Mecanismele rezistentei la antibiotice

Mecanismele rezistentei la antibiotice

In prezent, pentru tratamentul infectiilor bacteriene, la om si animale se folosesc peste 250 de agenti antibacterieni, dar problemele clinice sunt departe de a fi rezolvate. Rezistenta bacteriana la antibiotice a fost recunoscuta imediat ce antibioticele au fost introduse in clinica. Genele codificatoare ale factorilor de rezistenta au preexistat momentului introducerii antibioticelor in clinica deoarece au fost recunoscute in colectiile bacteriene alcatuite inainte de utilizarea antibioticelor. In anii '50, Watanabe si colab. au observat ca Sh. disenteriae a devenit rezistenta nu numai la sulfonamide, dar si la tetraciclina si cloramfenicol.

Introducerea antibioticelor si a agentilor chimioterapeutici in tratamentul infectiilor a fost insotita de cresterea permanenta in timp, a frecventei cu care se izoleaza tulpini rezistente. Bacteriile prezinta o multitudine de cai prin care scapa de efectele inhibitorii ale substantelor terapeutice si gasesc noi modalitati de a invada tesuturile gazdei. Mutatiile care confera rezistenta la un antibiotic, pot sa inactiveze o familie intreaga de antibiotice inrudite structural. Astfel, bacteriile rezistente la o sulfamida sau la o tetraciclina, sunt rezistente la toate sulfamidele, respectiv la toate tetraciclinele. Mai mult, bacteriile pot sa posede gene de rezistenta pentru clase neinrudite de agenti antibacterieni, localizate pe plasmide ce pot fi usor transferate la alte specii sau la alte genuri.

Uneori, rezistenta la antibiotice este determinata de mutatii ale genelor cromosomale, dar de cele mai multe ori, rezistenta multipla este consecinta dobandirii unei plasmide R.

Rezistenta plasmidiala la antibiotice si la agentii chimioterapeutici a celulelor bacteriene este bine cunoscuta. Prezenta plasmidelor R in celulele bacteriene se coreleaza cu rezistenta multipla la antibiotice. Eliminarea plasmidelor este urmata de redobandirea sensibilitatii la aceleasi antibiotice.

Rezistenta plasmidiala la antibiotice este multipla si are capacitatea de a se raspandi nu numai pe verticala (de la o generatie celulara la alta), ci si pe orizontala, prin mecanismele de transfer genetic intre diferite specii patogene, sau de la specii saprobionte la cele patogene. Nivelul rezistentei se poate modifica sub raport cantitativ, prin modificarea numarului de copii ale plasmidei. Rezistenta plasmidiala nu modifica rata de crestere si nici virulenta tulpinilor bacteriene.

Efectul antibioticelor si al agentilor chimici antimicrobieni poate fi contracarat prin mai multe mecanisme, unele intrinsece fiziologiei bacteriei, iar altele rezulta din mutatiile genelor ce codifica pentru structurile tinta.

ADN cromosomal si plasmidial bacterian poseda un mare rezervor de gene de rezistenta, ce codifica diferite mecanisme de rezistenta la medicamente: activarea pompelor de eflux, enzime inactivatoare ale antibioticelor, modificarea tintei actiunii antibioticului.

Inactivarea enzimatica a medicamentului este cel mai comun mecanism al rezistentei la o varietate larga de tipuri structurale de antibiotice. Genele codificatoare ale enzimelor ce inactiveaza diferitele antibiotice se gasesc in rezerva naturala de gene de rezistenta: bacteriile din sol care traiesc in proximitatea organismului producator de antibiotic, pot sa produca enzime inactivatoare ale antibioticului. Genele ce codifica sinteza enzimelor inactivatoare pot fi transferate prin conjugare mediata de plasmide, ceea ce explica frecventa inalta la tulpinile bacteriene supuse presiunii selective a antibioticelor. Antibioticele pot fi inactivate prin clivaj enzimatic sau prin modificare chimica (fosforilarea, acetilarea sau adenilarea aminoglicozidelor), astfel incat ele nu mai sunt transportate in celula sau nu mai interactioneaza cu tinta specifica.

Modificarea chimica poate conferi rezistenta clinica la aminoglicozide, cloramfenicol, peniciline, cefalosporine.

β-lactamazele catalizeaza hidroliza ciclului β-lactamic, iar antibioticele aminoglicozidice sunt modificate chimic sub actiunea enzimelor specifice, prin fosforilare, adenilare sau acetilare; acetil-transferazele transfera un grup acetil de la un donor la un grup functional al antibioticului, convertindu-l la forma sa inactiva.

Efluxul activ al antibioticelor. Celulele bacteriene si eucariote au o varietate de sisteme de transport membranar, care indeplinesc functii vitale: inglobarea nutrientilor esentiali, eliminarea compusilor toxici, mentinerea homeostaziei celulare. Identificarea sistemelor de transport, al caror numar este intr-o continua crestere, se datoreaza utilizarii tehnicilor de clonare genica si secventiere (Paulsen, 1996). S-au identificat numeroase proteine de transport membranar (de ordinul sutelor), care au functii fiziologice importante, dar functioneaza si pentru eliminarea substantelor toxice din celula.

Efluxul transmembranar al antibioticelor este un mecanism foarte eficient al rezistentei. Rezistenta la antibiotice si la antiseptice a bacteriilor patogene se datoreaza frecvent, eliminarii medicamentului. Sistemele de rezistenta prin flux sunt dependente de energie si pot fi sisteme de transport activ primare sau secundare. Rezistenta mediata de pompele membranare de eflux a fost evidentiata initial, la o tulpina de E. coli, rezistenta la tetraciclina.

Pompele de eflux pot fi specifice pentru un anumit medicament (de exemplu, transportorul TetB la E. coli, elimina tetraciclina si un spectru ingust de analogi structurali) sau transporta o larga varietate structurala de medicamente si de aceea s-au numit pompe cu functie transportoare multipla.

Specificitatea de actiune a transportorilor de eflux este variabila: majoritatea transportorilor, inclusiv determinantii efluxului de tetraciclina, au un spectru ingust de actiune, iar pompele de tip MDR (rezistenta multipla = multi drug resistance) exporta compusi chimici cu structura chimica heterogena.

Sistemele de eflux multiplu au o semnificatie clinica majora: dobandirea unui astfel de sistem scade sensibilitatea la un spectru larg de agenti chimioterapeutici. In celulele neoplazice umane, rezistenta la agentii chimioterapeutici antitumorali este mediata in mod obisnuit de pompa de eflux multiplu reprezentata de glicoproteina P, care confera rezistenta la un spectru larg de medicamente citotoxice prin exportul dependent de ATP.

Bacteriile exprima si isi duplica informatia de supravietuire, printre care si genele de rezistenta la medicamente, localizate pe plasmide, transpozoni si integroni.

Toate proteinele de eflux dependente de ATP apartin suprafamiliei ABC, cunoscute si sub denumirea de ATP-aze de trafic. In general, transportorii de tip ABC au o structura moleculara alcatuita din 4 domenii.

Ulterior s-a identificat un numar mare de proteine de transport, care confera rezistenta multipla la medicamente (MDR = multidrug resistance), implicate in exportul unei mari diversitati de compusi chimici antimicrobieni, neinruditi din punct de vedere structural.

Transportorii multipli confera rezistenta multipla si utilizeaza gradientul electrochimic transmembranar al protonilor, sau uneori al ionilor de Na⁺, pentru a elimina medicamentul.

Pompele de eflux care confera rezistenta multipla la diferiti agenti antimicrobieni sunt exprimate la organismele saprobionte si patogene de tip salbatic, care nu au venit in contact cu antibioticele (inainte ca efluxul semnificativ al agentului antimicrobian sa se produca), dar functioneaza la un nivel semnificativ mai inalt la organismele rezistente. Existenta sistemelor de eflux, atat la bacteriile patogene cat si la cele saprobionte, sugereaza ca genele de rezistenta sunt colectate cu aceiasi rata. Pompele de eflux confera avantaj celulei, ceea ce explica conservarea genelor si diseminarea larga in populatiile bacteriene.

Rolul nativ al sistemelor de eflux este apararea celulei de compusii toxici exogeni. Alteori, sistemele de eflux multiplu par sa indeplineasca functii primare, nelegate de rezistenta la medicamente. Ele transporta medicamente multiple numai in situatii speciale.

Expresia celor mai multe proteine de eflux al medicamentelor este inductibila.   

Pompele de eflux care confera rezistenta multipla la antibiotice creeaza dificultati mari in tratamentul maladiilor infectioase.

Diminuarea ratei de inglobare(inhibitia intrarii medicamentului in celula). Scaderea permeabilitatii membranei externe a bacteriilor Gram negative si bariera periferica foarte eficienta a micobacteriilor, limiteaza difuzia medicamentelor. Permeabilitatea membranei externe a bacteriilor Gram negative se poate diminua prin pierderea porinelor sau ca rezultat al mutatiilor care modifica porinele si astfel rata difuziei pasive a medicamentului scade foarte mult. Pierderea mutationala a porinelor creste rezistenta la antibioticele hidrofile, deoarece aceste molecule sunt mai mari decat nutrientii si trec greu prin canalele de transport. Structura moleculara, dar in special datele experimentale, sugereaza ca antibioticele mici (β-lactamice, tetraciclina, cloramfenicol, fluoroquinolone) patrund in celula in special pe calea porinelor, cel putin la enterobacterii, care poseda porine cu permeabilitate inalta. Scaderea permeabilitatii porinelor poate sa mareasca nivelul rezistentei fata de agentii antibacterieni care traverseaza membrana externa prin canalele formate de porine. In contrast, antibioticele cu molecule mari, lipofile (macrolide, rifamicinele, novobiocina, acidul fusidic) difuzeaza cu dificultate prin porii canalelor. Pentru ele, difuzia lenta prin stratul lipidic este o cale semnificativa de patrundere in celula.

Membrana externa a bacteriilor Gram negative este o bariera eficienta pentru prevenirea influxului antibioticelor. Moleculele de LPS formeaza baza structurala a integritatii membranei externe. Ele sunt molecule polianionice legate electrostatic una de alta, datorita sarcinilor multiple negative ale lipidului A. Moleculele LPS leaga cationi bivalenti(Ca²⁺, Mg²⁺), formand o structura compacta hidrofoba, ca un "acoperis de tigla" pe suprafata membranei externe, impermeabila pentru moleculele hidrofile. LPS sunt intr-o stare de gel, cu fluiditate scazuta, in conditiile fiziologice de crestere a bacteriilor si constituie o bariera solida de permeabilitate. Fluiditatea scazuta a LPS se datoreaza unor interactiuni puternice intre moleculele de LPS invecinate.

In acelasi timp, LPS reprezinta "calcaiul lui Ahile" al acestei structuri. Antibioticele policationice din grupul polimixinei se complexeaza avid cu LPS si dezorganizeaza membrana externa, marind permeabilitatea pentru agentii cu actiune asupra membranei sau componentelor citoplasmatice. Toti agentii policationici se leaga de LPS anionice, cu o afinitate variabila.

In general, barierele fizice de permeabilitate produc rareori fenomene de rezistenta semnificativa, deoarece nici cele mai eficiente bariere nu pot stopa complet difuzia libera a moleculelor mici.

Modificarea mutationala a tintei antibioticului. Multe antibiotice inactiveaza o enzima specifica sau ribosomii. Un numar mare de tulpini rezistente apar printr-un proces mutational: sintetizeaza o proteina tinta care devine incapabila sa lege antibioticul sau mai rar, tinta isi pastreaza functia chiar dupa legarea antibioticului. Adeseori, diferenta dintre proteina de tip salbatic si cea mutanta consta in substitutia unui singur aminoacid in catena proteica. Ribosomii stafilococului pot deveni rezistenti la eritromicina dupa modificarea ARNr, iar rezistenta la rifampina poate sa rezulte din schimbarea unui singur aminoacid in subunitatea b a ARN-polimerazei.

Utilizarea unei cai metabolice rezistente (de ocolire a caii metabolice inhibate). Daca un medicament este activ prin inhibarea unei enzime esentiale a unei cai metabolice, celulele care produc o cantitate mai mare de enzima pot supravietui in prezenta medicamentului. De exemplu, rezistenta la trimetoprim poate fi datorata supraproductiei dihidrofolat reductazei (DHFR), mutatiei genei structurale a DHFR sau dobandirii unei gene care codifica o enzima DHFR rezistenta la actiunea medicamentului.

Rareori, medicamentul trebuie sa fie modificat de aparatul enzimatic al celulei bacteriene, pentru a deveni activ. Mutantele care nu pot metaboliza medicamentul devin rezistente: de exemplu, Bacteroides fragilis nu metabolizeaza metronidazolul si este rezistenta

Cauzele fenomenului de rezistenta la antibiotice

Plasmidele R nu au aparut ca rezultat al utilizarii antibioticelor in terapia antiinfectioasa. Ele sunt prezente in culturile bacteriene din colectii, izolate anterior erei antibioticelor. Frecventa izolarii tulpinilor bacteriene din mediul spitalicesc, cu rezistenta multipla, a crescut de la 0,2% la l958, la 58% in l965 si 95% in l980. Fenomenul rezistentei este intr-o expansiune constanta. Astazi, peste 99% din izolatele bacteriene din mediul spitalicesc sunt rezistente la una sau mai multe familii de antibiotice, ceea ce explica frecventa inalta a infectiilor nosocomiale. Utilizarea antibioticelor nu a indus aparitia plasmidelor R si nici a fenomenului de rezistenta, ci a determinat o selectie continua a tulpinilor rezistente, ceea ce explica preponderenta lor in clinica infectioasa.

Genele de rezistenta probabil au evoluat intr-o prima etapa la producatorii de antibiotice, ca parte a unei aglomerari de gene de biosinteza, pentru a proteja organismul de actiunea defavorabila a propriului sau antibiotic. Evenimentele ulterioare de transfer genic au diseminat determinantii genici de rezistenta la alte bacterii.

Cauzele cresterii procentului de tulpini bacteriene rezistente la antibiotice sunt:

- utilizarea antibioticelor pe scara larga in clinica umana, adeseori in situatii care nu impun o asemenea decizie;

- folosirea antibioticelor furajere. Acestea se gasesc in masa miceliana (de la fabricile de antibiotice), ce se administreaza in hrana animalelor. Efectul este benefic, pentru ca se elimina bacteriile enterice toxigene, vitaminele miceliene favorizeaza cresterea, dar antibioticul selecteaza tulpinile bacteriene rezistente.

Combaterea rezistentei plasmidiale este posibila pe urmatoarele cai:

- utilizarea rationala a antibioticelor, bazata pe observatia ca plasmidele au tendinta sa dispara, daca mediul de viata nu mai exercita o presiune selectiva;

- efectuarea unei antibiograme cantitative, inainte de administrarea antibioticului;

- interzicerea, pentru cativa ani, a utilizarii antibioticelor devenite ineficiente, ca urmare a selectiei in timp, a tulpinilor rezistente;

- eliminarea selectiva a plasmidelor R, prin utilizarea unor agenti care le inhiba selectiv replicarea;

- utilizarea unor antibiotice noi, de semisinteza.