportor de electroni si este sediul unor receptori de suprafata fiind implicata în chemotaxie.

1.2      MOBILITATEA BACTERIILOR

Actual, se considera ca aproximativ jumatate din speciile bacteriene cunoscute sunt mobile adoptând strategii diferite de a se propulsa în mediu.

Motilitatea reprezinta unul dintre criteriile principale de identificare si clasificare a bacteriilor. Aceasta capacitate le permite bacteriilor sa gaseasca si sa se dezvolte în conditii optime de mediu.

Unele înainteaza în medii lichide, altele traverseaza medii semisolide sau aluneca pe suprafata celor solide.

Miscarea bacteriilor este influentata de stimuli externi, favorabili sau nefavorabili. Termenul de “taxis”, mai utilizat în literatura occidentala, se refera la raspunsul, prin miscare, a bacteriilor la stimulari din mediul extern. Pornind de la acesta si de la cunoasterea elementelor care, prin variatia lor, sunt implicate în directionarea deplasarii bacteriilor, se pot defini chemotaxia (un gradient chimic), fototaxia (lumina), aerotaxia (con-centratia de O2), osmotaxia (presiunea osmotica), termotaxia (tem-peratura) si magnetotaxia (câmpul electromagnetic).

Bacteriile au capacitatea de a se deplasa în directia unor stimuli favorabili si de a se îndeparta de cei nocivi. Astfel, chemotaxia, capacitatea de deplasare a bacteriilor, dirijata de prezenta în mediu a unui gradient de substante chimice, poate fi pozitiva (factori nutritivi: aminoacizi, zaharuri) sau negativa (factori nocivi: acizi, baze, fenoli).

Miscarea bacteriilor este fin reglata prin existenta unor chemoreceptori situati la nivelul membranei citoplasmatice si spatiului periplasmic. Prin legarea substantelor (factori atragatori sau respingatori) de receptori se produce metilarea si, respectiv, demetilarea, proteinelor chemotactice metil-acceptoare (MCP) care declanseaza miscarea în sensul sau în directia opusa stimulilor. Transformarea informatiei referitoare la gradientul chimic din mediu în miscare este foarte rapida (200 milisecunde).

Mecanismul intim, molecular, a fost mai bine studiat în cazul speciei Escherichia coli. Când concentratia nutrientilor din mediu scade, MCP este demetilata, ATP fosforileaza proteina CheA care transfera fosfatul proteinei CheY. Aceasta interactioneaza cu proteina de transport FliM de la baza cilului inducând bacteriei miscarea de rostogolire prin care schimba directia.

Pâna în prezent, sunt cunoscute 3 modalitati principale de deplasare a bacteriilor:

miscarea bacteriilor ciliate;

miscarea bacteriilor alunecatoare;

miscarea spirochetelor.

Majoritatea bacteriilor mobile sunt ciliate. Cilii (flagelii) sunt prezenti pe suprafata unor specii bacteriene, în special bacili, vibrioni, spirili si foarte rar coci. În cadrul unei specii mobile, pot exista si variante imobile. Rolul cililor în motilitatea acestor bacterii a fost demonstrat experimental. S-a constatat ca, dupa sectionarea cililor, bacteriile au ramas viabile dar nu s-au mai putut deplasa prin mediu lichid. Dupa ce acestia au crescut din nou, bacteriile au redevenit mobile.

Cilii au o lungime, de obicei, mai mare decât a corpului bacterian si sunt formati dintr-un filament proteic, de flagelina, fixat printr-un cîrlig de corpusculul bazal, cu structura inelara, care îi ancoreaza în membrana citoplasmatica (si în membrana externa în cazul celor Gram negative). Structura acestora este diferita de a celor prezenti la eucariote.

Corpusculul bazal ciliar functioneaza ca un motor rotativ ce pune bacteria în miscare. Energia necesara este eliberata prin fosforilare oxidativa. În acest proces intervin 2 proteine flagelare Mot A si Mot B care formeaza un canal protonic la nivelul membranei citoplasmatice. Electronii sunt transportati prin acest canal înapoi, în citoplasma bacteriana, iar protonii se acumuleaza în spatiul dintre membrana citoplasmatica si peretele celular. Gradientul protonic rezultat este responsabil de miscarea cilului. Se pare ca în interiorul motorului ciliar exista si o proteina reglatoare a acestui proces.

Bacteriile ciliate se deplaseaza prin miscari de rotatie ale cililor. Viteza de deplasare a acestora este de 50mm sec. iar cea de rotatie a cililor, de 200-1000 rotatii sec. Directia de rotatie a cililor imprima sensul de miscare a bacteriei. Uneori, bacteriile parcurg distante de peste 2000 de ori mai mari decât lungimea corpului lor.

La bacteriile monotriche, rotatia cilului polar în directie antiorara (împotriva acelor de ceasornic) propulseaza bacteria înainte (flagelul situându-se în partea posterioara a acesteia). În cazul celor peritriche, miscarea se produce în acelasi mod, însa rotatia flagelilor este coordonata.

Cu ajutorul cililor, bacteriile se pot deplasa linear (flagelii se misca sincron în sens antiorar) spre zone cu concentratii crescute de substante nutritive sau se pot îndeparta de factori nefavorabili prin miscari de rostogolire (flagelii se misca asincron în sens orar). Într-o deplasare liniara bacteriile parcurg, de obicei, distante de 10 - 20 de ori mai mari decât lungimea corpului lor.

În situatii benefice (medii cu concentratii mari de nutrienti si scazute de metaboliti toxici), deplasarile liniare (“fuga”) sunt mai lungi iar numarul rostogolirilor (“tumbe”) mai putine. În schimb, în conditii neprielnice de mediu, numarul de rostogoliri creste, bacteria schimbând mereu directia de deplasare, în cautarea unui ambient optim.

Daca nu exista gradient chimic, bacteria se deplaseaza în mod aleatoriu, schimbând periodic directia, prin rostogoliri.

Nu trebuie confundata deplasarea activa a bacteriilor, cu ajutorul flagelilor, cu miscarea browniana a acestora, vizibila microscopic, pe preparate native.

Alt tip de miscare, descris la multe bacterii neciliate (ex.: cianobacterii, bacterii sulfuroase, unele specii de mycoplasme) este alunecarea pe substraturi solide. Viteza de deplasare, în acest caz, este mai mica, de 5mm sec. Mecanismul acesteia nu este descifrat în prezent. Ca urmare a studiilor efectuate, au fost emise diverse  ipoteze. Se pare ca majoritatea speciilor secreta slime (mucozitati), material polizaharidic eliberat prin pori, care le înconjoara corpul ca o teaca permitându-le alunecarea. Unii autori considera ca, la unele specii, sunt implicate complexe proteice interne, din peretele celular sau citoplasma.

Un tip particular de miscare, denumita “prin secuse” este considerata cea a speciei Pseudomonas aeruginosa care aluneca discontinuu pe suprafata mediilor solide ca urmare a contractiilor manunchiurilor de cili dispusi polar (lophotriche).

Spre deosebire de spirili care au perete rigid si se deplaseaza prin rotatia cililor polari, spirochetele pot înainta în mediile lichide si strabate medii semisolide datorita filamentelor axiale, structuri interne specifice, formate din peste 100 de fibrile ce strabat tot corpul bacteriei, situate între peretele celular si membrana externa. Mecanismul acestei miscari nu este complet descifrat dar se pare ca, prin rotatia filamentelor axiale, este antrenata si membrana externa iar bacteria este propulsata prin mediul lichid din jur. Numarul filamentelor axiale variaza în functie de specie. Miscarile spirochetelor sunt de însurubare, de flexie si de translatie.

Motilitatea bacteriilor poate fi evidentiata prin examina-rea microscopica a unor preparate native sau frotiuri colorate prin impregnare argentica cât si prin însamântarea pe medii- test pentru aceasta proprietate.

1.3      ÎNMULTIREA BACTERIILOR

Pentru bacterii, cercetarile efectuate au încercat sa furnizeze argumente referitoare la înmultirea prin diviziune, înmugurire, sexuata sau complexa.

Modalitatea de înmultire a bacteriilor cea mai obisnuita este diviziunea simpla, binara.

La bacteriile cilindrice (bacili, spirili, etc.), diviziunea este transversala (perpendiculara pe axul longitudinal).

În cazul bacteriilor sferice sau ovalare (coci, cocobacili), diviziunea se realizeaza dupa unul sau mai multe planuri, paralele sau perpendiculare, rezultând, în functie de genul caruia îi apartin, diverse moduri de grupare (în lanturi, in diplo, în tetrade, în structuri cu simetrie cubica, în ciorchini, în palisade, etc.).

Cresterea bacteriana se datoreaza unei mariri cantitative semnificative a tuturor componentilor. Multiplicarea reprezinta o consecinta a cresterii si are rolul de a restabili raportul între suprafata si volumul celular astfel încât acesta sa redevina optim pentru schimburile cu mediul.

În cazul bacteriilor cilindrice, diviziunea este precedata de o crestere relativ ridicata a volumului si lungimii corpului. La bacteriile sferice, aceasta modificare preliminara este mai putin evidenta constând într-o marire usoara a diametrului.

Initial, bacteria îsi mareste dimensiunile si îsi dubleaza cantitatea din fiecare constituient. Apoi se declanseaza procesul de diviziune binara a celulei-mama din care vor rezulta 2 celule-fiice. Se parcurg urmatoarele etape:

A.D.N. se deplaseaza spre periferia celulei si se ataseaza de membrana citoplasmatica (figura18 - a);

se realizeaza replicarea A.D.N. (figura 18 – b);

de la nivelul membranei citoplasmatice, se formeaza un sept transvers care creste centripet, în zona mediana a celulei, perpendicular pe axul longitudinal, divizând citoplasma;

prin constrictia circulara, progresiva, a peretelui celular si patrunderea acestuia în grosimea septului se formeaza peretele transvers (figura 18 – c);

peretele transvers se dedubleaza rezultând 2 celule fiice (figura 18 – d);

cele 2 celule identice, nou formate se separa (figura 18 - e).

În conditii favorabile de mediu, diviziunea binara este un proces foarte rapid (20 minute pentru majoritatea bacteriilor). Exceptie fac bacteriile cu crestere lenta (ex.: Mycobacterium sp.).

Informatiile referitoare la celelalte moduri de înmultire sunt sarace în literatura de specialitate. Înmugurirea a fost semnalata la specia Francisella tularensis iar multiplicarea complexa, prin utilizarea unuia sau altuia dintre modalitatile prezentate anterior în functie de conditiile de mediu, la Mycobacterium sp. În ceea ce priveste înmultirea sexuata, a fost demonstrata experimental la putine specii bacteriene.

1.4      METABOLISMUL BACTERIAN

La bacterii, ca si la alte organisme, metabolismul include reactiile biochimice prin care substante nutritive, asimilate din mediul de viata, sunt transformate în constituienti ai celulei bacteriene. Include procese catabolice si anabolice.

Procesul de catabolism (limba greaca: cata = jos, ballein = a arunca) consta în degradarea substantelor nutritive transportate din mediu în celula bacteriana pe caile metabolice comune tuturor organismelor vii (glicoliza, suntul pentozo-fosfatilor, ciclul acizilor tricarboxilici, b-oxidarea acizilor grasi, hidroliza proteinelor, etc.), urmata de eliberarea de energie.

Energia eliberata prin reactiile biochimice catabolice este apoi stocata sub forma legaturilor macroergice, în special de A.T.P. (adenozin trifosfat).

Principalele cai catabolice din celula bacteriana sunt:

Glicoliza - consta într-o serie de reactii chimice prin care 1 molecula de glucoza este transformata în 2 de acid piruvic, cu eliberare de energie, stocata sub forma a  4 molecule de A.T.P.; procesul prin care energia este stocata în A.T.P. se numeste fosforilare oxidativa.

Suntul pentozo-fosfatilor - reprezinta, de asemenea, o cale de metabolizare a carbohidratilor, prin care glucoza 6-fosfat este degradata pâna la CO2 si NADPH (nicotinamid dinucleotid fosfat);

b-oxidarea acizilor grasi - consta în succesiunea de reactii prin care grasimile acide sunt degradate pâna la acetil-co-enzima A;

Ciclul Krebs (ciclul acizilor tricarboxilici) - cuprinde o succesiune de reactii prin care o molecula de acetil-coenzima A este metabolizata pâna la CO2 cu producere de energie stocata tot prin fosforilare oxidativa;

Proteazele sunt enzime care hidrolizeaza proteinele si polipeptidele pâna la aminoacizi care sunt utilizati prin reactii de dezaminare si transaminare.

Procesul de anabolism (limba greaca: ana = sus, ballein = a arunca) se desfasoara cu consum energetic si consta în bio-sinteza structurilor celulare.

În cadrul acestuia se disting doua compartimente care interfera, unul energetic si unul de sinteza a constituientilor celulari. Uneori acestea coincid, substantele oxidate ca surse de energie fiind asimilate în mod direct si introduse în procese de sinteza.

Metabolismul energetic reuneste toate reactiile biochimice care conduc la aprovizionarea bacteriei cu energia necesara supravietuirii, cresterii si multiplicarii.

Bacteriile fotosintetizante traiesc, de obicei, libere fiind dependente doar de lumina solara. Cele chimiosintetizante îsi obtin energia prin oxidarea substantelor nutritive din mediu. Practic, orice compus organic poate fi oxidat de anumite specii bacteriene.

Metabolismul de sinteza cuprinde totalitatea proceselor chimice prin care bacteriile îsi procura substantele plastice necesare pe care le transforma în constutuienti proprii.

Metabolismul bacteriilor este foarte intens, permitând o crestere si o multiplicare rapida a bacteriilor si este flexibil, ceea ce explica capacitatea crescuta de adaptare la conditii foarte variate de mediu a acestora.

Reactiile catabolice si anabolice sunt catalizate de enzime care sunt reutilizabile (dupa ce o reactie chimica s-a terminat, sunt eliberate si participa la un alt proces). Actiunea acestora este, de obicei, specifica. Substantele asupra carora enzimele îsi exercita actiunea sunt substraturi iar, în urma reactiilor chimice pe care le catalizeaza, rezulta produsi finali.

Situsurile active ale enzimelor (au grupari sulfhidril - SH) pot fi ocupate de unele substante (sulfonamide, compusi de mercur, etc.) ceea ce blocheaza producerea reactiei chimice catalizate de aceasta. Initial, numele enzimelor s-a stabilit pornind de la procesele chimice la care participau (hidrolaze, oxidaze, transferaze, etc.) si sufixul „aza”. Unele enzime sunt numite în functie de substratul lor (ribonucleaza, lactaza, etc.).

Nevoile nutritive variaza în raport cu genul sau specia bacteriana. În cadrul unei specii, acestea se pot modifica ca urmare a unei mutatii genetice ce conduce la absenta unei enzime implicate în sinteza metabolitilor esentiali (aminoacizi, acizi grasi, vitamine, baze azotate, etc.).

Din punct de vedere al capacitatii de sinteza, pot fi:

Bacterii prototrofe – acestea pot sintetiza toti metabolitii esentiali necesari cresterii si multiplicarii lor.

Bacterii auxotrofe – sunt mutante care nu pot sintetiza un anumit metabolit esential (factor de crestere) si se pot dezvolta doar daca este prezent în mediu.

Bacteriile auxotrofe au dependenta fata de unul sau mai multi factori de crestere (aminoacizi, vitamine, pirimidine, purine, etc.) putându-se dezvolta doar în mediile care îi contin. Dupa unii autori, acest tip de comportament al bacteriilor auxotrofe poate explica trecerea unor specii de la saprofitism la comensalism si chiar parazitism.