METODE BIOCHIMICE DE LABORATOR CLINIC PENTRU DETERMINAREA CALCIULUI

CUPRINS

ASPECTE BIOLOGICE SI METABOLICE GENERALE PRIVIND METABOLISMUL CALCIULUI

1.1. REGLAREA METABOLISMULUI CALCIULUI

1.2. BIODINAMICA FOSFOCALCICA

1.3. ROLUL CALCIULUI IN ORGANISM

ASPECTE PARTICULARE ALE PROFILULUI METABOLIC AL CALCIULUI LA OM SI LA ALTE SPECII DE ANIMALE

PROFILUL METABOLIC AL CALCIULUI LA OM

2.2.PROFILUL METABOLIC AL CALCIULUI LA VACILE DE LAPTE SI BOVINELE LA INGRASAT

PROFILUL METABOLIC AL CALCIULUI LA OVINE

. PROFILUL METABOLIC AL CALCIULUI LA CABALINE

2.5. PROFILUL METABOLIC AL CALCIULUI LA SUINE

2.6. PROFILUL METABOLIC AL CALCIULUI LA PASARI

PROFILUL METABOLIC AL CALCIULUI LA ANIMALELE DE COMPANIE

PRINCIPII GENERALE ALE METODELOR UTILIZATE PENTRU DETERMINAREA CALCIULUI

3.1. DOZAREA CALCIULUI TOTAL

4. INTERPRETAREA REZULTATELOR PRIN RAPORTAREA LA VALORI DE REFERINTA

CONCLUZII

BIBLIOGRAFIE

INTRODUCERE

Organismul ca sistem biologic, pentru desfasurarea normala a functiilor sale, are nevoie de o mare varietate de nutrimente (aminoacizi esentiali, glucide, lipide, vitamine, substante minerale, apa etc.) pe care trebuie sa si le procure din mediul inconjurator, care sant absorbite si folosite in scop sanogen. Asigurarea acestora trebuie sa aiba un caracter ritmic si echilibrat calitativ si cantitativ.

Nutritia se ocupa de natura si distributia substantelor nutritive in alimente, de efectele lor metabolice si de consecintele unui aport alimentar inadecvat. Exista o stransa legatura intre aportul alimentar si metabolismul organismului animal, asigurarea homeostaziei mediului intern bazandu-se indeosebi pe asigurarea prin ratia furajera a necesarului de substante nutritive (proteine, glucide, lipide) si substante biologic active (vitamine si minerale).

Functiile elementelor anorganice sant extrem de diverse. Ele variaza de la functii structurale in unele tesuturi la functii reglatoare in alte tesuturi.Un rol aparte il ocupa calciul, fosforul, magneziul, care asigura rigiditatea oaselor si a dintilor.

In medicina veterinara problema dismineralozelor este in primul rand o chestiune de nutritie neechilibrata, acestea declansand uneori tulburari cu caracter de masa, de tip enzootic. Pe de alta parte, in majoritatea cazurilor dismineralozele evolueaza, ca dealtfel si celelalte tulburari de nutritie si metabolism, inaparent clinic.

1. ASPECTE BIOLOGICE SI METABOLICE GENERALE PRIVIND METABOLISMUL CALCIULUI

Calciul (Ca) este necesar pentru buna desfasurare a numeroase fenomene intracelulare si extracelulare, inclusiv a contractiei musculare, a conducerii impulsului nervos, a eliberarii de hormoni si a coagularii. In plus Ca ionic joaca un rol unic in semnalizarea intracelulara si este implicat in reglarea activitatii multor enzime. Din aceste motive, mentinerea homeostaziei calcice este de importanta capitala.

Atat concentratia extracelulara, cat si cea intracelulara a Ca sant foarte strans reglate prin transportul bidirectional prin membrana plasmatica a celulelor si prin membranele organitelor intracelulare, cum ar fi reticulul endoplasmic, reticulul sarcoplasmic al celulelor musculare si mitocondriile.

Distributia calciului in oase.

In ciuda rolurilor sale intracelulare importante, aproximativ 99% din totalul de Ca din organism este in oase, unde estein principal combinat cu alti ioni sub forma de cristale de hidroxiapatita. Aproximativ 1% din Ca osos este schimbat liber cu LEC (lichid extracelular) si este astfel disponibil pentru a tampona modificarile ce apar in balanta de Ca.

In sinteza osoasa metabolismul Ca si al fosfatului (PO¯4) se afla in stransa legatura datorita interdependentei nutritionale si relatiei cu vitamina D.

Functia majora a acestor doua elemente se refera la dezvoltarea si mentinerea sistemului osos, 99% din Ca si 80-85% din fosfor aflandu-se in schelet si dinti. Acest tesut viu isi modeleaza si adapteaza permanent structura si compozitia in corelatie cu solicitarile fiziologice si productive. Schimburile de calciu si fosfor dintre os si mediul intern sunt intr-un proces continuu: cantitati mari de calciu si fosfor pot fi eliberate prin resorbtie osoasa, in special in timpul lactatiei si al productiei de oua.

Refacerea rezervelor de calciu din os este dependenta de cantitatea de calciu care se gaseste in sange si se face in zona spongioasa a oaselor, de unde pot fi eliberate in cazul marilor solicitari productive sau a carentelor alimentare. De pilda, s-a constatat ca pasarile pot stoca in maduva oaselor lungi, cu 15 zile inaintea declansarii ouatului, cantitati mari de calciu. La animalele tinere, in crestere, depozitarea minerala este superioara eliberarii lor, la cele adulte, mineralizarea este stationara, iar la animalele bune producatoare de lapte sau oua, eliberarea de calciu si fosfor din oase poate depasi depunerea.

Distributia calciului in sange. Limitele de concentratie a Ca in sange sant foarte largi, variind cu : specia, categoria de varsta, starea productiva.

In jur de 45% din Ca total din sange este legat de proteine plasmatice, in principal de albumine, sub forma neionizata si nedifuzibila. Ca fixat de proteine reprezinta o forma inactiva fiziologic si constituie doar o forma de tansport prin plasma. Cele 55 de procente ramase includ Ca ionic plus Ca combinat cu fosfat, carbonat sau citrat (3-4%). Restul Ca plasmatic se gaseste sub forma ionica si constituie fractiunea activa in procesele de hemostaza si de reglere a excitabilitatii neuromusculare.

Dozarea Ca ionic este dificila, necesitand ultracentrifugare pentru sedimentarea proteinatului de Ca. Valoarea Ca ionic poate fi aflata insa cu o oarecare aproximatie, tinandu-se seama de concentratia proteinelor plasmatice, acest algoritm, ca si altele utilizate pentru dozarea Ca ionic,este adeseori inexact.

Cresterea proteinelor plasmatice, ca de exemplu cea care apare in mielomul multiplu la om, poate mari Ca total din plasma prin fractia legata de proteine, deoarece proteinele patologice leaga Ca plasmatic intr-o proportie cenu poate fi prezisa, Ca ionic plasmatic trebuie masurat direct pentru a ghida deciziile clinice.

Studiile cu izotopi au aratat ca homeostazia Ca se realizeaza in special prin schimburile rapide intre Ca plasmatic si cel din compartimentele osoase si celulare.

In lichidul cefalorahidian, concentratia Ca este similara celei din spatiul extracelular; determinarea calcirahiei permite obtinerea directa a concentratiei Ca ionic din plasma si din lichidul extracelular.

In muschiul scheletic, cresterea tranzitorie a concentratiei Ca in citosolproduce interactiunea intre Ca si proteinele care leagaCa, troponina C si calmodulina, initiind contractia musculara. Cuplarea excitatiei cu contractia in muschiul cardiac si in cel neted este de asemenea dependenta de Ca.

Concentratiile intracelulare de Ca controleaza variate alte procese celulare, prin activarea protein kinazelor si a fosforilarii enzimatice.

Ca este implicat si in actiunea altor mesageri intracelulari, cum ar fi adenozin monofosfatul ciclic) si inozitol 1,4,5- trifosfatul si astfel mediaza raspunsul celular la numerosi hormoni, printre care adrenalina, glucagonul, vasopresina, secretina si colecistokinina. Ca intracelular difera mult cantitativ in functie de tipurile celulare, deosebit de bogate in Ca sunt trombocitele si celulele renale, mai sarace sunt celulele hepatice si muschii scheletici.

Cu toata relativa sa inertie metabolica, fractiunea scheletica a Ca, datorita ponderii sale, indeplineste rolul de principal tampon si rezervor pentru celelalte sectoare ale organismului. Ea inglobeaza excesele neeliminabile pe alte cai si mai ales, acopera rapid deficitele.

1.1. REGLAREA METABOLISMULUI CALCIULUI

Raportul calciu: fosfor are influenta asupra absorbtiei lor intestinale si depunerii lor in oase sub forma de cristale insolubile, conducand la utilizarea optima a fiecarui element in parte. Un raport mare scade absorbtia de fosfor, determinand o intarziere a cresterii sii calcifierii oaselor, in special daca hrana contine fosfor la limita. Raportul este mai putin critic daca hrana contine fosfor in exces.

Parathormonul (PTH). Este un polipetid cu 84 de aminoacizi, secretat de glandele paratiroide. El are efect hipercalcemiant prin cresterea proceselor de osteoliza si scaderea celor de osteosinteza, asigurand preonderenta osteolizei si astfel o cantitate de calciu ionic utilizabila pentru mentinerea nivelului calciului ionic in lichidul extracelular.

La nivel renal, parathormonul actioneaza direct asupra celulelor tubilor contorti proximali, stimuland excretia de fosfat, sodiu, potasiu si bicarbonat si scazand clearance-ul calciului, magneziului, amoniacului si a ionului de hidrogen.

La nivelul tractusului digestiv, parathormonul stimuleaza absorbtia calciului, iar la nivelul glandei mamare, creste cantitatea de calciu eliminata prin lapte.

Celule paratiroidelor percep scaderea calciului plasmatic, probabil printr-un receptor pentru calciu si maresc exprimarea genei PTH, eliberand PTH preformat in circulatie.

Calcitonina, este un hormon polipeptidic cu 32 de aminoacizi, secretat de celule C tiroidiene. Calcitonina tinde sa scada concentratia plasmatica a calciului prin cresterea absorbtiei celulare, excretiei renale si osteogenezei. Efectele asupra metabolismului osos sunt mult mai slabe decat cele ale PTH sau ale vitaminei D.

Vitamina D, creste nivelul seric al calciului si fosfatului pana la valori susceptibile sa asigure depunerea lor sub forma de hidroxiapatita la nivelul colagenului osos. Aceasta reprezinta in fond actiunea antirahitica, actiune de optimizare a procesului de mineralizare a osului.

Forma activa a vitaminei D are doua actiuni principale:

-creste viteza de absorbtie intestinala a calciului si indirect pe cea afosfatului;

-mobilizeaza calciul osos.

Alte vitamine (A si C). Hipervitaminoza A stimuleaza resorbtia osoasa si determina o osteoporoza severa iar deficienta de vitamina A si C provoaca alterari in biosinteza colagenului.

Vitamina C favorizeaza depunerile minerale osoase prin activarea osteoblastilor; vitaminele A si C reduc eliminarea urinara de calciu. Deficientele vitaminice, mai ales hipovitaminoza A, sunt caracterizate prin hipercalciurii, mecanism invocat de uni autori in patogenia calculozelor renale.

1.2. BIODINAMICA FOSFOCALCICA

Ingestia de calciu, fosfor si vitamina D. Remanierele permanente pe care le sufera sistemul osos, precum si eliminarile digestive si renale de saruri fosfocalcice, necesita un aport constant, adecvat de calciu si fosfor pentru mentinerea unui raport echilibrat. La acestea se adauga necesitatea unui aport corespunzator de vitamina D, esentiala pentru absorbtia calciului furnizat de alimentatie si pentru echilibrarea balantei fosfocalcice.

Absorbtia intestinala a calciului. Calciul se absoarbe mai ales in segmentele anterioare ale intestinului subtire, unde este mai putin alcalin, intensitatea absorbtiei este conditionata de necesitatile organismului, de aportul alimentar de calciu, precum si de alti factori locali si generali.

In duoden si segmentele jejunabile anterioare, absorbtia calciului se face prin mecanisme active impotriva unui gradient electrochimic, in restul intestinului subtire si in colon, absorbtia se realizeaza mai ales prin difuziune simpla. Aceste mecanisme de absorbtie au loc cu consum de energie si in prezenta unei proteine denumita 'proteina Wasserman'. Sinteza acestei proteine, care fixeaza calciul in proortie de un atom de calciu la o molecula de proteina, este conditionata de prezenta formei active a vitaminei D3.

Factorii intestinali care conditioneaza absorbtia intestinala a calciului sunt:

-forma ingerata;

-pH-ul intestinal;

-compozitia ratiei alimentare;

-raportul calciu: fosfor.

Eliminarile calciului. Eliminarile fosfocalcice se fac pe cale digestiva si renala si sunt aproximativ egale cu aportul, in conditii de echilibru metabolic. Sistarea aportului exogen de calciu nu este insotita de sistarea totala a eliminarilor de calciu din organism, ci continua sa se piarda cantitati diferite de calciu endogen, provenit din osreoliza fiziologica.

Eliminarile de calciu prin fecale sunt de 60-80%, 2/3 fiind calciu alimentar neabsorbit si ½ calciu endogen.

Eliminarile urinare de calciu depind si de valoarea proteinemiei, cunosand ca la nivel glomerular nu se filtreaza decat calciul nelegat de proteine. In nefropatiile cronice, calciuria diminua concomitent cu cresterea calcemiei.

1.3. ROLUL CALCIULUI IN ORGANISM

In afara rolului mineralizarii oaselor, indeplineste alte functii fiziologice. O mica cantitate de calciu si fosfor este necesara pentru a mari viteza si eficienta cresterii. Apoi ionii de calciu din umori si din partile moi sunt necesari pentru activitatea unor enzime cum ar fi ATP-aza, sau cele implicate in procesele de coagulare si pentru producerea agregarii placutelor sangvine in cursul procesului de hemostaza, reduc excitabilitatea neuromusculara in musculatura scheletica, producand insa o crestere a excitabilitatii miocardului, scade permeabilitatea membranelor celulare si reduc excitabilitatea nervoasa.

2. ASPECTE PARTICULARE ALE PROFILULUI METABOLIC AL CALCIULUI LA OM SI LA ALTE SPECII DE ANIMALE

PROFILUL METABOLIC AL CALCIULUI LA OM

Mentinerea rezervelor de Ca din organism si a concentratiei plasmatice a Ca depinde in ultima instanta de aportul alimentar de Ca, absorbtia Ca din tubul digestiv si de excretia renala de Ca. Aproximativ 1.000 mg de Ca sunt ingerate zilnic in cazul unei alimentatii echilibrate. In jur de 200 mg/zi se pierd prin lumenul tractusului GI, in bila si in alte secretii.

In functie de concentratia de 1,25- dihidroxivitamina D circulanta, cam 200-400 mg de Ca este absorbit din intestin zilnic. Cele 800-1.000 mg (20-25 mmol) ramase apar in fecale. Balanta totala de Ca este mentinuta prin intermediul excretiei renale, care este in medie de 200 mg/zi (5mmol/zi).

2.2. PROFILUL METABOLIC AL CALCIULUI LA VACILE DE LAPTE SI BOVINELE LA INGRASAT

Nivelul calciului in ser sau plasma este relativ stabil si depinde de : aportul exogen (furaje), resorbtie-eliminare si starea functionala a rinichilor.

In hrana este foarte important raportul cantitativ al calciului fata de fosfor, care trebuie sa fie 1,5-2:1, resorbtia normala a calciului este legata de existenta in cantitati suficiente a vitaminei D in organism. In cazul alimentatiei cu nutreturi bogate in acid oxalic (frunze si colete de sfecla) trebuie sa se tina seama de suplimentarea cu calciu. Acidul oxalic formeaza cu calciul o sare de calciu greu solubila, care trece nevalorificata prin tractusul digestiv, inrautatind bilantul calcic.

Calcemia prezinta unele variatii fiziologice in functie de varsta, gestatie, stadiul lactatiei, hrana sau starea sanatatii.

Hipocalcemia fiziologica este intalnita la vacile de lapte mai batrane, cu productie ridicata de lapte sau in primele zile dupa fatare.Hipocalcemia patologica poate fi urmarea unui aport scazut in hrana, insuficienta vitaminei D, hranire cu furaje acide, hipofunctia tiroidei sau timusului, sindrom de malabsorbtie, insuficienta renala cronica.

Manifestarile hipocalcemiei sunt cele legate de paraplegia post partum, acidoza, hipomagnezemie, osteomalacie, inapetenta si oboseala la eforturi mici.

La vitei sursa principala de calciu, o reprezinta colostrul si laptele. Dinamica sezoniera a calcemiei este legata de hranirea vacilor de lapte in perioada fatarii. Nivelurile cele mai coborate sunt in perioada ianuarie-aprilie, iar cele mai ridicate in perioada august-octombrie.

Hipocalcemia se traduce clinic prin rahitism, dezvoltare intarziata, apatie, somnolenta, spasmofilie, inapetenta, salivatie si hiperestezie.

Hipercalcemia nu are practic nici o importanta la vitei.

2.3. PROFILUL METABOLIC AL CALCIULUI LA OVINE

Concentrtiile sanguine de calciu, fosfor si magneziu trebuie sa fie interpretate impreuna. Calcemia este aproape neinfluentatade variatiile calciului ingerat, in timp ce fosforemia este in directa corelatie cu aportul acestuia.

Hipocalcemia ovinelor se caracterizeaza prin manifestari depresive si convulsive. Ea apare la oi in gestatie avansata ori lactante mai cu seama la sfarsitul iernii si inceputul primaverii. Efectul salutar al calciterapiei asociat cu hipocalcemia ajuta la diferentierea acestei maladii de toxiemia de gestatie, hipomagnezemie si anaerobioze.

2.4. PROFILUL METABOLIC AL CALCIULUI LA CABALINE

Carentele alimentare se repercuteaza asupra nivelurilor sanguine intr-un timp mai mult sau mai putin indelungat.

La cai, consecutiv administrarii unor furaje bogate in fosfor, cum ar fi in special taratele de grau, asociate cu fibroase sarace in calciu; orice raport mai mic decat 0,8 poate determina osteofibroza. Deficitul de calciu asociat cu excesul de fosfor, determina hiperparatiroidismul secundar, cu secretie sporita de parathomon.ca urmare, se instituie demineralizarea oaselor prin activitate osteoclastica crescuta. Se impune suplimentarea hranei cu saruri de calciu, pentru mentinerea unui echilibru optim, in toate cazurile cand alimentatia este excesiva in fosfor.

2.5. PROFILUL METABOLIC AL CALCIULUI LA SUINE

In general porcinele dispun pentru majoritatea mineralelor de mecanisme homeostatice eficiente, care asigura mentinerea unor concentratii sanguine optime. Aceste mecanisme constau in: reglarea ingestiei in functie de necesitati, absorbtia digestiva si excretia.

In conditiile cresterii porcinelor in sistem intensiv, reglarea ingestiei devine uneori mai putin posibila deoarece deficitele grave si prelungite de saruri minerale nu mai pot fi corectate nici chiar prin mobilizarea din tesuturi a rezervelor. In aceasta situatie concentratiile sangvine ale mineralelor deficitare vor fi scazute sub limitele normale.

Hipocalcemia poate fi inregistrata in insuficienta de aport, enteropatii, hipovitaminoza D, hipoparatiroidie.

Rahitismul este o osteopatie chimiodistrofica malacica, hiperplazica a tineretului porcin, determinata de o tulburare a metabolismului fosfo-calcic, caracterizata prin lipsa de mineralizare si deformare a oaselor, alaturi de intarzierea in crestere. Umoral se constata normo sau hipocalcemie moderata, hipofosforemie si hiperfosfatazemie.

Tetania hipocalcemica este o boala care afecteaza grasunii, purceii intarcati si uneori chiar purceii sugari in apropierea intarcarii, provocata de deficiente calcice grave. Cauza principala a bolii este insuficienta accentuata, brusca a calciului la purceii in crestere, spre deosebire de rahitism la care deficienta intervine treptat.

2.6. PROFILUL METABOLIC AL CALCIULUI LA PASARI

Calciul, fosforul, magneziul sunt discutate impreuna din cauza asocierii lor metabolice, in special in formarea oaselor. La pui majoritatea calciului este utilizat pentru formarea oaselor in timp ce la gaini, acesta contrivuie la formarea cojii oului.

Utilizarea calciului si fosforului este dependenta de prezentaunei cantitati adecvate de vitamina D in hrana.

Pentru puii in crestere raportul optim este de 1,5:1- 2:1, pentru gainile outoare raportul Ca: P este mai mare.

Rahitismul la pui este cunoscut sub denumirea de sindrom al oaselor moi, intalnindu-se pana la varsta de 2 saptamani. Cauzele principale sunt carenta de vitamina D3, dezechilibrul fosfocalcic in hrana gainilor outoare si a puilor, subnutritia globala a puilor, reducerea absorbtiei digestive de Ca si P, ca urmare aexcesului de fitati, oxalati sau grasimi in hrana puilor. Constatarea ca proteina calcipexica lipseste din mucoasa intestinala a puilor de gaina rahitici si apare dupa administrarea de vitamina D, demonsreaza ca sinteza proteinei calcipexice este controlata de aceasta vitamina.

2.7. PROFILUL METABOLIC AL CALCIULUI LA ANIMALELE DE COMPANIE

La catei si pisoi, rolul cel mai important ii revine carentei in vitamina D, cu toate ca si calciul si fosforul pot interveni etiologic in anumite dezechilibre. Totusi, o ratie echilibrata in calciu si fosfor, dar saraca in vitamina D, provoaca cel mai frecvent rahitismul la aceste specii. Sunt predispusi la rahitism indeosebi cateii din rasele de talie mare (Dog german, Ciobanesc german, Saint-Bernard etc.).

3. PRINCIPII GENERALE ALE METODELOR UTILIZATE PENTRU DETERMINAREA CALCIULUI

Datorita unui numar foarte mare de lucrari din domeniile biomedicale , interesul pentru calciu a crescut enorm astfel ca s-au impus noi tehnici de determinare. In acest sens, trebuie mentionat ca in strainatate nici determinarea prin flamfotometrie nu mai este recomandata, iar masurarea pe cale comlexometrica folosind murexidul ca indicator este de interes istoric.

Masuratorile calcemiei sunt bazate actual pe tehnici fizico-chimice ce utilizeaza spectrofotometria cu absorbtie atomica sau cea cu electrozi de ioni (ISE).

Spectometria de absorbtie atomica. Este o metoda cantitativa de inalta precizie, care permite determinarea la niveluri foarte joase a concentratiei elementelor respective in solutii. Cu ajutorul acestei metode este posibila determinarea aproximativ a 65 de elemente.

Principiul spectometriei de absorbtie atomica consta in excitarea atomilor substantei de cercetat prin energie unei surse de radiatie ce are o frecventa egala cu frecventa liniei de rezonanta a atomilor cercetati.

Aparatul trebuie sa contina o sursa de linii (lampi catodice), arzator cu flacara, dispozitiv de pulverizare, monocromatorsi un sistem de fotodetectie.

Proba este inrodusa lateral cu ajutorul unei microseringi. Indiferent de tipul atomizatorului (flacara sau cuptor) el trebuie sa realizeze uscarea, arderea si atomizarea substantei. Pentru dozarea calciului proba se pulverizeaza dintr-o solutie de clorura de lantan.

3.1. DOZAREA CALCIULUI TOTAL

Metoda complexometrica de dozare a calciului (metoda Elliot, metoda titrimetrica).

Principiu. Titrarea directa a ionilor de calciu, in mediu intens alcalin cu sarea disodica a acidului etilendiamintetraacetic (EDTA) in prezenta murexidului ca indicator.

Ionii de calciu sunt fixati apoi cantitativ prin titrare cu EDTA eliberand indicatorul, astfel ca acesta coloreaza solutia in violet.

Reactivi.

1. hidroxid de sodiu 9N. Se dizolva36 g substanta in apa distilata, iar dupa racire se aduce volumul la 100 ml.

2. indicator murexid (purpurat de amoniu). Se foloseste un amestec fin pulverizat de murexid si azotit de potasiu in proportie de 1/800.

3. solutie EDTA N/100. Intr-un balon cotat de 1.000 ml se dizolva 1,861 g substanta uscata in 200 ml apa distilata, alcalinizind cu hidroxid de sodiu 10%, pana ce solutia devine perfect clara, apoi se completeaza la semn cu apa distilata. 1ml contine 0,8 mg calciu.

Tehnica. Se dilueaza 2ml ser cu 48 ml apa distilata, se adauga 0,4 ml hidroxid de sodiu 9 N (1) si un varf de cutit (cateva centigrame) indicator. Se titreaza cu solutie EDTA N/100 pana ce culoarea amestecului vireaza de la roz la violet. Paralel se titreaza si un martor alb folosind apa distilata in loc de ser.

Valoarea obtinuta la titrarea martorului (n1) se scade din aceea a probei (n).

Calcul. Calciu mg/100 ml ser = (n-n1) x 0,2 x 50

N si n1 = ml EDTA N/100 folosita la titrare.

Observatii. Metoda este simpla si rapida fara ca aceste avantaje sa influenteze exactitatea rezultatelor. Inlaturand precipitarea pentru care sunt necesare 24 de ore, ea permite sa se faca dozarea imediat dupa recoltare.

Metoda complexometrica de dozare a calciului si magneziului din ser

Principiul este asemanator metodei precedente. Ionii de calciu si magneziu formeaza complexe coordinative stabile cu EDTA. In serul total se dozeaza Ca si Mg. Paralel se face o alta proba pentru Mg, cu ser din care Ca a fost precipitat cu oxalat de amoniu. Prin diferenta se obtine cantitatea de calciu.

Metoda volumetrica de dozare acalciului.

Principiu. Calciul este precipitat sub forma de oxalat de calciu, direct din ser fara dezalbuminare prealabila, cu o solutie de oxalat de amoniu.

Reactivi.

1. oxalat de amoniu, solutie saturata;

2. acid sulfuric N/1;

3. permanganat de potasiu N/100. Se prepara in momentul intrebuintarii, diluand 1/10 solutia solutia de permanganat de potasiu N/10. Factorul (F) al permanganatului N/100 se determina prin titrare cu o solutie de acid oxalic N/100. Intr-o eprubeta de centrifuga se iau 2 ml acid oxalic N/100 si 2 ml acid sulfuric N si se titreaza la cald (60-70) cu permanganat de potasiu N/100 pana la culoarea roz care trebuie sa persiste 1-2 minute: F= unde :

n=numarul de ml permanganat de potasiu N/100 folositi la titrare.

Tehnica. a) Precipitarea calciului. Intr-o eprubeta de centrifuga Jena, cu fundul conic, se ia 1 ml ser nehemolizat si se adauga 1ml solutie saturata de sulfat de amoniu. Se lasa in repaus in pozitie perfect verticala pana a doua zi pentru precipitarea calciului, apoi se centrifugheaza 15 minute la viteza mare pentru ca precipitatul sa se depuna in varful conului eprubetei de centrifuga. Se indeparteaza lichidul supernatant prin sifonare sau absorbindu-l cu o pipeta Pasteur efilata fin si adaptata la pompa de apa. Pentru a se scurge bine tot lichidul se tine eprubeta 2-3 minute cu gura in jos pe o hartie de filtru. Se spala apoi precipitatul de 2-3 ori cu cate 2 ml apa distilata, amestecand bine.

Dupa fiecare adaugare a apei de spalare se centrifugheaza bine si se indeparteaza apa prin sifonare. La sfarsit se pune eprubeta cu gura in jos pe hartie de filtru pentru scurgerea completa a lichidului.

Titrarea. Se dizolva precipitatul in 2 ml acid sulfuric N tinand eprubeta 1 minut intr-o baie de apa la fierbere si amestecand cu o bagheta de sticla.

Intr-o alta eprubeta se face un martor in alb cu 1 ml apadistilata si 1ml acid sulfuric N. Se introduc eprubetele intr-o baie de apa si se titreaza la cald (60-70) cu permanganat de potasiu N /100 pana la culoarea roz palid care trebuie sa persiste 1-2 minute.

Calcul. 1 ml permanganat N/100 corespunde la 0,2 mg calciu. Calciu mg/100 ml=(n x F - m x F) x 0,2 x 100 unde:

F=factorul permanganatuluiN/100,

n= numarul de ml permanganat N/100 folositi la titrarea probei de analizat,

m= numarul de ml permanganat N/100 folositi la titrarea martorului in alb.

Metoda volumetrica Wood se bazeaza pe acelasi principiu utilizand acid sulfuric pentru solubilizarea precipitatului.

Spectrofotometria cu absorbtie atomica.

Reactivi:

1. complexon. Se dizolva 40 mg orto-cresoftaleina intr-un ml HCl concentrat, apoi se transfera cantitativ intr-un balon cotat de un litru cu 100 ml dimetilsulfoxid. Se adauga 2,5 g 8-hidroxichinoleina si se aduce la un litru cu apa distilata.

2. solutie dietilamina formata din 40ml dietilamina si 0,5 g cianura de potasiu, adusa la un litru cu apa.

3. solutie EGTA 0,13 mol/L. Se dizolva 0,5 g etilen glicol-bisN-N'-acid tetraacetic in 100ml apa distilata.

4. solutie stoc calciu 100mg/dL= 25 mmol/L. Se dizolva 2,50 g carbonat de calciu uscat in 100ml apa si 8 ml acid clorhidric concentrat. Dupa dizolvare se aduce la un litru cu apa distilata. Pentru uz curent, standardul se utilizeaza cu o concentratie 1: 10, acica 10mg/dl sau 2,5 mmol/L.

Tehnica. Intr-o eprubeta de plastic se pun 20 l ser sau standard de lucru, apoi 1ml reactiv(1), urmata dupa agitare de 1 ml solutie (2). Se agita si dupa 5 minute se citeste complexul colorat in rosu la 575 nm fata de un martor din reactivi fara ser. Se vor folosi eprubete si sticle din plastic.

(Absobtia probei / absosbtia standard) x concentratia standard = concentratia in proba.

Metoda este liniara pana la 20 mg /dl. Pentru urina se fac dilutii pentru a nu depasi 15-20 mg %. In cazul unei urini alcaline, in care se precipita o parte din calciul prezent, proba se va acidula in prealabil.

Valorile normale pentru ser sunt intre 9-10,3 mg/dl sau 2,2-2,6 mmol/L, iar in cazul urinii domeniul este de 50-250 mg (1,3-6,3 mmol) pe zi.

Determinarea calciuriei prin metoda Sulkovich.

Eliminarea calciului prin urina este proportionala cu calcemia.

Reactivi:

1. acid oxalic 2,5 g;

2. oxalat de amoniu 2,5 g;

3. acid acetic 5 g;

4. apa distilata 150 ml.

Tehnica : se pun in contact 5 ml urina, 2 ml reactiv. Apare o turbiditate care corespunde la o calcemie de 100 mg %.

Determinarea este aproximativa.

4. INTERPRETAREA REZULTATELOR PRIN RAPORTAREA LA VALORI DE REFERINTA

Valorile fiziologice ale calcemiei (mg/100 cm³ ser) la diferite specii se incadreaza in urmatoarele limite:

- om    = 9,0- 11,0

- bovine    = 8,5- 11,6

- vitel    = 10,0- 12,6

- suine    = 7,6- 11,9

- ovine    = 9,0- 12,0

- cabaline    = 11,2- 13,4

- iepure    = 11,2- 16,8

- pasari    = valori mai crescute (pana la 18 mg/100 cm³)

- caine    = 8- 12

- pisica    = 8- 12

Hipercalcemii se observa in general in cazuri rare, ele sunt generate de hiperfunctia paratiroidelor(corelata cu descresterea fosforului seric), precum si de hipervitaminoza D. Hipercalcemii pot aparea si in deshidratari insotite de hemoconcentratie.

Hipocalcemii se constata in urmatoarele cazuri: deficit de calciu in ratia alimentara, malabsorbtie, dezechilibru P/Ca, hipovitaminoze D, insuficienta paratiroidiana (asociata cu cresterea fosfatilor), gestatie, lactatie si diaree.

Hipocalcemia (cu diminuarea calciului ionizabil din ser) induce cresterea excitabilitatii neuromusculare asociata cu tetanie. Hipocalcemii se pot produce la animalele tinere la care determina instalarea rahitismului, la animalele adulte la care determina osteomalacie, la femelele in cursul gestatiei sau lactatiei la care provoaca accidente nervoase (tetanie etc.).

O manifestare tipica de hipocalcemie acuta se constata la vaci in febra puerperala asociata cu parturitia si debutul lactatiei, aceasta hipocalcemie se poate manifesta prin paralizie si uneori prin coma cu sfarsit letal. In acest caz se acrediteaza ideea unei tulburari in reglarea calcemiei la nivelul paratiroidelor, asociata cu gestatia si declansarea lactatiei.

CONCLUZII

Elementele minerale prezente in organismul animal sunt caracterizate prin proprietati favorabile circulatiei si mobilitatii chimice necesare vietii.

Sunt insa foarte multe interrelatii si interdependente minerale, probabil multe necunoscute pana in prezent, in care excesul sau deficitul unui mineral va influenta absorbtia sau utilizarea unui alt element mineral.

Profilaxia dismineralozelor rezida in primul rind, (si am spune aproape exclusiv), in alimentatia echilibrata si din punct de vedere mineral. Cu toata aparenta simplitate a unui asemenea enunt, echilibrarea ratiei este defapt foarte complexa.

Ele nu pot fi detectate fara investigatii complexe care se bazeaza in mare masura pe determinati de laborator, vizand concentratia mineralelor in sange si (sau) in tesuturi, respectiv activitatea unor enzime conditionate de acestea etc.

BIBLIOGRAFIE

1. PARVU GHE., 2004 - 'Supravegherea nutritional metabolica a animalelor', Editura Ceres, Bucuresti.

2. TAMAS V., SERBAN M., COTRUT M., 1981 - 'Biochimie medicala veterinara ', Editura Diactica si Pedagogica, Bucuresti.

3. CAMPEANU G., SERBAN M., IONESCU E., 1993 - 'Metode de laborator in biochimia animala', Editura Didactica si Pedagogica, Bucuresti.

4. GEORGESCU P., PAUNESCU E., 1960 - 'Metode biochimice de diagnostic si cercetare', Editura Medicala Bucuresti.

5. POPA G., MUSCA L., 1995 - 'Biochimie medicala - Analize de laborator', Editura Dunarea de Jos , Galati.

6. OLINESCU R., 1993 - 'Metode biochimice de laborator clinic', Editura Cerna, Bucuresti.

7. GHERGARIU S., POP A., SPANU M., KADAR L., 1999 - 'Manual de laborator clinic veterinar', Editura All, Bucuresti.

8. BARZA H., MAY I., GHERGARIU S., HAGIU N., 1992 - ' Patologie si clinica medicala veterinara', Editura Stiinta, Chisinau.

9. ADAMESTEANU I., 'Semiologie medicala', Manual de Lucrari practice, Curs litografiat, U.S.A.M.V. Iasi.

10. MARK H. BEERS, M.D., BERKOW M.D., 1999 - 'Manualul Merck', Editia a XVII -a, Editura All, Bucuresti.