Cromatografie

Cromatografie

Separarea diferitelor substante dintr-un amestec constituie una dintre cele mai importante probleme ale chimiei analitice. Metoda cromatografica se bazeaza pe repetarea echilibrului de repartitie a componentelor unui amestec intre o faza mobila si una stationara. Datorita diferentelor in repartitie are loc deplasarea, cu viteza diferita, a componentelor purtate de faza mobila de-a lungul fazei stationare. In functie de natura fazelor se disting urmatoarele tipuri de cromatografie:

In general, metodele de separare cromatografice se impart in doua categorii: in prima intra cele care se bazeaza pe interactiunea diferita a componentilor cu faza stationara (repartitie, adsorbtie, schimb ionic si afinitate), iar in a doua cele care se bazeaza pe marimea diferita a componentilor (excluziunea sterica). Schema de principiu a unui cromatograf (LL sau LS) este reprezentata mai jos. El se compune din: sursa de eluent, dispozitiv de introducere al probei, coloana si un detector la care se adauga urmatoarele anexe: sursa de eluent, dispozitiv de masurare si reglare a debitului, dispozitiv de introducere a probei, instrument de inregistrare a semnalului furnizat de detector. Principiul cromatografiei este urmatorul: eluentul trece prin dispozitivul de introducere a probei, preia proba de analizat si o introduce in coloana cromatografica. Coloana cromatografica este sediul procesului de separare. Din cauza interactiunii moleculelor cu faza stationara, componentele din amestecul de analizat raman in urma eluentului, in functie de diferentele care exista intre constantele echilibrului de repartitie intre cele doua faze.

Cromatografie de lichide si picul cromatografic

Componentele amestecului separat vor iesi din coloana la timpuri diferite, dupa care sunt introduse de eluent in detector. Acesta transforma diferenta unei proprietati fizice intre component si eluent, intr-un semnal electric, proportional cu concentratia componentului din eluent. Inregistrarea grafica a semnalului detectorului in functie de timp se numeste cromatograma (fig. 2). Timpul t_R la care apare maximul unui pic, masurat din momentul introducerii probei se numeste timp de retinere sau retentie si este o caracteristica calitativa a componentului respectiv. Inaltimea picului h sau aria lui, A, sunt caracteristici cantitative, proportionale cu cantitatea componentului din proba. Se noteaza cu t_M (timp mort) timpul in care eluentul si componentele care nu interactioneaza cu faza stationara parcurg distanta pana la detector. Astfel putem exprima viteza zonei componentului (v) si a eluentului (u) prin urmatoarele ecuatii: v = L/t_R, u = L/t_M, unde L este lungimea coloanei. Coeficientul de partitie K reprezinta raportul dintre concentratia molara (c_S) a substantei in faza stationara si concentratia substantei in faza mobila (c_M): K = c_S/c_M. Fractiunea din timpul de retinere in care o molecula se gaseste in faza mobila se noteaza cu R si reprezinta probabilitatea ca molecula sa se gaseasca in faza mobila, respectiv fractiunea din totalul moleculelor care se afla in faza mobila. 1 - R reprezinta restul moleculelor care se gasesc in faza stationara. La echilibru reiese ca:

, R = , R = v/u = t_M/t_R,

unde V_M si V_S reprezinta volumul fazei mobile, respectiv stationare iar k = KV_S/V_M reprezinta raportul dintre cantitatea totala de substanta aflata in faza stationara si cantitatea totala de substanta aflata in faza mobila si se numeste factor de capacitate Pentru o specie oarecare A aflata in amestec, factorul de capacitate k_A va fi:

,

Factorul de capacitate k este o functie de parametri de solubilitate, in cazul cromatografiei de separatie lichid-lichid. Practic, in vederea obtinerii unei rezolutii maxime pe unitatea de timp, trebuie ca valoarea lui k sa fie cuprinsa intre 2 si 5. Factorul de separare α pentru o anumita coloana de separare este un parametru utilizat pentru descrierea diferentelor ce apar intre vitezele de migrare a componentilor. Se defineste ca fiind raportul dintre factorii de capacitate k_A si k_B, ai componentului B (care trece mai greu prin coloana) si A (componentul care se elueaza mai repede) aflati in amestec. Una dintre cele mai importante caracteristici ale unui sistem cromatografic este eficienta sau numarul de talere teoretice. Cu cat o coloana va avea mai multe talere pe unitatea de lungime cu atat eficacitatea ei de separare va fi mai buna. Numarul de talere N poate fi definit din cromatograma unui singur pic astfel:

N =

unde: t_R este timpul de retentie, este dispersia aceleiasi benzi in unitati de timp, iar W este valoarea segmentului pe abscisa rezultat din intersectia celor doua tangente prin punctele de inflexiune ale picului. N este un numar adimensional. Aceeasi valoare a lui N poate fi obtinuta din volumul de retentie V_R si dispersia exprimata in unitati de volum. Numarul de talere N este o masura a eficientei intregului suport al coloanei. O alta masura a eficientei coloanei, folosita curent in cromatografie este data de inaltimea unui taler H (inaltimea echivalenta a unui taler teoretic):

N = , , H = , R =

unde L este lungimea coloanei cu umplutura. Pentru caracterizarea separabilitatii a doi componenti s-a introdus notiunea de rezolutie, notata R_S. In expresia rezolutiei s-a cautat sa se lege marimile care caracterizeaza proprietatile termodinamice ale fazelor si componentilor precum si marimile care caracterizeaza dinamica proceselor din coloana. Rezolutia este o notiune mai cuprinzatoare, continand si marimile care caracterizeaza eficacitatea coloanei precum si selectivitatea ei.

Pentru simularea unei cromatografii de lichide se va folosi produsul software Chemland produs de o echipa formata din programatori, designeri si animatori de la Universitatea Massachusetts din Armhest, U.S.A. (https://soulcatcher.chem.umass.edu). Pe langa programul de simulare propriu zis, pachetul software contine si un tutorial bine documentat si ilustrat cu desene si animatii. Simularea unor experimente reale de laborator, care se bazeaza pe probe, faze mobile si faze stationare reale, poate fi utilizat pe langa calitatea de material de invatare, formare priceperi si deprinderi si ca si o baza de date cu informatii reale despre cromatografia de lichide care poate fi utilizata oricand ca preambul la experiment. Pe intreg parcursul pachetului software, se pot observa cuvinte rezervate colorate in verde deschis. Apasand aceste cuvinte, se vor afisa definitii sau informatii aditionale despre subiectul in discutie. Acestea se inchid apoi prin simpla apasare asupra lor. Actionand asupra textului albastru se va produce o legatura catre informatii aditionale, animatii si simulari. Textul albastru se transforma in rosu dupa actionare. Pentru intoarcerea la textul original, se actioneaza asupra texului colorat in rosu.

Algoritmul de lucru

Se utilizeaza programul pentru formarea deprinderilor de simulare astfel:

Se lanseaza programul in executie ( Start/Programs/LC);

Se intra in meniul aplicatiei (click pe fereastra Chemland);

Se intra in sectiunea 2 (se apasa tasta mouse-ului cu cursorul pus pe butonul din dreapta jos al ferestrei), unde apare o descriere generala a cromatografiei si este simulata o coloana de separare in care se introduce un amestec format din doi componenti A si B in diferite concentratii molare;

Se ruleaza programul de simulare, injectand amestecul lichid in coloana (click pe butonul Elute) si se obtine in final, raspunsul = f(timp) sub forma de picuri, separand cei doi compusi existenti in amestec; se obtine o cromatograma; modificand concentratia componentilor A si B se obtine o alta cromatograma.

Se acceseaza sectiunea 8 (butonul din dreapta jos al ferestrei) unde se va simula un experiment al caror rezultate se noteaza pas cu pas in caiet;

Se selecteaza categoria de compusi (componenti ai acizilor nucleici, aminoacizi sau tyrosine si tyronine);

Se selecteaza doi componenti aflati in amestec (de exemplu, din categoria aminoacizilor se selecteaza lizina si glicina);

Se selecteaza apoi faza mobila (mobile phase), tipul coloanei (column type), debitul (flow rate), temperatura de lucru si tipul de detectie (detection); este necesar de precizat ca nu toate optiunile apar la fiecare amestec in parte;

Se ruleaza modulul de simulare (click pe butonul Elute);

Modificand parametrii mai inainte enumerati, pentru acelasi amestec ales, se observa ca cromatograma se modifica odata cu schimbarile facute;

Se noteaza concluziile referitoare la modelul ales (valorile lui K si α);

Se ruleaza modulul de simulare pentru alta categorie de compusi (compound categories), repetand pasii 1.9-1.11;

In final se compara datele experimentale obtinute alegand valorile optime pentru dimensiunile coloanei, tipul de coloana (column type), faza mobila (mobile phase), debitul (flow rate), temperatura folosita, detectie (detection), astfel incat sa rezulte un factor de separare α cel mai bun.

Pentru separarea unor componenti necunoscuti dintr-un amestec se acceseaza sectiunea 9 a programului (butonul din dreapta jos al ferestrei) si se procedeaza astfel:

Se alege un compus din lista de compusi cunoscuti;

Se selecteaza faza mobila (mobile phase) (de exemplu: apa) si conditiile experimentale: tipul de coloana (Sephadex 625, medium particule size, L = 35cm, D = 2.5cm), debitul (25mL/h - flow-rate), temperatura (room temperature), detectie (U.V. absorption detection);

Se ruleaza modulul de simulare (click pe butonul Elute) si se noteaza raspunsul in timp al fiecarei substante cunoscute, pentru ca ulterior, aceste valori sa poata fi comparate cu raspunsurile substantelor aflate in amestecurile necunoscute si pentru a identifica componentii respectivi;

Se modifica faza mobila si se noteaza rezultatele simularilor acu aceasta;

In continuare, se alege de la amestecul 1 din lista de compusi necunoscuti aflati in amestec ( 1 - 9);

Se alege faza mobila (ex: apa) si conditiile experimentale de lucru;

Se ruleaza programul de simulare (click pe butonul Elute);

Se identifica componentii din amestecul 1, conform cromatogramei obtinute si listei de raspunsuri in functie de timp a componentilor cunoscuti, lista care a fost alcatuita anterior;

Se repeta succesiunea de pasi 2.1-2.8 pentru celelalte 8 amestecuri necunoscute, iar datele obtinute se trec intr-un tabel.

Rezultate cromatografice (exemplu de simulare)

Rezultate cromatografice pentru cromatografia de amestecuri

Interpretarea rezultatelor

Datele obtinute se trec in tabele similare cu cele prezentate mai sus. Se urmareste corectitudinea inregistrarilor in tabel cu ajutorul schematizarii din tabelul urmator:

Recapitularea notiunilor de cromatografie

Intrebari

Cum se obtine o cromatograma?

Cum se realizeaza cromatografia lichid-lichid si care este aparatura necesara pentru separarea cromatografica a unui amestec de substante?

Ce este rezolutia?

Ce se intelege prin factor de separare?

Enumerati cele mai importanti pasi care trebuie parcursi spre a obtine o cromatograma.