REACTIA DE PRECIPITARE

REACTIA DE PRECIPITARE

Principiu: prin punerea in contact a unui antigen (sub forma solubila, macromoleculara) cu anticorpul corespunzator, se formeaza complexe imune antigen- anticorp, care precipita in momentul in care componentele se afla intr- o anumita proportie.

In reactiile de precipitare, antigenele sau anticorpii se pot utiliza ca atare sau marcati (fluorocromi, enzime, izotopi).

Reactiile de precipitare pot avea loc in mediu lichid sau in mediu solid (reactii de difuzie).

Formarea precipitatului imun depinde de o serie de variabile si anume:

- calitatea (greutatea moleculara, numarul determinantilor antigenici etc) si concentratia antigenului,

- calitatea (tipul, heterogenitatea, aviditatea) si concentratia anticorpului,

- temperatura, pH, volumul de reactie etc,

Compozitia precipitatului imun, proportia de combinare a antigenului cu anticorpii sunt variabile in functie de zona in care a avut loc precipitarea: exces de antigen, echivalenta sau exces de anticorp.

Reactia de precipitare este foarte sensibila si specifica, in ceea ce priveste decelarea antigenului (reactia evidentiaza cantitati foarte mici de antigen, acesta participand la formarea agregatelor, in cantitati mult mai mici decat anticorpii).

TEHNICA DE PRECIPITARE:

1. MEDIU LICHID:

a)      precipitare in amestec (floculare)

- metoda Ramon,

b) precipitare in inel:

- reactia Uhlenhuth,

- reactia Ascoli,

c) precipitarea in tub capilar:

- decelarea proteinei C reactive,

d) pe lama:

- test Ferreira,

2. MEDIU SOLID:

a) difuzie simpla:

- unidimensionala (metoda Oudin),

- bidimensionala (metoda Mancini- Carbonara- Heremans),

b) difuzie dubla:

- unidimensionala (Oakley - Fulthorpe),

- bidimensionala:

* radiala (Ouchterloni),

* lineara: - in unghi de 90º (Elek)

c) difuzie combinata cu migrare in camp electric: - imunelectroforeza,

- contraimunelectroforeza,

- electroimunodifuzia.

Aplicabilitate in domeniul imunologiei:

studierea unor antigene de provenienta bacteriana (toxine, componente proteice sau polizaharidice bacteriene),

antigene virale (antigen HBs),

evidentierea unor antigene (proteine patologice) in serul bolnavilor, cu afectiuni inflamatorii (proteina C reactiva), neoplazice (alfa feto proteina).

A. Reactia de precipitare in mediu lichid:

1. Reactia de precipitare in amestec (R. de floculare)

* Metoda Ramon:

se pun in contact, in amestec, cantitati fixe de antigen cu cantitati variabile de anticorp,

metoda se aplica in scopul stabilirii puterii antigenice a unei toxine (titrul), utilizand cantitati variabile de anticorp cu titrul cunoscut,

Ex.: stabilirea titrului toxinei difterice pentru a fi utilizata in imunizarea cailor, pentru obtinerea de seruri imune/ antidifterice, in tratamentul difteriei.

Metoda de lucru: titrarea toxinei difterice:

din ser antidifteric (anticorpi), cu titrul cunoscut (100 UA/mL), se fac dilutii succesive in ser fiziologic steril, in volum de 1 mL,

peste aceste dilutii se adauga toxina difterica, in cantitate fixa: 1 mL,

se folosesc pipete diferite pentru fiecare reactant,

se agita eprubetele si se introduc in baie de apa la 52C,

se urmareste reactia la fiecare 3 min pentru a prinde momentul pozitivarii ei: prima eprubeta unde a aparut reactia de floculare: unirea unor cantitati echivalente de antigen si anticorp,

daca flocularea a aparut in tubul nr. 4, de ex, amestecul reactiei contine 0,4 mL ser antidifteric, adica 40 UA (unitati antitoxice). In acest tub, 1 ml toxina contine o cantitate echivalenta (40 U) unitati floculante Limes. Deci titrul toxinei difterice este de 40 unitati floculante Limes.

2. Reactia de precipitare in inel:

* Principiu: antigenul si anticorpul se pun in contact astfel incat sa nu se amestece; la interfata intre cele 2 lichide, unde se creeaza o proportie optima intre concentratia de antigen si anticorp, apare un inel de precipitare.

a)      Reactia Uhlenhut:

reactia se foloseste pentru identificarea naturii, provenientei unor proteine (rol de antigen), in medicina legala,

se poate preciza daca o pata de sange este de provenienta umana sau nu,

in industria alimentara, pentru stabilirea provenientei carnii,

antigenul se extrage din sangele recoltat (de pe rufe, haine etc), prin spalare in ser fiziologic, centrifugare,

intr- o serie de eprubete se repartizeaza antigenul in dilutii diferite si se adauga ser antiproteina umana, astfel incat cele doua componente sa nu se amestece,

se folosesc tuburi martor: martor sigur (+)/ ser uman si martor sigur (-)/ ser de cal

b) Reactia Ascoli:

reactia se utilizeaza pentru diagnosticul retrospectiv al antraxului,

- din organele animalului suspectat a fi decedat de antrax se extrage antigenul,

- antigenul este format dintr- o fractiune proteica termostabila, din compozitia bacilului carbunos (Bacillus anthracis),

*Extragerea antigenului:

- fragment de organ se mojareaza in solutie de ser fiziologic steril, in proportie de 1/ 5,

- se adauga cateva picaturi de acid acetic si se fierbe timp de 5- 10 min,

- se decanteaza si se neutralizeaza supernatantul cu cateva picaturi de NaOH,

- se filtreaza prin hartie de filtru,

- filtratul contine toxina termostabila, care se foloseste drept antigen.

se mentin eprubetele 5- 10 min la temperatura camerei, dupa care se face citirea reactiei:

reactie (+): aparitia unui inel de precipitare in tubul nr. 1,

in eprubetele 2 si 3, ca martori negativi, inelul lipseste.

c) Determinarea grupului streptococic:

Izolarea din exudat faringian (sau alte produse patologice) a altor streptococi beta hemolitici (test bacitracina negativ) decat streptococul beta hemolitic de grup A (test bacitracina pozitiv/ Streptococcus pyogenes), necesita o reactie de determinare a apartenentei de grup, a acestora.

* Metoda Lancefield: extractie acida a antigenului streptococic de grup (fractiunea polizaharidica specifica de grup), prin tratarea cu HCl a sedimentului culturii in bulion a tulpinii de testat.

Antigenul preparat se pune in contact (fara sa se amestece) cu antiseruri specifice de grup (A, B, C, F, G etc/ preparate pe iepuri), in tuburi cu lumen foarte ingust.

Tuburile se mentin la temperatura camerei, timp de 10 min, pana cand va aparea un inel de precipitare la interfata dintre antigen si anticorpul corespunzator.

Tubul in care va aparea inelul de precipitare va indica apartenenta de grup a streptococului, cunoscand antiserul respectiv.

3. Reactia de precipitare in tuburi capilare:

* Principiu: reactia se executa punand in contact antigenul cu anticorpul in tuburi capilare (varfuri de pipete Pasteur).

a) Determinarea tipului M streptococic:

anumite tipuri M de streptococ beta hemolitic grup A, determina complicatii renale si cardiace, secundare unei infectii acute streptococice,

antigenul proteic M din peretele bacterian se obtine prin tehnica extractiei acide (HCl) la cald, din sedimentul culturii in bulion glucozat 2%

extractul proteic se pune in contact (prin absorbtie) cu cantitati egale de seruri antistreptococice de tip M (preparate pe iepuri), in tuburi capilare,

capetele se etanseizeaza cu plastilina,

se termostateaza 2 ore la 37C, apoi se lasa peste noapte la frigider,

aparitia unui precipitat abundent la baza unuia din tuburi, indica apartenenta de tip (antiserul respectiv, cunoscut).

b) Determinarea unor proteine patologice in serul bolnavilor (proteina C reactiva):

In:

faza acuta a unui proces inflamator,

intr- un proces necrotic sau

proces neoplazic,

in serul bolnavilor apare o proteina cu caracter patologic, numita proteina C reactiva.

Aceasta este pusa in evidenta prin reactia de precipitare: se pun in contact, in tuburi capilare, cantitati egale de ser de bolnav si ser antiproteina C reactiva.

Prezenta unui precipitat indica o reactie pozitiva, cantitatea de precipitat fiind proportionala cu intensitatea reactiei.

B. Reactii de precipitare in mediu gelifiat (metode cantitative)

* Principiu: reactia are loc intr- un mediu gelifiat (0,8 - 1,25 g agar %), in care, moleculele de antigen si anticorp pot migra prin porii gelului, care are un continut mare de apa.

La locul de intalnire a unor anumite cantitati de antigen si anticorp corespunzator, apare o linie vizibila de precipitare.

a) Difuzia simpla (metoda Mancini)

Aplicatii:

• Imunograma (determinarea cantitativa in serul bolnavilor a unor fractiuni proteinice, cum ar fi IgA, IgM, IgG),
• Determinarea fractiunilor Complementului in ser uman.

Metoda de lucru:

in placi de polistiren cu diametrul de 5 cm, se toarna gel de agar in care a fost inglobat, intr- o cantitate optima, antiserul (Ac) corespunzator tipului de componenta proteica (Ag) pe care dorim sa o identificam (ser anti- IgA, anti- IgM, anti- IgG, anti- complement),

in agar se efectueaza godeuri de 2 mm (cu un tub metalic) in forma de rozeta, respectand distanta optima intre ele,

in godeuri se introduc cate 5 l din preparatul proteic de identificat (seruri de bolnav, ce contin cantitati necunoscute de Ag corespunzator Ac inglobat in gel), cu ajutorul unei micropipete,

in godeul central se introduc 5 l de ser uman de referinta (cantitate cunoscuta dintr- un Ag cunoscut, al carui Ac corespunzator este inglobat in gel),

placutele se termostateaza la 37C timp de 24 ore pentru IgG, complement si 48 ore pentru celelalte componente (Ig A, IgM),

din godeuri va migra antigenul (a carui cantitate dorim s- o calculam), care va intalni anti- serul corespunzator, inglobat in gel,

dupa termostatare, in jurul godeurilor apar cercuri concentrice, de diametre variabile, formate din linii de precipitare,

se masoara diametrul zonelor de precipitare si se compara cu diametrul dat de serul standard, cu concentratie cunoscuta, din centrul placii,

astfel se poate stabili cantitatea de Ag (IgA, IgG, IgM sau complement), utilizand tabele intocmite pe baza unor experimentari pe numeroase seruri, care stabilesc raportul dintre diametrul zonelor de precipitare si cantitatea de Ig sau complemnt corespunzatoare.

2. Difuzia dubla:

a) Difuzia dubla radiala (metoda Ouchterlony)

Principiu: antigenul si anticorpul se introduc in godeuri fata in fata, vor migra in gel si la locul de intalnire se formeaza linii de precipitare vizibile (metoda calitativa nu si cantitativa)

Metoda de lucru:

gelul de agaroza se aplica pe lame de sticla, bine degresate,

in godeul central se pune Ac cunoscut, corespunzator Ag cunoscut din godeurile martor, dispuse fata in fata,

in godeurile marginale, dispuse in rozeta, se introduce antigenul (2 martori cu Ag cunoscut, corespunzator Ac din godeul central si 6 seruri de bolnav, de verificat daca contin sau nu, acelasi Ag, ca si martorii),

la locul de intalnire (Ag - Ac corespunzator) se formeaza linie de precipitare,

este dubla difuzie, deoarece migreaza si Ac (godeu central) si Ag (godeuri marginale),

godeul care contine serul de bolnav, prezinta sau nu linie de precipitare la mijlocul distantei fata de godeul central (Ac), daca contine sau nu Ag similar godeului martor (Ag cunoscut si corespunzator Ac din godeul central).

Aplicatii:

determinarea tipului M streptococic,

proteina C reactiva,

alfa - feto- proteina.

b) Difuzia dubla (metoda Elek):

Metoda se aplica in bacteriologie pentru determinarea toxinogenezei bacililor difterici, izolati din exudate nazo- faringiene,

Mod de lucru:

in placa Petri cu geloza se practica un sant de 6/ 1,5 cm in centrul acesteia,

se scoate geloza, se toarna un strat subtire de geloza calda, se raceste,

se toarna in sant ser anti- toxina difterica,

se acopera santul cu geloza calduta, fara a inactiva termic serul antidifteric, se raceste geloza,

se insamanteaza tulpini de bacil difteric (Corynebacterium diphteriae) perpendicular pe directia santului, oprindu- se la 0,5 cm de marginea acestuia,

se insamanteaza si un martor sigur (+): tulpina de bacil difteric sigur producatoare de toxina difterica (tulpina toxigena),

se termostateaza la 37C, 24 ore,

tulpinile de bacil difteric toxigene, vor sintetiza toxina, la cald, aceasta va difuza in gel,

din santul practicat in geloza, vor difuza anticorpii specifici anti- toxina difterica,

la locul de intalnire a antigenului cu anticorpul, se formeaza linii de precipitare, sub forma de "mustati"/ specific,

aparitia in unghiul format intre tulpina de testat si santul cu ser antitoxina difterica a liniilor de precipitare, arata ca tulpina este toxigena, la fel cu tulpina martor, sigur producatoare de toxina difterica.

Imunelectroforeza (IEF):

Principiu: asocierea electroforezei in gel (separarea antigenelor in functie de incarcatura lor electrica) cu difuzia dubla (precipitarea specifica a antigenelor de catre anticorpi) are ca rezultat formarea unor arcuri de precipitare specifice, corespunzatoare antigenelor din proba migrata.

IEF permite:

- separarea si determinarea numarului de constituenti dintr-un amestec de antigene,

- definirea antigenelor pe baza mobilitatii electroforetice,

- izolarea din gel a antigenului urmarit pentru a realiza o analiza imunochimica mai amanuntita.

Contraimunelectroforeza (CIE):

Principiu: proteinele cu migrare anodica sunt precipitate intr-un camp electric de catre anticorpii specifici.

CIE reprezinta o dubla difuzie la care deplasarea antigenului si anticorpului este accelerata de un camp electric.

La pH 8,2 - 8,6 in gelul de agar, anticorpii incarcati slab negativ se deplaseaza spre catod, iar antigenele cu sarcina electrica mai mare spre anod. Aceste deplasari se fac in "sens contrar", iar difuzia in alte directii decat cea a campului electric este impiedicata.

Indicatii:

- decelarea sau identificarea unor proteine serice patologice (alfa feto proteina, produsii D si E de degradare ai fibrinogenului),

- antigene bacteriene, virale, parazitare (antigene meningococice, streptococice, pneumococice, antigenul HBs etc.