TEHNICA WESTERN - BLOT

TEHNICA WESTERN - BLOT

PRINCIPIU: numeroase membrane sintetice pot lega proteine suficient de puternic incat devin suport pentru reactii imunologice in faza solida.

proteinele legate isi pastreaza reactivitatea antigenica fiind accesibile Ac din proba de testat,

acest principiu a dus la dezvoltarea unui numar mare de tehnici sensibile, cu mare specificitate, numite generic "imunobloturi",

curent utilizata este tehnica Western Blot (WB) in care, proteinele sunt transferate dintr- un gel de electroforeza pe o membrana suport si, ulterior reactioneaza cu Ac din proba,

tehnica WB combina selectivitatea electroforezei in gel cu specificitatea testelor imunologice, ceea ce permite detectarea si analizarea proteinelor aflate in amestec,

rezultatele sunt calitative.

Indicatii: confirmarea serurilor reactive (positive) prin tehnica ELISA sau IF,

Proba: ser sanguin prelevat si conservat in conditii uzuale,

Necesar:

truse comerciale care contin: benzile de nitroceluloza cu Ag fixate si reactivii necesari,

micropipete automate,

agitator,

sistem de spalare a benzilor.

Procedura: respecta indicatiile producatorului.

Citire si interpretare: vizualizarea reactiilor positive presupune aparitia unor linii cenusii- negrein dreptul antigenelor fata de care exista Ac in proba testate,

liniile de intensitate foarte slaba duc la interpretari subiective,

in acest caz, se recomanda repetarea testului pe o noua proba, la un interval de 1- 3 luni.

Control de calitate: se face cu seruri positive si negative, incubate separat.

Limite: prin scindare, migrare, etalare, unele situsuri antigenice pot fi denaturate, ceea ce genereaza rezultate fals negative,

cand un rezultat WB este neconcludent si in contradictie cu supozitia clinica, se impune folosirea unei tehnici principial diferite, PCR.