REACTIA DE FIXARE A COMPLEMENTULUI (RFC):

REACTIA DE FIXARE A COMPLEMENTULUI (RFC):

• Principiu: RFC este un test de diagnostic serologic care permite evidentierea "in vitro" a reactiei antigen - anticorp (Ag / Ac) si are la baza proprietatea complementului (C = alexina) de a se fixa numai pe anticorpul sensibilizat din complexele Ag / Ac (C nu se poate combina numai cu unul dintre cele 2 elemente Ag sau Ac, care s- ar gasi singur in tubul de reactie).
• Reactia se bazeaza pe proprietatea complexelor imune de a fixa ireversibil C`; odata fixat pe complexul imun, C` nu se mai poate combina cu alte complexe Ag / Ac,
• In cazul in care fixarea C` pe primul complex Ag / Ac nu se manifesta printr-un fenomen direct observabil, autorii au evidentiat reactia indirect, prin adaugarea unui al 2- lea sistem - indicator Ag / Ac, format din:

Ag: globule rosii (hematii de berbec),

Ac: ser antihematii corespunzator, obtinut prin inocularea hematiilor de berbec la iepure. Fixarea C` pe cel de- al doilea sistem antreneaza liza hematiilor, vizibila cu ochiul liber.

• Complementul este o componenta normala a serului, care nu variaza in procesul de imunizare, al carui titru nu este influentat de prezenta anticorpilor.

Prin incalzirea serului de testat la 56C, timp de 30 min, actiunea complementului este inhibata; eventualii Ac prezenti in ser nu sunt distrusi la aceasta temperatura.

Reactia propriu- zisa:

• ser de bolnav (suspect) in care se banuieste prezenta unor anumiti Ac, se trateaza termic, 30 min la 56C, pentru inactivarea complementului propriu,
• serul de testat inactivat se pune in contact cu o suspensie de Ag corespunzator Ac banuiti,
• daca serul de bolnav contine anticorpii cautati (serul provine deci de la un bolnav real), se formeaza complexe imune Ag / Ac,
• se adauga o anumita cantitate de Complement (ser de cobai); in cazul in care in serul de bolnav exista Ac suspectati, C` se va fixa pe acesti Ac din complexele imune si nu va mai fi "disponibil" a se fixa de alte complexe Ag/ Ac prezente in sistemul de reactie. Daca serul de cercetat nu contine Ac suspectati, nu se formeaza complexe imune Ag / Ac, Complementul nu se fixeaza, ramane liber, "disponibil" a se lega de Ac activati ai celui de- al 2-lea sistem indicator.
• Sistemul indicator al reactiei Ag/ Ac este un sistem hemolitic: hematii de oaie (Ag) si ser anti- hematii de oaie (Ac):

Daca serul de cercetat contine Ac suspectati (Reactie +), Complementul ramane fixat in primul sistem imun Ag/ Ac, nu se "leaga" de sistemul hemolitic- indicator, deci nu are loc hemoliza (hematiile din godeuri cad in buton, cu lichid clar deasupra),

Daca serul de cercetat nu contine Ac cautati (Reactie -), Complementul nu se fixeaza de primul sistem imun Ag / Ac, ramane "liber" si se leaga la cel de- al 2- lea complex Ag/ Ac - sistem indicator, hemolitic, contribuind la obtinerea hemolizei.

Hemoliza indica un rezultat negativ (lipsa Ac suspectati in serul de bolnav),

Absenta hemolizei/ hematii in buton: indica un rezultat pozitiv (prezenta Ac cautatti in serul de bolnav).

Materiale necesare reactiei (Reactivi):

Serul de cercetat inactivat termic,

Antigenul (suspensii corpusculare microbiene, solutii coloidale, Ag standardizat, titrat, gata de utilizat),

Complementul (alexina): reprezentat de ser de cobai (cantitatea cea mai mare de complement). In momentul utilizarii, C` este titrat, pentru determinarea unei unitati alexice sau cantitatea minima de complement care determina hemoliza totala a 1 mL de sistem hemolitic la 37C. Titrarea C` se face punand in contact dilutii crescande de ser de cobai cu cantitate fixa de sistem hemolitic (termostatare 30 min, la 37C),

Sistemul hemolitic: amestec de hematii de berbec (Ag) 5% in ser fiziologic si ser hemolitic antioaie (Ac),

Tehnica de lucru:

RFC se realizeaza in doua faze:

• Faza I: Se pun in contact: ser de bolnav (inactivat termic, care poate contine Ac suspectati) + Ag (suspensia microbiana, coloidala cunoscuta) + alexina de cobai titrata,

daca in ser sunt Ac suspectati, sistemul imun Ag/ Ac fixeaza alexina,

daca in ser nu sunt Ac cautati, complexul imun nu se formeaza si alexina ramane libera.

• Faza aII-a: la elementele din faza I se adauga sistemul hemoltic - indicator: hematii berbec- Ac anti- hematii. In situatia mentionata, in care alexina poate fi libera (absenta Ac specifici in serul de bolnav), complexul imun hemolittic reactioneaza cu aceasta si produce hemoliza hematiilor (lichid rosu, clar).

Cand in faza I se produce reactia Ag/ Ac (datorita prezentei Ac specifici), alexina se fixeaza pe aceste complexe si nu mai produce liza sistemului hemolitic; hematiile cad in buton.

Schema reactiei:

Citirea reactiei:

eprubetele 1 si 2 contin serul de cercetat in cantitati de 0,1 si 0,2 mL,

in aceste eprubete, daca serul provine de la persoana sanatoasa, se produce hemoliza, lichidul se limpezeste (complement liber in faza I),

daca serul provine de la bolnav, nu se mai produce hemoliza, deoarece complementul a fost fixat de complexul Ag/ Ac present in serul bolnavului,

Interpretarea rezultatelor:

Aplicatii:

Reactia Bordet- Wasserman (RBW): serodiagnosticul luesului,

RFC in diagnosticul rickettsiozelor: tifos exantematic,

RFC in diagnosticul serologic al leptospirozelor (leptospira biflexa Patoc),

RFC in diagnosticul febrei recurente, brucelozei, toxoplasmozei, febrei tifoide, bacterioze,

RFC in serodiagnosticul gonoreei cronice,

* Pentru cresterea sensibilitatii si specificitatii se folosesc tehnici care inlocuiesc fixarea C` la cald (1 ora la 37) cu reactii de fixare la rece (tehnica Kolmer: 20 ore la +4C),

* Pentru cresterea specificitatii se folosesc Ag cu un grad mare de purificare sau se foloseste RFC cantitativ, in care reactia se executa cu numar mare de dilutii in ser de cercetat.

* Pentru utilizarea reactiei RFC in actiuni largi de depistare se folosesc micrometode executate in placi cu godeuri in cadrul carora se face titrare unica (in "tabla de sah") a C`; se folosesc concomitent Ag variate pentru diagnosticul sifilisului, rickettsiozelor, leptospirozelor, brucelozei (Tehnica Bredstreet si Taylor).

Avantajele reactiei: sensibilitate, specificitate inalte, grad inalt de reproductibilitate.