NUCLEOTIDE SI ACIZI NUCLEICI

NUCleotide si acizi nucleici

Teme abordate

1. Baze azotate, nucleozide, nucleotide - caracteristici structurale, functii biologice
2. Acizi nucleici: tipuri, roluri biologice
3. Nucleoproteine
4. Metode moderne de studiu al aciyilor nucleici

Baze azotate, nucleozide, nucleotide

Izolate initial de catre anatomistul F. Miescher (1868) din puroiul extirpat chirurgical, nucleinele, denumite ulterior nucleoproteine, sunt heteroproteine alcatuite dintr-o componenta proteica bazica si o grupa prostetica cu continut ridicat de acid fosforic, denumita acid nucleic. In functie de acidul continut, se deosebesc ribonucleoproteine, ce contin ARN (acid ribonucleic) si dezoxiribonucleoproteine ce contin ADN (acid dezoxiribonucleic).

Importanta deosebita a acizilor nucleici din nucleoproteine consta in rolul fundamental de inmagazinare a informatiei genetice si de transcrierea acesteia in secventa de aminoacizi din structura proteinelor.

Acizii nucleici sunt polinucleotide. Prin hidroliza acida, bazica sau enzimatica, acizii nucleici se degradeaza punand in libertate urmatoarele componente comune sau diferite:

a)      baze azotate purinice sau pirimidinice;

b)      pentoze: D-riboza sau D-dezoxiriboza;

c)      resturi de acid fosforic.

Baze azotate

Bazele azotate din acizii nucleici deriva de la heterociclurile de baza ale purinei (baze purinice) si pirimidinei (baze pirimidinice).

Au caracter bazic. Au proprietatea de a absorbi in UV la λ═260 nm (cea mai mare absorbtie o au bazele purinice), pe baza intensitatii absorbtiei putand identifica si doza spectrofotometric bazele azotate si compusii ce le contin.

Bazele purinice sunt adenina si guanina (denumirea acesteia derivand de la cuvantul guano ═ excrementele unor pasari), care se gasesc si in ADN si in ARN.

Bazele pirimidinice sunt citozina, uracilul si timina. Citozina se gaseste si in ADN si in ARN, uracilul in ARN, iar timina in ADN si baza minora in unele tipuri de ARN (tARN)

Baze minore. In afara de aceste baze azotate, considerate baze majore, in acizii nucleici se gasesc in proportie redusa aproximativ 30 de baze minore, intre care: pseudouracil, 5-metil-citozina, 5-hidroxi-uracil, 7-metil-guanina etc.

Nucleozide

Nucleozidele sunt N-glicozide ale bazelor azotate cu o pentoza: D-riboza sau      D-deoxiriboza, in forma β. Nucleozidele din acizii nucleici sunt: adenozina, guanozina, citidina, uridina in ARN, respectiv deoxiadenozina, deoxiguanozina, deoxicitidina si deoxitimidina (timidina) in ADN.

Structura unor nucleozide

Nucleozide libere. Pe langa nucleozidele ce intra in structura acizilor nucleici, unele ribonucleozide se gasesc si sub forma libera, de exemplu S-adenozil metionina, important donor de grupe metil pentru procesele de metilare ce se desfasoara in organism.

Nucleotide

Nucleotidele se formeaza prin legarea unui rest fosfat la grupa -OH din pozitia 3^' sau 5^' a pentozei. Datorita resturilor fosforice, nucleotidele au caracter acid.

Nucleotidele din ARN sunt: acid adenilic (acid adenozin 5^'-monofosforic, AMP), acid guanilic (acid guanozin 5^'-monofosforic, GMP), acid citidilic (acid citidin 5^'-monofosforic, CMP), acid uridilic (acid uridin 5^'-monofosforic, UMP).

Nucleotidele din ADN sunt: acid deoxiadenilic (acid deoxiadenozin 5^'-monofosforic, dAMP), acid deoxiguanilic (acid deoxiguanozin 5^'-monofosforic, dGMP), acid deoxicitidilic (acid deoxicitidin 5^'-monofosforic, dCMP), acidul timidilic (acid timidin 5^'-monofosforic, dTMP).

Structura unor nucleotide

Mononucleotidele indeplinesc si alte roluri biologice pe langa acela de a fi componente structurale ale acizilor nucleici.

a. Nucleotide ciclice. Prin legarea resturilor fosforice la doua grupe -OH in pozitiile 3^' si 5^' si deshidratarea acestora cu ciclizare rezulta nucleotide ciclice libere. Cele mai importante sunt: acidul 3^', 5^'- adenozin-monofosforic ciclic (3^', 5^' - AMP_c) si acidul 3^',5^' - guanozin-monofosforic ciclic (3^', 5^' - GMP_c), importanti mesageri secunzi ai hormonilor.

b. Intra in structura unor coenzime (coenzima A, FAD, NAD⁺),

c. Functioneaza ca si intermediari in metabolismul nucleotidelor purinice (IMP- acidul inozilic, ce contine ca baza azotata hipoxantina),

d. Participa la procese importante, de exemplu cele ce functioneaza ca donori de grupe -SO₃H in procesele biochimice de sulfatare: de exemplu acidul 3^'-fosfoadenozin-5^'-fosfosulfuric (PAPS).

e. Nucleozid polifosfatii sunt nucleotide rezultate prin atasarea a doua resturi fosfat (nucleozid difosfati), respectiv trei resturi fosfat (nucleozid trifosfati) la grupa -OH din pozitia 5^' a pentozei.

Nucleozid polifosfatii exista liberi indeplinind in celule functii biologice diferite:

a)      intermediari metabolici: inozin difosfat (IDP), inozin trifosfat (ITP);

b)      compusi bogati in energie (compusi macroergici): adenozin trifosfat (ATP), guanozin trifosfat (GTP), uridin trifosfat (UTP), citidin trifosfat (CTP);

Prin legarea mononucleotidelor rezulta oligonucleotide (care contin mai putin de 50 mononucleotide) sau polinucleotide.

Acizii nucleici

Acizii nucleici sunt polinucleotide in care mononucleotidele sunt unite prin legaturi fosfodiesterice intre grupa -OH din pozitia 3' a unei pentoze si grupa -OH din 5' a pentozei din mononucleotidul urmator. Legaturile 3'-5'-3'-5'- . inlantuie nucleotidele intr-o secventa liniara reprezentand "coloana vertebrala" a acizilor nucleici.

Au caracter acid si sunt legati de proteine bazice si, rareori, neutre.

Acizii nucleici se diferentiaza prin:

lungimea lantului;

pentoza continuta;

natura bazelor azotate si ordinea in care acestea se succed (Tabel 1).

Tabel 1 Diferente intre ADN si ARN

Structura acizilor nucleici

Odata cu cercetarile lui O.Avery, C.Mc Leod si M.Mc Carthy (1943), care au demonstrat ca ADN pur extras din pneumococii virulenti determina transformarea susei nevirulente in pneumococi virulenti, s-a stabilit ca ADN este molecula ereditatii, informatia genetica fiind inscrisa in secventa variabila a nucleotidelor din acizii nucleici. Dezvoltarea caracterelor morfologice si functionale ale unei celule se realizeaza dupa programul inscris in ADN.

Acizii nucleici prezinta o structura primara asemanatoare (vezi figura).

Acidul dezoxiribonucleic este o biomacromolecula rezultata prin condensarea deoxiribonucleotidelor. Folosind metoda difractiei razelor X, R.Franklin si M.Wilkins au aratat ca ADN produce un model de difractie ce caracterizeaza o elice.

Prin analiza cromatografica a ADN izolat de la mai multe specii, Chargraff a stabilit o relatie cantitativa intre bazele azotate, concentratiile nucleotidelor cu adenina si timina, precum si cele ale nucleotidelor cu guanina si citozina, fiind egale:

Pe baza datelor existente, J. Watson si F.Crick, in 1953, au postulat structura tridimensionala a ADN, modelul ADN dublu helix. Descoperirea structurii tridimensionale a ADN a fost un eveniment de rasunet in cercetarea stiintifica care a deschis drumul dezvoltarii cercetarilor de biochimie, biologie celulara, genetica.

Structura secundara a ADN - modelul ADN dublu helix

Caracteristicile modelului structurii tridimensionale a ADN:

Molecula de ADN are doua lanturi care se infasoara in directii opuse, antiparalel, in jurul unui ax imaginar. Modelul poate fi comparat cu o "scara in spirala" in care unitatile de deoxiriboza si fosfat sunt indreptate spre exterior si reprezinta "balustradele", iar bazele azotate spre interior, constituind " treptele", perpendiculare pe axul imaginar (vezi figura);

ADN are unitati cu dimensiuni identice: diametrul helixului - 20Ǻ; distanta intre bazele adiacente - 3,4 Ǻ; pasul elicei (unitatea de structura helicala) se repeta dupa aprox.10 resturi de nucleotide;

bazele din cele doua catene se unesc prin legaturi de hidrogen dupa o anumita regula de complementaritate;

Modelul propus de Watson si Crick furnizeaza elemente pentru explicarea capacitatii ADN de a functiona ca molecula ce stocheaza si transmite informatia inscrisa in secventa de baze, prin autoreplicarea semiconservativa a ADN sintetizandu-se doua catene ce pastreaza caracteristicile ADN parental.

ADN este o molecula flexibila, fiind posibila rotatia in jurul scheletului format din pentozele unite prin fosfat. Fluctuatiile termice pot determina indoirea, intinderea si desperecherea (melting) catenelor ceea ce permite aparitia unor structuri diferite de cea propusa de Watson si Crick, care mai este cunoscuta si sub numele de forma ADN-B.

Aceasta este forma cea mai stabila comparativ cu celelalte variante structurale descrise, formele ADN-A si ADN-Z (Tabel).

Tabel      Caracteristicile formelor structurale ale ADN

Se presupune ca forma Z intervine in reglarea expresiei unor gene sau in recombinarea genetica, in timp ce existenta formei A in celule nu este confirmata.

In structura ADN exista anumite secvente simetrice caracterizate prin ordinea inversa a nucleotidelor (inverted repeats) pe cele doua catene complementare (palindroame) sau pe aceeasi catena (secvente in oglinda).

Secvente particulare din ADN (dupa Nelson D.L. si Cox M.M., 2000)

Dimensiunea moleculei de ADN se exprima ca numar de perechi de baze continute (de exemplu, cromozomul de la E.coli are 4,72 x 10³ kpb).

Catenele ADN pot fi liniare sau circulare (bacterii, bacteriofagi).

Cromozomii singulari de la procariote sunt de fapt molecule de ADN circular, continand putine proteine. Cromozomii eucariotelor sunt reprezentati de molecule liniare de ADN care inconjoara un miez proteic format din patru tipuri diferite de histone: H1, H2A,      H3, H4, asociate intr-un octamer formand nucleozomi.

Replicarea ADN determina pregatirea celulelor pentru diviziune.

Intre doua diviziuni, celulele parcurg un ciclu celular constituit din doua faze: interfaza (cu perioadele G1, S, G2) si mitoza, diviziunea celulara. Multe celule intra intr-o perioada, G0, in care ies din G1, devin celule linistite care desfasoara activitate specifica. In cancer, celulele se divid haotic, ciclul celular fiind perturbat.

Transformarile neezimatice ale nucleotidelor. Mutatii. Bazele azotate din nucleotide si polinucleotide pot suferi diverse alterari structurale neezimatice:

Dezaminarea bazelor azotate, in special a citozinei. Resturile de uracil rezultate din dezaminarea acesteia sunt reparate prin excizie;

Hidroliza legaturii N-glicozidice din nucleotidele purinice si, mai rar din cele pirimidinice, mai ales pentru ADN;

Formarea dimerilor de timina sub actiunea radiatiilor UV si fragmentarea bazelor purinice sub actiunea radiatiilor ionizante (aproximativ 10% din mutatiile ADN);

Dezaminarea provocata de diverse noxe industriale (nitriti, nitrati, nitrozamine, bisulfiti);

Alchilarea guaninei (cu dimetilnitrozamina);

Degradarea ADN sub actiunea speciilor reactive ale oxigenului (radical superoxid, hidroxil, peroxid de hidrogen) este reprezentata de oxidari ale bazelor purinice, ruperea catenelor ADN (apare in stresul oxidativ, depasirea capacitatii organismului de a se opune actiunii acestor specii prin sistemele antioxidante enzimatice si neenzimatice de care dispune).

Desi se produc cu viteze reduse, acestea au efecte nedorite asupra materialului genetic al celulei conducand la aparitia mutatiilor. Celulele sunt dotate cu diferite sisteme de a repara eventualele mutatii. Perpetuarea acestor alterari este responsabila de dezvoltarea unor celule anormale (in diferitele forme de cancer), de viteza cu care organismul imbatraneste.

Acizii ribonucleici sunt biomacromolecule rezultate prin condensarea ribonucleotidelor si reprezinta materialul genetic al unor virusuri mici (ribovirusuri: gripal, virusul mozaicului tutunului, HIV, hepatita C), in celelalte organisme intervin in transmiterea informatiei genetice.

Utilizarea informatiei genetice

Acizii ribonucleici au un continut in baze azotate ce nu respecta relatia lui Chargraff, sunt, in general, monocatenari. La unele tipuri de ARN catena se poate plia fata de ea insasi, prezentand regiuni dublu catenare ce expulzeaza in exterior zonele monocatenare sub forma unui ac de par sau frunze de trifoi.

Cantitatea de ARN variaza de la o celula la alta si chiar in aceeasi celula, in functie de intensitatea proceselor de biosinteza proteica la un anumit moment.

Tipuri de ARN. Dupa rolul indeplinit in procesul de biosinteza proteica, se deosebesc mai multe tipuri de ARN.

ARNt (de transfer, solubil, ARNs) reprezinta 5-15% din ARN total. Sunt molecule mici, de aproximativ 90 nucleotide, care leaga specific fiecare din cei 20 de aminoacizi proteinogeni si ii transporta la locul sintezei proteice.

Indiferent de tipul de ARNt, capetele 5' si 3' sunt identice. La capatul 3' se leaga aminoacizii. ARNt poate fi reprezentat asemanator unei frunze de trifoi.

La capatul buclei inferioare se gaseste secventa anticodon, bratul DHU (care contine in cantitate mare dihidrouracil) este implicat in legarea aminoacil-ARNt-sintetazei, iar prin bratul TΨC (care are cantitate mare de timina, pseudouracil) se realizeaza legarea complexului aminoacil-ARNt la ribozomi.

ARNm (mesager, informational, ARNi) reprezinta 2-4% din ARN celular. Sunt molecule monocatenare, liniare, de lungime variabila ce se sintetizeaza in nucleu pe matrita ADN (prin transcriere), apoi iese in citoplasma unde va fi matrita pentru sinteza unui polipeptid cu o secventa specifica de aminoacizi (prin translatie). Este heterogen ca marime in functie de lungimea polipeptidului pe care il codifica. Are o viata foarte scurta, la bacterii de 2-3 minute, iar la eucariote de cateva ore, fiind degradat de ribonucleaze.

La procariote, ARNm contine informatia pentru sinteza unei singure proteine sau a mai multor polipeptide (frecvent trei lanturi) implicate in acelasi proces metabolic.

Structura tridimensionala a ARNt

ARNr (ARN ribozomal) este reprezentat de molecule flexibile, heterogene ca forma si marime, ce se clasifica in functie de constanta de sedimentare. Sunt continuti in ribozomi, particule ribonucleoproteice descrise de G.E. Palade, cu constante de sedimentare diferite: 70S la procariote, 80S la eucariote.

Ribozomii se pot disocia in doua subunitati de dimensiuni diferite:

la procariote: subunitatea mare 50S, subunitatea mica 30S;

la eucariote: subunitatea mare 60S, subunitatea mica 40S.

Subunitatile contin ARNr diferiti: 18S in subunitatea mica, 28S, 5S, 8S in subunitatea mare de la eucariote.

Ribozomii constituie sediul biosintezei proteice. H. Noller si colab. au dovedit prin studii recente participarea ARNr cu rol de catalizator in sinteza legaturilor peptidice, reactia catalizata de peptidil transferaza necesitand prezenta unor subunitati ribozomale 50S lipsite de proteine, denumite ribozime. Acest tip de ARN satisface cateva caracteristici ale enzimelor: are substrat specific, mareste viteza reactiei enzimatice si iese nemodificat din reactie.

Recent a fost caracterizat un ARN nuclear de dimensiuni reduse (snARN) care se gaseste mai ales in nucleul celulelor eucariote. Formeaza complexe stabile cu proteine specifice, denumite ribonucleoproteine nucleare mici. Au dimensiunea 10S, reprezinta intre 1-10% din ribozomi si au rol in prelucrarea ARN mesager matur exportat in citoplasma celulelor eucariote.

Importanta medicala a analogilor de sinteza ai bazelor azotate si nucleozidelor

Unele medicamente, datorita asemanarii structurale cu bazele azotate sau nucleozidele, isi bazeaza actiunea pe influentarea procesului di sinteza a acizilor nucleici.

Se cunosc baze de sinteza folosite ca medicamente antitiroidiene (tiouracil, 5-metil-tiouracil) sau ca antimetaboliti in tratamentul unor neoplasme de san, colon (5-fluor-uracil), leucemiei (6-mercapto-purina, 6-tio-guanina), gutei (alopurinol, analog structural al hipoxantinei, intermediar in metabolizarea bazelor purinice)

Unele nucleozide de sinteza au actiune antivirala sau antitumorala (azidotimidina (zidovudina), arabinozil citozina etc, fiind folosite in tratamentul infectiei cu HIV, al unor forme de cancer.

Datorita caracterului acid al acizilor nucleici, acestia interactioneaza in vivo cu proteine cu caracter bazic formand nucleoproteine. Interactiunea se realizeaza prin legaturi ionice intre grupele fosfat din acizii nucleici si grupele -NH₃⁺ ale aminoacizilor bazici din structura proteinelor.

Proteinele din structura nucleoproteidelor se numesc protamine si histone.

Protaminele se caracterizeaza prin urmatoarele:

a) sunt proteine cu masa moleculara mica ( Mr 5 kD);

b) contin 35-55% arginina, ceea ce le confera caracter bazic;

c) nu contin aminoacizi aromatici si cu sulf;

d) sunt legate de ADN din nucleu, raportul ADN/proteina fiind specific pentru diferite specii;

e) sunt rezistente la actiunea pepsinei, deoarece aceasta necesita aminoacizi aromatici pentru a-si exercita atacul.

Histonele sunt prezente la toate animalele, absente la bacterii si au urmatoarele caracteristici:

a) masa moleculara cuprinsa intre 8,4-22 kD;

b) caracter bazic, datorat unui continut crescut de lisina si arginina;

c) sunt solubile in acizi, nedializabile si hidrolizeaza sub actiunea pepsinei;

d) se gasesc in raport fix cu ADN nuclear (un mol histona la un segment de ADN de 25 perechi de baze azotate);

In nucleoproteine, proportia acizilor nucleici este diferita.