REACTIA DE SERONEUTRALIZARE

REACTIA DE SERONEUTRALIZARE

DEFINITIE:

Reactia de seroneutralizare face parte din categoria reactiilor serologice de inhibare specifica a unor caracteristici biologice ale antigenului microbian.

Seroneutralizarea releva combinarea antigenului specific, biologic activ, cu anticorpul corespunzator, conducand la blocarea proprietatilor biologice ale acestuia.

Reactia antigen specific - anticorp neutralizant omolog este evidentiata "in vivo" sau "in vitro".

Pentru vizualizarea reactiei sunt necesare diferite substrate biologice indicatoare, pe care sa se observe prezenta sau absenta efectului biologic.

PRINCIPIU:

Reactia de seroneutralizare se desfasoara in doi timpi:

a)      In prima etapa se pun in contact imunoreactantii: antigenul si serul imun neutralizant ce contine anticorpii anihilanti.

Dupa o perioada de incubare (formarea imunocomplexelor specifice) amestecul este testat pentru efectul sau biologic, pe un substrat indicator receptor.

b)      Etapa a II-a: in situatia corespondentei celor doi imunoreactanti efectul biologic specific al antigenului, nu se produce (proprietatea biologica a antigenului a fost neutralizata de catre anticorpii neutralizanti specifici din serul imun). Daca nu exista corespondenta intre antigen si anticorp, antigenul biologic activ va produce anumite efecte pe substratul indicator.

REACTANTII:

In reactiile de seroneutralizare sunt necesari imunoreactantii si substratul- indicator.

* Antigenele implicate in reactie pot fi:

exotoxine bacteriene,

enzime bacteriene,

virusuri,

bacteriofagi.

Exotoxine bacteriene: produse de bacterii Gram pozitive, la nivelul portii de intrare in organism, la diferite nivele. Toxinele trec in sange si se fixeaza ireversibil pe diverse celule din organism, care au receptori de fixare pentru acestea. Apar leziuni specifice, ireversibile. Ex: toxina difterica are tropism pe multe tipuri de tesuturi, in special cele care prezinta metabolism energetic intens: miocard, capsulele suprarenale, nefroni, seroase.

Enzime bacteriene: antigene puternice, care prin detoxifiere/ inactivare, devin anatoxine, care pierd puterea toxigena, dar pastreaza o inalta putere imunogena. Anatoxinele inoculate in organism, in cursul unor imunizari, induc sinteza anticorpilor antitoxici neutralizanti, imuno- protectori.

Virusurile: sunt antigene agresive, se fixeaza specific pe celulele receptoare, cauzand efecte lezionale citotoxice. In sistemele celulare indicatoare, in vitro, induc efecte ce pot fi abolite de anticorpii neutralizanti corespunzatori.

* Imunoseruri neutralizante (anticorpii): anticorpii neutralizanti au proprietatea de a se fixa rapid pe antigenele biologic active, inhiband efectul acestora.

- Aviditatea serurilor imune: viteza cu care anticorpii neutralizanti se fixeaza pe situsul toxic al exotoxinei, blocand capacitate acesteia de a se fixa pe substratul celular receptor.

* Substrat celular - indicator: pe care se fac testarile amestecurilor imune antigen specific - anticorp neutralizant:

- animale, organism uman,

- culturi celulare etc.

APLICATII:

1. Diagnostic microbiologic de certitudine:

identificarea serologica a Cl. perfringens,

identificarea "in vivo" a capacitatii de sinteza a exotoxinei difterice,

decelarea exotoxinei botulinice din produs infectios,

identificari serologice virale.

2. Diagnostic serologic, serodiagnostic:

dozarea anticorpilor ASLO,

serodiagnosticul unor viroze

3. Titrarea puterii toxice a exotoxinelor,
4. Evaluarea actiunilor de vaccinare.

REACTIA ASLO:

Reactia de seroneutralizare este utilizata in Diagnosticul microbiologic indirect.

Reactia ASLO se pracica pentru:

diagnosticul serologic al infectiilor streptococice si post- streptococice,

diagnosticul complicatiilor tardive post- streptococice,

urmarirea evolutiei unei infectii streptococice,

urmarirea eficientei tratamentului.

* O reactie ASLO (-) nu infirma diagnosticul de infectie streptococica.

* In 80% din cazurile de infectii streptococice reactia ASLO este pozitiva,

* In 20% dintre infectiile streptococice reactia ASLO este negativa - cauze:

infectii cu tulpini de Streptococcus pyogenes slab productive sau neproductive de streptolizina O,

infectii in organisme imunodeprimate,

in cazul in care tratamentul antibiotic este instituit foarte precoce,

in sangele bolnavului exista mucine care blocheaza anticorpii antistreptolizina O, determinand reactii ASLO fals negative.

* Reactii ASLO fals pozitive - cauze:

- prezenta in serul bolnavilor a unor inhibitori nespecifici ai streptolizinei O, α - si β- lipoproteine, in boli asociate ca: hepatite, nefroze, boli autoimune (lupus eritematos diseminat, poliartrita reumatoida), tuberculoza etc.

Pentru a indeparta inhibitorii nespecifici, care determina reactii fals pozitive, o etapa obligatorie a reactiei ASLO este tratarea serului de bolnav cu solutie 0,4% Rivanol, care precipita α - si β- lipoproteinele. Aceste precipitate se inlatura prin centrifugare.

- alta sursa de reactii fals pozitive, o constituie suprainfectarea serurilor de bolnav cu Pseudomonas sau Bacillus, care elaboreaza enzime ce oxideaza streptolizina O si o inactiveaza. Streptolizina O este oxigen - labila; in forma inactivata nu actioneaza asupra hematiilor si reactia se interpreteaza ca fals pozitiva.

PRINCIPIU: dozarea anticorpilor antistreptolizina O se bazeaza pe efectul neutralizant al acestora asupra streptolizinei O (hemolizina O). Seroneutralizarea streptolizinei O (SLO) prin existenta in ser a antistreptolizinei O, este vizualizata prin absenta hemolizei unor eritrocite - test, care constituie substratul celular indicator.

In absenta anticorpilor antistreptolizina O, streptolizina O isi exercita efectul litic pe hematii, efect tradus prin prezenta hemolizei.

MATERIALE SI REACTIVI NECESARI:

ser de cercetat (sau seruri- pereche, recoltate la interval de 2 saptamani),

SLO liofilizata (standardizata de catre producator),

Sange defibrinat de iepure/ berbec,

Solutie salina izotona, solutie de Rivanol 0,4%,

Eprubete, pipete gradate,

Baie apa, centrifuga.

TEHNICA DE LUCRU:

* prima etapa a reactiei ASLO:

- serul de bolnav recoltat in conditii sterile, se inactiveaza 30 min la 56C si se trateaza cu Rivanol 0,4%, pentru indepartarea inhibitorilor nespecifici,

- se efectueaza dilutia 1/ 10 a serului si se mentine 30 min la 56C,

- se realizeaza dilutii succesive, binare, de ser si se pun in contact cu SLO (cantitate constanta, cate 0,5 mL/ tub);

- se agita tuburile si se mentin 15 min la 37C (REACTIA DE NEUTRALIZARE),

* a II-a etapa a reactiei:

- se adauga suspensia de hematii (5%), cantitate fixa, 0,5 mL in fiecare tub,

- se agita pentru omogenizare si se incubeaza 45 min la 37C plus peste noapte la 4C,

- citire finala a doua zi.

Schema reactiei ASLO:

Titrul este dat de tubul cu dilutia cea mai mare de ser de testat in care lipseste hemoliza, ceea ce exprima prezenta unei cantitati suficiente de anticorpi ASLO, capabili sa neutralizeze intrteaga cantitatte de SLO din amestec.

INTERPRETARE:

daca infectia streptococica (cu streptococ beta hemolitic grup A) a fost corect tratata se ajunge la sterilizarea bacteriologica a bolnavului si la scaderea in timp a titrului antticorpilor ASLO, pana la valori normale (0- 200 UI/mL),

titruri crescute de anticorpi, persistente, urmarite in dinamica, corelate si cu alte teste imunobiologice, precum si cu aspectul clinic, atrag atentia asupra unor complicatii post - streptococice, ca Sindrom poststreptococic (reumatism articular acut, cardita reumatismala, glomerulonefrita acuta)

Control de calitate: Martor pentru hematii, tub martor pentru SLO.