Ingineria genetica la nivel celular

Ingineria genetica la nivel celular

In l960, Barski a evidentiat ca celulele somatice ale organismului animal sunt capabile sa fuzioneze si sa-si reasorteze informatia genetica. In l965, G. Harris a remarcat ca frecventa hibridarii celulelor somatice creste semnificativ, daca in amestecul celular se adauga particule de virus Sendai, inactivat cu radiatii UV. Invelisul viral contine o proteina de fuziune, care produce agregarea su fuziunea celulelor.

Pe calea fuziunii ete posibila hibridarea celulelor care provin de la organisme indepartate filogenetic: celule de sobolan si soarece, de soarece si om, celule normale si tumorale etc.

Experientele de fuziune s-au realizat initial la celulele vegetale. Ca si celulele animale, protoplastii celulelor vegetale pot sa fuzioneze. Agentul favorizant al fuziunii este polietilenglicolul (PEG). Modelul vegetal al fuziunii se deosebeste de cel animal, prin posibilitatea de principiu, de a clona planta intreaga, care intruneste suma caracterelor celor doi parteneri care se hibrideaza prin fuziune. La unele specii de plante (tutun, morcov, vita de vie, tomate), din protoplastii fuzionati, dupa regenerarea peretelui celular si formarea calusului, se poate regenera intregul aparat vegetativ al plantei.

Tehnica de inginerie genetica la nivel celular, aplicabila microorganismelor se bazeaza pe fuziunea protoplastilor.

Fuziunea protoplastilor bacterieni

Utilizarea protoplastilor in studiile genetice a intarziat, datorita aparentei incapacitati a protoplastilor celulelor Gram pozitive, de a reversa la conditia de celula cu perete.

Studiul lor a capatat semnificatii si dimensiuni noi, dupa ce s-a observat ca aceste structuri celulare nude au capacitatea sa reverseze la forme celulare osmotic stabile, identice cu cele de origine. Aceasta constatare a impulsionat cercetarile de inginerie genetica celulara, al caror scop este obtinerea de noi tulpini de microorganisme de importanta industriala, prin tehnica fuzionarii protoplastilor.

Agentii de fuziune (PEG cu greutatea moleculara de 4 000-6000 D si ionii de Ca²⁺) maresc semnificativ capacitatea protoplastilor de a se agrega, uneori in grupuri mari.

Scopul fuziunii este obtinerea celulelor cu determinanti genetici noi, rezultati prin procesele de recombinare a genomurilor protoplastilor parentali.

Pentru a urmari realizarea proceselor de recombinare se folosesc markeri genetici de morfologie, de auxotrofie, de rezistenta la antibiotice etc.

Etapele metodologiei fuziunii protoplastilor

Fuziunea. In mediul de fuziune, care contine PEG 50% si ioni de Ca²⁺ (l0-l00 mM), in faza initiala se produce aglutinarea protoplastilor, datorita deshidratarii intense, formandu-se agregate de diferite dimensiuni. In zonele de contact strans are loc o translocatie a proteinelor membranare, urmata de interactiuni lipidice intre membranele adiacente. Moleculele fosfolipidice se reorganizeaza in zona de contact si rezultatul este fuziunea intermembranara. Se stabilesc punti citoplasmatice care cresc treptat, astfel incat fuziunea se definitiveaza.

Pentru procesul fuziunii nu este in mod obligatoriu viabilitatea ambilor parteneri. Se poate realiza inactivarea prealabila a uneia din cele doua linii de protoplasti fuzionanti.

Cei doi parteneri participanti la fuziune nu au polaritate. Ei sunt egali atat in capacitatea de a dona, cat si de a primi informatie genetica. Procesul de fuziune nu este limitat de bariere genetice sau de incompatibilitate.

Fuziunea protoplastilor determina formarea unei noi entitati, o celula binucleata, care in decursul regenerarii sau ulterior, segrega si produce colonii care contin celule cu genotip haploid, modificat prin recombinare.

Fuziunea s-a realizat la protoplastii de B. subtilis, B. megatherium, Streptomyces, E. coli, precum si la o serie de levuri si fungi filamentosi.

Regenerarea protoplastilor semnifica refacerea peretelui celular si reversia la structura celulara de origine. Regenerarea este o etapa esentiala si este cea mai dificila dintre etapele metodologiei utilizarii lor. Regenerarea este rapida si totala, daca protoplastul mai pastreaza un rest din peretele vechi, care are rolul de primer pentru biosinteza noului perete.

Selectia recombinantilor se face dupa regenerarea pe un mediu special de reversie, un mediu selectiv pe care se pot dezvolta numai celulele revenite la prototrofie, prin procesul recombinarii.

Aplicatii practice ale fuziunii protoplastilor Fuziunea protoplastilor este o tehnica de inginerie genetica la nivel celular, cu importanta exceptionala pentru biotehnologie, datorita aplicatiilor potentiale multiple. Fuziunea protoplastilor este deosebit de importanta pentru microorganismele lipsite de mecanisme de transfer al informatiei genetice, carora le confera in mod artificial, "sexualitate".

Metoda fuziunii protoplastilor a fost aplicata bacteriilor din g. Bacillus, pentru obtinerea unor noi tulpini cu randament superior de producere a diferitelor enzime (proteaze, amilaze), din g. Streptomyces, pentru cresterea randamentului productiei de antibiotice, precum si a levurilor utilizate in producerea berii (S. carlbergensis).

La fungi, dupa fuziune, se formeaza un heterocarion(celula care contine 2 nuclei diferiti). Metoda este foarte importanta deoarece multi fungi de importanta comerciala nu se reproduc pe cale sexuata.

O alta metoda de stimulare a procesului de fuziune este electroporarea. Celulele bacteriene se amesteca cu ADN plasmidial si sunt supuse unui scurt impuls electric cu voltaj inalt. Acesta pare sa determine formarea unor mici discontinuitati in membrana, prin care ADN patrunde in celula. Celulele transformate pot fi selectate pe baza rezistentei la antibiotice, conferita de o plasmida. Metoda poate fi folosita pentru a usura inglobarea ADN, de catre orice tip de celula.

Transformarea protoplastilor este o metoda eficienta de clonare a genelor. Se folosesc protoplasti de B. subtilis sau de levuri. Celulele de B. subtilis se pot transforma genetic datorita competentei naturale, dar inglobeaza numai ADN linear. ADN circular este inglobat numai de protoplasti. Eficienta procesului de transformare a protoplastilor, adeseori este prea mica pentru a avea importanta practica, iar regenerarea necesita conditii greu de optimizat.