Actiunea imunomodulatoare a unor extracte vegetale obtinute din specii de Echinacea

Actiunea imunomodulatoare a unor extracte vegetale obtinute din specii de Echinacea

INTRODUCERE

Studiul efectelor administrarii unor substante chimioterapeutice la om si animale prezinta un interes deosebit la ora actuala, acum cand chimioterapia este utilizata frecvent in tratamentul diferitelor boli cum ar fi: cancerul, bolile autoimune, alergii, etc. Utilizarea citostaticelor in chimioterapia anticanceroasa manifesta de cele mai multe ori efecte toxice secundare provocand dereglarea functionalitatii metabolismului celular al tesuturilor si organelor sanatoase. O mare parte dintre aceste citostatice utilizate in chimioterapie induc de cele mai multe ori stari de imunosupresie pronuntata precum si efecte limfotoxice, caracterizate prin afectarea organelor hemato si limfopoietice (Ardelean A. Si colab., 2000; Yoshikuni si col, 1990; Milicevic si col., 1994; Pasca C. Si colab., 2000). Dereglarea sistemului imunoformator de catre citostatice este cu atat mai grava cu cat acest sistem menit sa franeze metastazarea precum si distrugerea eventualelor clone maligne ce pot apare la distanta in organism, este in imposibilitate de a-si exercita functiile. De aceea, restabilirea capacitatii de aparare a organismului, este una din problemele majore cu care se confrunta specialistii in timpul si dupa terapia citostatica.

Dintre citostaticele utilizate in practica medicala, ciclofosfamida este una dintre cele mai cunoscute si frecvent utilizata ca agent terapeutic in tratamentul bolilor maligne (chimioterapia antitumorala) dar si ca un agent imunosupresor puternic. Prevenirea complicatiilor survenite in cursul chimioterapiei antitumorale, reprezinta problema majora care limiteaza utilizarea acestui citostatic. Cunoasterea mecanismului de actiune al acestei substante a fost imperios necesara in vederea gasirii posibilitatilor de atenuare a efectelor nocive secundare. Literatura de specialitate ne ofera date semnificative referitoare la efectele secundare induse de administrarea acestui citostatic, subliniind faptul ca acestea constau in modificari biochimice, fiziologice precum si comportamentale la nivelul organismului. Studii biochimice efectuate pe animale de laborator au aratat alterari ale proceselor de biosinteza proteica celulara si dereglarea unor procese enzimatice implicate in aceste procese, precum si in mecanismele de transport celular si transmembranal al metabolitilor si ionilor (Chiricuta, 1979; Ehling si col. ; Ferment si col., 1988; Borsa si col., 1992, 1993). De asemenea, studii privind efectele administrarii ciclofosfamidei asupra sistemului endocrin si limfatic au fost mult studiate, iar o serie de cercetari au fost intreprinse si in scopul identificarii unor medicamente (principii) adjuvante, netoxice, homeoterapeutice si cu proprietati imunostimulatoare. Astfel, o serie de extracte polipeptidice de origine animala au fost mult si intens studiate pentru calitatile lor de stimulare a unor functii imunologice, in special o serie de extracte timice. Preparatele straine dar si romanesti cum ar fi: Leucotrofina, Timomodulina, Timolimfotropina, Timozina, Timosterina, au fost experimentate in decursul anilor cu rezultate apreciabile in refacerea sistemului endocrin si limfatic afectat de administrarea citostaticelor sau dupa iradierea totala sau partiala a organismului. Dar, metodele de preparare, extragere si purificare, precum si materia prima extrem de costisitoare au facut ca aceste preparate sa nu fie la indemana specialistilor si clinicienilor pentru a putea fi cercetate si aplicate in clinicile de specialitate. Imunomodulatoarele de origine bacteriana (ex. adjuvantii Freund) determina o imunostimulare foarte specifica, obtinand o crestere a productiei de anticorpi la un anumit tip de antigen. Utilizarea lor este insa limitata datorita efectelor secundare majore: reactii inflamatorii majore , granuloame cronice, abcese, necroze tisulare ulcerative, iar daca ajung in contact cu ochii determina iritatii oculare grave sau chiar orbire.

In ultimul timp o serie de produse naturale obtinute din plante medicinale traditionale au fost tot mai mult cercetate si investigate din punct de vedere chimic si biologic pentru efectele lor de stimulare a unor functii ale organismului. In acest sens, o categorie aparte de astfel de extracte obtinute din plante medicinale o ocupa cele cu calitati imunomodulatoare, antiinflamatoare si care in medicina traditionala a unor tari reprezinta concepte de baza in tehnicile si metodologiile terapeutice ale unor boli (medicina traditionala indiana, chineza, japoneza, etc.).

Investigatiile privind acesti compusi naturali, ca potentiali factori ai programelor de descoperire de noi medicamente, impune desigur studii ample si complexe, necesita introducerea de noi biotehnici eficiente si de mare precizie in urmarirea unor fenomene intime celulare, in aprecierea activitatii unor enzime, transportul prin membrane, o serie de fenomene legate de receptori, etc.

Cercetarile experimentale efectuate cu extracte vegetale sau principii active izolate din plante au demonstrat ca ele pot influenta raspunsul imunitar pe mai multe cai (Hofmann, 1997):

-stimuleaza non-specific sistemul imunitar prin activarea complementului seric si stimularea fagocitozei polimorfonuclearelor neutrofile si a macrofagelor (ex. Echinacea spp. Calendula officinalis, Thuja occidentalis etc.);

-stimuleaza specific sistemul imunitar, implicand atat reactiile imunitare celulare cat si cele umorale, raspuns imun care culmineaza cu productia de anticorpi (ex. Astragalus membraceous, Ganoderma lucidum etc.);

-influenteaza indirect raspunsul imun prin modulare hormonala (via suprarenale)

Proprietatile imunostimulatoare prezentate mai sus sunt datorate principiilor active aflate in compozitia plantelor. De altfel, efectul "amfifil", imunostimulator sau imunosupresiv este dependent de concentratia substantei active in solutie, imunostimularea fiind determinata in multe cazuri de concentratii extrem de mici de principiu activ, deseori de domeniul pg, fg, sau ag/ml. (Ciulei, 1993)

Mai mult, in numeroase cazuri, obtinerea unor efecte imunostimulatoare ale extractelor vegetale sau ale principiilor active izolate prin experimentare "in vitro" , nu au fost confirmate in experimentele efectuate pe animale, in timp ce substante care si-au dovedit efectul in profilaxia sau tratamentul unor maladii provocate la animale, deseori sunt ineficiente in experimentul clinic, boala avand un caracter oarecum artificial, provocat ("de import"), organismul raspunzand altfel decat la o boala spontana, sau nu pot fi aplicate la om, fiind grevate de grave efecte adverse. (Miller, 1998)

Literatura de specialitate este bogata in studii experimentale privind actiunile terapeutice ale extractelor si preparatelor pe baza de Echinacea, demonstrand ca au efecte antiinflamatorii, cicatrizante si de stimulare a capacitatii de aparare a organismului. In acest sens, cercetarile intreprinse pana in prezent au evidentiat faptul ca extractele sau principiile bioactive obtinute din specii de Echinacea sunt capabile sa activeze procesul de fagocitoza, sa induca o stimulare fibroblastica. Cu toate acestea, nu s-a gasit inca formula de tratament sau doza ideala pentru preparatele de Echinacea. In plus, studiile efectuate pana in prezent sunt de departe insuficiente pentru a da o explicatie adecvata, avand in vedere complexitatea factorilor implicati in realizarea raspunsului imun .

In plus, datele bibliografice de specialitate obtinute pana in prezent, cuprind putine   cercetari de microscopie optica si electronica referitoare la modificarile structurale si ultrastructurale care apar la nivelul unor organe, in special la nivelul organelor implicate in raspunsul imunitar, ca urmare a administrarii extractelor de Echinacea. De aceea studiile noastre s-au bazat in primul rand pe astfel de investigatii.

2. SCOPUL CERCETARILOR EXPERIMENTALE

Cercetarile experimentale cuprinse in prezentul proiect au constat in urmarirea efectelor induse de administrarea a doua extracte vegetale obtinute din specii de Echinacea (Echinacea purpurea si Echinacea pallida) asupra structurii si functiei unor organe ale sobolanilor Wistar, in doua conditii experimentale: in conditii normale fara interventia prealabila a unor agenti experimentali imunosupresori si dupa administrarea de ciclofosfamida. Am ales ciclofosfamida, deoarece este cunoscuta in literatura de specialitate prin efectele secundare nocive, in special prin cel imunosupresor (Ardelean A. si colab., 2000, Craciun C. si colab., 1994, 1999, Pasca C. si colab., 2000). Prevenirea complicatiilor survenite in cursul chimioterapiei antitumorale, reprezinta problema majora care limiteaza utilizarea acestui citostatic. Daca in cazul transplantului de organe imunosupresia este benefica, in cazul bolnavilor de cancer aceasta reprezinta o complicatie extrem de grava in primul rand prin faptul ca se sensibilizeaza organismul la diferite infectii dar si prin faptul ca o imunitate deprimata grabeste evolutia cancerului si aparitia metastazelor. De aceea, restabilirea capacitatii de aparare a organismului, este una din problemele majore cu care se confrunta specialistii in timpul si dupa terapia citostatica.

Pentru a ne putea realiza scopul propus am urmarit efectele administrarii celor doua extracte vegetale asupra unor parametri structurali, ultrastructurali si fiziologico-biochimici din maduva hematogena, timus, splina, suprarenale si ficat la sobolani Wistar, in cele doua conditii experimentale : normale si dupa administrarea de ciclofosfamida. Studiile s-au axat in principal pe investigatii structurale si ultrastructurale ale organelor mentionate anterior, deoarece literatura de specialitate este saraca in astfel de cercetari.

Am ales sa investigam in primul rand maduva hematogena, timusul si splina, deoarece efectele secundare nocive ale ciclofosfamidei sunt indreptate cu precadere asupra tesuturilor cu diviziuni celulare intense, in particular cel germinativ hematopoietic (Ardelean A. si colab, 1999, 2000, Pasca C. si colab., 2000)). Aceste perturbari sunt strans corelate cu instalarea unor grave alterari structurale si functionale la nivelul structurilor limfopoietice centrale si periferice (Craciun C. si colab., 1997, 1999). Investigatiile structurale si ultrastructurale realizate pe organele mentionate mai sus, le-am realizat cu scopul de a studia comparativ eventualele proprietati imunostimulatoare exercitate de cele doua extracte vegetale testate asupra structurii si functiilor principalelor organe ale sistemului imunitar normal, respectiv depresat experimental prin administrarea de ciclofosfamida.

Investigatiile noastre au cuprins si glandele suprarenale ale sobolanilor Wistar, in cele doua conditii experimentale, datorita legaturilor functionale stranse intre acest organ endocrin si organele sistemului imun (Giurgea R., 1994). In acest sens, este cunoscut din literatura de specialitate faptul ca sistemul endocrin si cel imun actioneaza asupra proceselor imunobiologice in special pe cale hormonilor glucocorticoizi, care sunt anti-inflamatori si imunosupresori atat in conditii fiziologice cat si farmacologice. Efectul imunosupresor al corticoterapiei este rezultatul afectarii tesutului limfatic, care este considerat ca fiind nespecific. Cortisolul, la om si sobolan determina deprimarea imunitatii celulare si umorale, dar si inhibarea raspunsului imun primar si in mica masura a celui secundar. In plus, relatia organe limfatice-suprarenala a putut fi dovedita fie prin suprarenalectomie, fie prin eliminarea structurilor limfatice. Suprarenalectomia determina o hipertrofie si hiperplazie a timusului, iar administrarea de glucocorticoizi altereaza structura timusului si a bursei lui Fabricius si involutia acestora.

Studiile noastre structurale si ultrastructurale au inclus si ficatul sobolanilor Wistar, investigat in cele doua conditii experimentale, cu scopul de a surprinde eventualele proprietati stimulatoare ale extractelor vegetale asupra ficatului normal sau hepatoprotectoare in urma administrarii de ciclofosfamida. In acest sens, datele din literatura de specialitate ne releva faptul ca ciclofosfamida prezinta o forma de transport inactiva, metabolizarea si implicit activarea ei realizandu-se predominant la nivel hepatic sub actiunea enzimelor microzomale, eliberand compusi activi in sens chimic si biologic (Craciun C. si colab., 1994). Deducem ca efectul acestui citostatic este strict dependent de starea functionala a ficatului, perturbarea acesteia contribuind in mod semnificativ la diminuarea actiunii antitumorale a ciclofosfamidei.

In concluzie, studiile noastre experimentale au fost realizate in speranta descifrarii mecanismelor intime de actiune ale extractelor vegetale de Echinacea purpurea si Echinacea pallida asupra structurii si functiilor principalelor organe ale sistemului endocrino-limfatic atat in conditii normale, cat si in conditii de imunosupresie indusa experimental. Am considerat ca in urma investigatiilor noastre experimentale, cele doua extracte vegetale ar putea fi utilizate ca potentiali agenti imunostimulatori ai unor functii din unele organe ale sistemului endocrino-limfatic dereglat de administrarea unor citostatice cu larga utilizare in practica chimioterapiei antitumorale.

3. OBIECTIVELE GRANTULUI

MATERIALE SI METODE DE EXPERIMENTARE

In experimentul preclinic au fost utilizati sobolani albi din rasa Wistar crescuti in conditii standard de crescatorie, de acelasi sex si aproximativ aceeasi greutate, in numar relevant/lot pentru a putea elimina valorile aberante si pentru a putea interpreta statistic rezultatele.

Indeplinirea acestor conditii experimentale a fost absolut necesara obtinerii unor rezultate reale, influentate doar de extractele de testat.

Extractele alcoolice de Echinacea purpurea si Echinacea pallida, obtinute de la Catedra de Botanica farmaceutica a Facultatii de Farmacie din Cluj-Napoca, au fost diluate cu apa distilata la o concentratie corespunzatoare administrarii a 5 g/kg corp/zi. Administrarea extractelor s-a realizat prin gavaj intragastric pe o perioada de 10 zile.

Loturile de animale au fost organizate dupa cum urmeaza:

1. Lot de animale martor (M)
2. Lot de animale caruia i s-a administrat extract alcoolic obtinut din E.pallida prin gavaj intragastric timp de 10 zile (5g/kg corp/zi)
3. Lot de animale caruia i s-a administrat extract alcoolic obtinut din E.purpurea prin gavaj intragastric timp de 10 zile (5g/kg corp/zi)
4. Lot tratat cu Ciclofosfamida (40 mg/kg corp/zi) administrata prin injectii intraperitoneale timp de 3 zile.
5. Lot de animale tratat cu Ciclofosfamida timp de 3 zile, dupa care a fost tratat cu extract de E.pallida (5g/kg corp/zi) timp de 10 zile.
6. Lot de animale tratat cu Ciclofosfamida timp de 3 zile, dupa care a fost tratat cu extract de E.purpurea (5g/kg corp/zi) timp de 10 zile.

Sacrificarea animalelor s-a facut dupa terminarea tratamentului. Animalele au fost inanitiate 10 ore inainte de sacrificare, iar sacrificarea a fost facuta prin dislocare cervicala.

Pentru determinarile biochimice si ultramicroscopice s-au recoltat urmatoarele: suprarenale, timus si splina .

Determinarile enzimatice s-au facut din omogenat de tesuturi obtinut in sucroza 0,32 M, utilizand un omogenizator Potter cu pistil de sticla.

S-au realizat urmatoarele determinari:; greutatea relativa si absoluta a organelor (timus, splina, suprarenala); proteine totale colesterolul din suprarenale; Vitamina C din suprarenale; Fosfataza alcalina - din ser si omogenat de tesut: splina si timus ; Fosfataza acida-din omogenat de tesut : splina si timus; Gamaglutamiltranspeptidaza (g GT) - din omogenat de tesut ; Butilcolinesteraza - din omogenat tisular ;

Probele de maduva osoasa, timus, splina, suprarenale au fost prelucrate conform tehnicii de microscopie optica si colorate cu hematoxilina-eozina.

Probele de timus, splina, suprarenale au fost prelucrate conform tehnicii de microscopie electronica.

Rezultatele obtinute in urma testelor biochimice au fost prelucrate statistic prin metoda Chauvenet, pentru eliminarea datelor aberante, iar pentru stabilirea semnificatiei statistice, a fost utilizat testul "t" al lui Student.

In experimentarea clinica am investigat actiunea a doua extracte vegetale de Echinacea asupra sistemului imunitar depresat al pacientilor cu hepatita alcoolica cronica. Pacientii au fost organizati in doua grupuri experimentale (n 10): un lot placebo si un lot tratat timp de 10 zile cu capsule de 0,42g de Echinacea pallida (3x1 zi) cu un continut de 10 mg de polizaharide. S-a recoltat sange la inceperea si la finalul tratamentului urmarindu-se evolutia unor parametri hematologici, biochimici, imunologici, paralel cu evolutia clinica a bolnavilor.

REZULTATE SI DISCUTII

Pentru inceput am investigat efectul a doua extracte de Echinacea (Echinacea pallida si Echinacea purpurea) cunoscute ca plante medicinale cu proprietati imunomodulatoare, asupra unor indici biochimici si morfologici in unele organe implicate in reactivitatea imuna (maduva hematogena, timus, splina si suprarenala) la sobolani Wistar, in conditii normale, fara a interfera actiunea extractelor de testat cu a altor substante (de exemplu agenti imunosupresori) . Alaturi de aceste organe am investigat si ficatul, in vederea largirii sferei de cunoastere asupra modului de actiune a extractelor vegetale la nivelul hepatocitului, precum si a elucidarii mecanismelor sale de actiune la nivel celular si subcelular in conditii normale.

Analiza structurala a maduvei hematogene provenite de la cele doua loturi tratate cu extracte de Echinacea, a evidentiat densitatea celulara mare si polimorfismul accentuat, uneori mai evidente decat in cazul martorului. Intre cele doua loturi nu s-au inregistrat diferente notabile. Aceste constatari sugereaza faptul ca populatiile celulare ale maduvei hematogene se afla in plin proces de proliferare, diferentiere si maturare. Uneori hematopoieza se desfasoara la un nivel mai ridicat, comparativ cu martorul.

Administrarea celor doua extracte la sobolanii normali Wistar, nu a determinat la nivelul timusului modificari structurale semnificative, aspectul timusului fiind comparabil cu cel al animalelor lotului martor, cu corticala dens populata cu timocite, multe aflandu-se in diviziune mitotica. Raportul corticala-medulara este normal de 3:1. Analiza electronomicroscopica a timusului sobolanilor din cele doua loturi tratate cu extracte vegetale, completeaza informatiile structurale, indicandu-ne faptul ca cele doua extracte de Echinacea s-au dovedit a avea un efect stimulator asupra procesului de proliferare celulara de la nivelul corticalei lobulilor timici. Afirmatia este sustinuta in primul rand de existenta unui numar mare de celule aflate in diviziune mitotica, numarul acestora fiind mai mare decat la lotul martor.

Determinarile enzimatice efectuate din omogenate de timus, cum ar fi: fosfataza acida (enzima marker lizozomala si implicata in fenomenele de liza celulara), GGT (enzima marker de membrana celulara, implicata in metabolismul aminoacizilor, in special in sinteza glutationului), BCE (enzima implicata in sinteza si hidroliza esterilor colinici dar si in mecanismele defensive celulare) nu sufera modificari semnificative dupa administrarea celor doua extracte. Putem afirma ca administrarea lor a determinat un efect de potentare a activitatii acestor enzime, valorile activitatii lor fiind sub nivelul celor inregistrate la martor. Mentionam ca aceste enzime sunt foarte vulnerabile la actiunea unor factori externi, xenobiotici, toxici iar activitatile lor sunt exagerat de crescute in astfel de cazuri.

Studiile structurale efectuate la nivelul splinei sobolanilor Wistar au evidentiat actiunile stimulatoare ale celor doua extracte testate la nivel splenic , proprietati manifestate prin hiperplazia foliculilor splenici si a tecilor limfoide perivasculare, cat si o inmultire vadita a numarului limfocitelor mici la nivelul pulpei rosii. Desi frecventa foliculilor cu centrii germinativi este mai mare in splina animalelor tratate cu extracte vegetale, structura acestora precum si indicele mitotic nu pare a fi cu nimic deosebit comparativ cu animalele lotului martor. Aceste rezultate nu sunt surprinzatoare tinand seama de faptul ca potrivit cercetarilor efectuate la majoritatea mamiferelor, celulele centrilor germinativi ai foliculilor splenici se caracterizeaza prin cele mai scurte intervale de timp ale perioadei S necesara pregatiri pentru diviziune. Actiunea este identica pentru ambele extracte testate. Aspectele de hipertrofie si hiperplazie a pulpei albe inregistrate la examenul microscopic obisnuit, apar si mai evidente in studiul electronomicroscopic, rezultate care explica cresterea semnificativa a greutatii organului. Analiza ultrastructurala a splinei loturilor tratate, ne dovedeste o sporire a densitatii celulare in toate zonele splenice pe seama populatiei limfocitare, comparativ cu aspectele inregistrate la martor. In plus, pe toate sectiunile electronomicroscopice, se evidentiaza predominanta limfoblastelor cu nuclei mari eucromatici, nucleoli evidenti si citoplasma bogata in organite. In cadrul populatiei limfocitare, se remarca prezenta mai frecventa a limfocitelor ce prezinta caracteristicile ultrastructurale ale liniei limfocitare B si chiar a plasmocitelor, identificandu-se si o frecventa sporita a mitozelor acestui tip limfocitar la loturile tratate cu extracte vegetale, comparativ cu martorul. Aceste constatari ne sugereaza faptul ca a avut loc sub actiunea extractelor vegetale o stimulare a raspunsului imun la nivel splenic, in special a celui umoral.

Activitatea unor enzime (fosfataza acida, BCE) nu se modifica, acelasi efect de potentare fiind observat si la nivelul tesutului splenic ca si in cazul timusului.

Analiza structurala si utrastructurala efectuata la nivel hepatic, a evidentiat faptul ca cele doua extracte de Echinacea nu sunt hepatotoxice, ci din contra in hepatocitele provenite din loturile tratate se observa o oarecare intensificare a activitatilor metabolice. Aceste constari sunt mai evidente in hepatocitele centrolobulare, la nivelul carora se observa nucleoli ceva mai dilatati decat la lotul martor. Alipirea lor de membrana nucleara sugereaza o intensa activitate de transfer (probabil ARNr) din nucleu in citoplasma, asa cum au sugerat mai multi autori care au aratat ca in urma stimularii activitatii fiziologice a organismului, are loc o crestere a sintezei de ARNr si un intens proces de transfer nucleu-citoplasma. In toate hepatocitele se remarca o usoara crestere a cantitatii de mitocondrii si a reticulului endoplasmic rugos, ceea ce ne indica o stimulare a activitatii sintezei proteice sub actiunea extractelor testate. Imaginile electronomicroscopice surprind relativ putine picaturi lipidice, dispuse cu predilectie la periferia hepatocitelor spre polul lor vascular. Acestea nu se acumuleaza nici la nivelul celulelor depozitare de lipide Ito. Aceste constatari sugereaza faptul ca, sub actiunea extractelor de Echinacea, are loc o sinteza activa de lipide, iar, pe de alta parte, ca aceste lipide, nu se acumuleaza in celule, ele fiind vehiculate spre spatiile sinusoidale, pentru transportul lor.

Studiile structurale si ultrastructurale efectuate la nivelul glandelor suprarenale indica faptul ca administrarea celor doua extracte nu determina o reactie semnificativa a glandelor suprarenale la administrarea celor doua extracte. O usoara hipertrofie a glandei, dar nesemnificativa statistic, a fost inregistrata dupa administrarea extractelor la ambele loturi. Nu s-au observat modificari ale unor parametri fiziologici suprarenalieni. Analiza ultrastructurala a suprarenalelor celor doua loturi tratate cu extracte de Echinacea a indicat totusi o stimulare usoara a activitatii metabolice a zonei fasciculate din corticosuprarenale, argumentata prin numeroase mitocondrii cu criste tubulare, precum si prin prezenta reticulului endoplasmatic rugos bine reprezentat.

Determinarea continutului de vitamina C si colesterol, substante implicate in sinteza hormonilor corticosteroizi, eliberati in cantitati crescute in cazurile de stres indus prin administrarea diferitelor toxice in organism, nu sunt modificate fata de normal.

Analiza structural-functionala a unor organe ale sobolanilor Wistar carora li s-au administrat extracte de Echinacea timp de 10 zile, a demonstrat ca aceste extracte vegetale sunt lipsite de toxicitate si nu induc efecte secundare nedorite la nivel endocrino-limfatic sau hepatic, ci din contra exercita o oarecare actiune stimulatoare la nivelul organelor studiate in comparatie cu lotul martor .

In cercetarile efectuate in cel de-al doilea experiment preclinic , am investigat efectul imunostimulator al extractelor de Echinacea (Echinacea pallida si Echinacea purpurea) asupra unor indici biochimici si morfologici in unele organe implicate in reactivitatea imuna la sobolani Wistar, dupa inducere de imunosupresie experimental, prin administrare de ciclofosfamida. In plus, avand in vedere metabolizarea hepatica a ciclofosfamidei, am urmarit in hepatocite atat modificarile celulare si subcelulare induse de ciclofosfamida, cat si tabloul structural si ultrastructural al hepatocitelor la care terapia cu ciclofosfamida a fost urmata de administrarea extractelor de Echinacea .

Tratamentul cu Ciclofosfamida (40 mg/kg/zi) administrata sobolanilor prin injectii i.p. pe o perioada de trei zile consecutiv, a determinat o alterare structurala si morfologica a organelor studiate, precum si dereglarea unor parametri biochimici la aceste organe.

Rezultatele obtinute ne releva faptul ca citostaticul a actionat brutal asupra tuturor linilor celulare de la nivelul maduvei hematogene, stopand proliferarea si diferentierea celulelor angajate atat in granulocitopoeza cat si in monocitopoeza, limfocitopoeza si trombocitopoeza. Aspectele sesizate de noi scot in evidenta faptul ca populatiile celulare ale maduvei osoase hematogene aflate in plin proces de proliferare, diferentiere si maturare, sunt foarte sensibile la actiunea ciclofosfamidei. Efectul citostaticului este foarte rapid la acest nivel, asa incat la 24 ore de la administrarea citostaticului functia hematoformatoare a maduvei hematogene este aproape anulata. In acest context, aprovizionarea organelor limfoide centrale si periferice cu celule efectoare ale sistemului imun, este practic aproape intrerupta. Acest lucru va avea un efect negativ deosebit asupra eficientei sistemului imun, care, privat de aportul de efectori celulari, este practic in imposibilitate de a asigura apararea organismului. Astfel, acesta devine extrem de vulnerabil din acest punct de vedere, cel putin pentru un anumit interval de timp (pana se va relua aprovizionarea cu celule efectoare). Modificarile impresionante aparute rapid la nivelul maduvei osoase hematogene dupa administrare de ciclofosfamida au insa un caracter reversibil, astfel incat la 10 zile de la tratamentul cu citostatice, activitatea hematopoietica este reluata in totalitate. Problema cea mai mare este pe parcursul perioadei in care aprovizionarea cu celule ale sistemului imun este intrerupta, asa incat organismul este practic descoperit din punct de vedere imunologic si o eventuala confruntare cu agentii patogeni in aceasta perioada poate duce la procese patologice deosebit de grave, chiar fatale.

Demn de remarcat este faptul ca extractele vegetale utilizate au avut un efect stimulator asupra hematopoiezei, asa incat la loturile care au primit astfel de preparate hematopoieza se deruleaza la 10 zile dupa adminstrarea citostaticului, la un nivel superior martorului. Acest lucru este foarte important deoarece , prin reducerea drastica a hematopoeizei, s-a creat practic un deficit celular deosebit in reaprovizionarea organismului cu celule efectoare ale sistemului imun. Reluarea functionalitatii maduvei hematogene intr-un timp cat mai scurt posibil, reduce practic perioada in care organismul este descoperit din punct de vedere imunologic.

Mielodepresia indusa de administrarea ciclofosfamidei este strans corelata cu instalarea unor grave perturbari structurale si functionale la nivelul structurilor limfopoietice centrale si periferice, cum sunt timusul si splina. Numarul de celule afectate este destul de mare la nivelul acestor organe, inregistrandu-se o severa depopulare atat la nivelul timusului cat si al splinei. Sensibilitatea limfocitelor pare sa fie dependenta de gradul de maturare al acestora. Astfel, cel mai rapid sunt alterate celulele tinere (limfoblastele) care se gasesc in numar mare in corticala lobulilor timici si la nivelul foliculilor splenici. Aceasta ar fi dupa parerea noastra, explicatia reducerii drastice a numarului de celule din zonele mai sus amintite intr-o perioada asa de scurta de timp.

Timusul este un organ grav afectat de adminstatarea citostaticului, la 24 de ore dupa administrarea ultimei doze, inregistrandu-se o depopulare masiva a corticalei, incat ea apare mai rarefiata decat medulara, dand aspectul cunoscut sub numele de "lobuli inversati" . Reducerea dimensiunilor corticalei si a densitatii timocitelor de la acest nivel, apare ca o consecinta a unui proces de depletie celulara rapida, iar aparitia de zone de timocitoliza demonstreaza ca un numar mare de timocite sunt lizate pe loc la nivelul corticalei. De asemenea, celulele in diviziune lipsesc din imaginile histologice, ceea ce demonstreaza ca citostaticul a stopat procesul de proliferare timocitara ce se deruleaza la nivel ridicat in cazul lotului martor. Depletia timocitara, timocitoliza si stoparea diviziunilor explica aspectul rarefiat si pe alocuri chiar fragmentat al corticalei lobulilor timici. Cercetarile electronomicroscopice ne evidentiaza faptul ca timusul este un organ extrem de afectat la 24 de ore dupa administrarea ultimei doze de ciclofosfamida, procesele degenerative si alterative evidentiate prin studii structurale, fiind confirmate de imaginile ultrastructurale. Depopularea corticalei timice, observata pe imaginile histologice este explicata prin cercetarile ultrastructurale, majoritatea timocitelor corticalei prezentand semne de alterare mai discrete sau mai pronuntate. Astfel, tendinta de condensare a cromatinei in zona periferica a nucleului timocitelor, pana la uniformizarea acesteia, duce la distrugerea si moartea acestor celule. De asemenea, modificari pronuntate au fost constatate si la nivelul citoplasmei timocitelor, care apare vacuolizata si cu aspect de edem. Mitocondriile timocitelor devin partial sau total vacuolizate, lipsite de criste sau matrice mitocondriala. Distrugerea unui numar mare de timocite, dublata de stoparea diviziunilor, are drept consecinta o reducere drastica a numarului de timocite care apar in multe zone distantate, cu spatii mari intre ele, zone care sunt ocupate de edem cu acumulare de detritusuri celulare rezultate in urma alterarii timocitelor. Reducerea drastica a numarului de timocite va crea cel putin pentru o perioada de timp, o situatie extrem de dezavantajoasa din punct de vedere al proceselor de supraveghere si aparare la care participa limfocitele T. De asemenea, cercetarile electronomicroscopice au evidentiat o proliferare de colagen la nivelul medularei timice, care duce la deformarea timocitelor, incorsetarea lor si in final la moartea acestora. Ca urmare, apar multe spatii goale, lipsite de celule.

La 10 zile de la administrarea ultimei doze de ciclofosfamida, in timusul animalelor tratate numai cu ciclofosfamida, procesele alterative, desi prezente inca, se deruleaza la un nivel mult mai redus, ceea ce inseamna ca efectul citostaticului este inca prezent, dar a diminuat foarte mult in intensitate. Reducerea efectului citostaticului creeaza premisele reluarii activitatii de proliferare celulara specifice corticalei timice. Aspectele sunt sugerate de prezenta mitozelor si refacerea intr-o oarecare masura a populatiei de timocite, desi numeric acestea sunt mult sub nivelul martorului.

Administrarea extractelor de Echinacea pe o perioada de 10 zile ne-a demonstrat un efect de restabilire aproape completa a structurilor timice, cu cele doua zone corticala si medulara bine individualizate, raportul corticala/medulara fiind de 3:1. Popularea corticalei cu limfocite desi nu atinge nivelul inregistrat la martor, prezinta un aspect normal, iar numarul mitozelor din corticala este foarte mare, sugerandu-ne un efect clar de stimulare a acestor procese in timus. Ambele extracte au avut un efect de stimulare a mitozelor in timus, parca mai evidente la Echinacea pallida. Greutatea timusului nu este restabilita in totalitate, iar activitatea unor enzime din timus este reluata si restabilita la aceste loturi.

Studiile histologice efectuate la cele doua loturi tratate consecutiv cu ciclofosfamida si extracte vegetale, au fost confirmate de cele ultrastructurale, remarcandu-se faptul ca procesele de refacere se deruleaza la un nivel semnificativ mai crescut, numarul de timocite si densitatea celulara fiind net superioara, comparativ cu lotul tratat numai cu ciclofosfamida si foarte apropiate de cele ale lotului martor, in special la lotul tratat cu extract de Echinacea pallida. Acest fapt este foarte benefic pentru organismul care a fost supus terapiei cu ciclofosfamida, intrucat se scurteaza semnificativ perioada necesara refacerii structurale si functionale a timusului, cu implicatii directe asupra posibilitatilor de aparare fata de eventualii agresori cu care organismul ar putea sa se confrunte in perioada cat este supus terapiei cu citostatice.

Activitatea unor enzime din timus, cum ar fi fosfataza acida si GGT a fost in continuare scazuta si dupa 10 zile de la administrarea ciclofosfamidei, dar dupa administrarea extractelor vegetale activitatea enzimatica este restabilita complet, valorile lor depasind pe cele inregistrate la lotul martor ceea ce demonstreaza reluarea proceselor celulare in timus.

Citostaticul actioneaza energic si asupra populatiilor de limfocite din splina, atat asupra celor din pulpa alba cat si a celor din pulpa rosie. Astfel, la nivelul foliculilor splenici nu se mai constata prezenta de centru germinativ si un numar mare de limfocite din structura lor se afla in diferite stadii de necrobioza, desi dimensiunile acestora sunt apropiate de martor. Aceste constatari ne indica faptul ca actiunea citostaticului asupra populatiei limfocitare din splina este ceva mai lenta in comparatie cu situatia constatata la nivelul timusului in acest moment al experimentului. Acest lucru este explicabil daca tinem cont de rata mare de diviziune a timocitelor din corticala timusului si deci de existenta unui numar mult mai mare de limfoblasti la nivelul timusului comparativ cu splina. Celulele afectate de ciclofosfamida sunt surprinse si pe imaginile ultrastructurale in stadii diferite de necrobioza, pornindu-se de la o usoara condensare a nucleilor si mergandu-se pana la modificari morfologice celulare profunde, fragmentari ale nucleilor, pediculari si fragmentari ale citoplasmei cu acumularea unei cantitati mai mici sau mai mari de material amorf in spatiile edemetiate.

Investigatiile histologice coroborate cu celule ultrastructurale ne ofera informatii care ne permit sa apreciem ca ciclofosfamida determina distrugerea celulelor limfoide provocand necroza sau apoptoza acestora.

La 10 zile de la administrarea ultimei doze de ciclofosfamida, asistam la un inceput de refacere a structurii foliculilor splenici. Zona centro-foliculara incepe sa se contureze, insa foliculii sunt rari si de dimensiuni reduse. Se constata prezenta pe toata suprafata de sectiune, a numeroase megacariocite cu un polimorfism accentuat, ceea ce sugereaza declansarea la nivelul organului a unui proces de hematopoeza compensatorie. Aceasta afirmatie este sustinuta si de prezenta a numeroase granulocite, atat neutrofile cat si eozinofile, dispuse sub forma de plaje si avand structura polimorfa, ceea ce sugereaza ca ele se afla in diferite stadii evolutive.

Analiza structurala a splinei celor doua loturi tratate consecutiv cu ciclofosfamida si extracte de Echinacea , ne-a dovedit faptul ca extractele vegetale testate sunt capabile sa stimuleze procesele de refacere celulara. La nivelul acestui organ procesele de refacere sunt foarte avansate. Foliculii splenici au zona germinativa foarte dezvoltata (tot foliculul este reprezentat doar de zona germinativa) fara coroane limfocitare la periferie. Desi numarul de megacariocite depaseste valorile inregistrate la martor, totusi acestea sunt mai putine fata de lotul tratat numai cu ciclofosfamida. Nu este restabilita homeostazia enzimatica dupa administrarea celor doua extracte la nivelul martorului. Modificarile morfologice observate, ne sugereaza ca maduva osoasa incepe sa faca fata nevoilor organismului in timp ce functia hematopoietica compensatorie de la nivelul splinei se diminueaza treptat pana la stopare la animalele tratate cu extracte de Echinacea. Studiul electronomicroscopic ale splinei celor doua loturi tratate cu extracte de Echinacea ne sugereaza faptul ca sub actiunea extractelor vegetale alterarile ultrastructurale aparute sub influenta ciclofosfamidei sunt in mare parte anulate, fapt confirmat de marea majoritate a microfotografiilor electronice. Atat distributia, cat si ultrastructura celulelor reticulare, a fibrocitelor si a diferitelor categorii de limfocite apar in splina loturilor animalelor tratate consecutiv cu ciclofosfamida si extracte vegetale, apropiate de martor.

Ficatul sobolanilor tratati cu ciclofosfamida nu a prezentat modificari semnificative, observabile prin microscopie optica, la 24 ore dupa ultima administrare a citostaticului. In schimb, la 10 zile au putut fi sesizate unele aspecte care par sa aiba legatura cu administrarea citostaticului. Aceste modificari constau in prezenta unor mici si rare grupuri de megacariocite, ceea ce sugereaza derularea unor discrete procese de hematopoieza compensatorie, dar ele sunt incomparabil mai discrete decat cele observate in splina animalelor din acelasi lot. Structura lobulilor hepatici este comparabila cu a martorului in cazul ambelor loturi de sobolani tratati cu extracte de Echinacea.

Analiza ultrastructurala a ficatului celor doua loturi tratate cu extracte de Echinacea, ne releva faptul ca ambele extracte au avut un efect antihiperlipidic, mai puternic in cazul lotului tratat cu extract de E.pallida. De asemenea, metabolismul proteic este restabilit, fapt demonstrat prin restabilirea structurii normale nucleolare, cresterea electrondensitatii matricei citoplasmatice, ceea ce indica o crestere a prezentei poliribozomilor. In schimb, se mentine o cantitate crescuta de REN, ceea ce sugereaza continuarea cu intensitate a activitatii de detoxifiere, respectiv de metabolizare a actiunii negative a ciclofosfamidei asupra ultrastructurii hepatocitelor. Celulele Kupffer se pare ca sunt mai numeroase decat la martor, fapt care ne confirma cele precizate anterior si anume capacitatea extractelor vegetale de a anihila alterarile produse de ciclofosfamida si de a mentine o activitate metabolica normala in hepatocite.

Suprarenalele, glande endocrine implicate in reactia organismului la fenomenele de stres, imediat dupa administrarea ciclofosfamida prezinta un aspect de hipertrofie suprarenaliana cu cresterea greutatii relative a organului si intensificarea secretiei de hormoni glucocorticoizi. Dupa 10 zile de la administrarea CFA suprarenalele prezinta inca o usoara hipertrofie si un continut scazut de colesterol. Continutul de vitamina C este restabilit. La sobolanii care au fost tratati cu Echinacea purpurea toti acesti parametri sunt restabiliti.

La nivelul suprarenalelor modificarile morfologice aparute in urma tratamentului cu ciclofosfamida sunt mult mai discrete decat in cazul organelor sistemului imun. De altfel, acest lucru era de asteptat avand in vedere faptul ca ciclofosfamida actioneaza in primul rand prin stoparea diviziunilor celulare si in consecinta actioneaza brutal asupra organelor in care procesele de proliferare ale celulelor sunt intense (ex. timusul) sau unde rata de inlocuire a celulelor este mare, ceea ce nu este cazul la suprarenale. Desigur, ne referim la modificarile morfologice, cele functionale putand fi foarte intense, dar acest lucru nu se traduce neaparat si morfologic. Modificari morfologice discrete apar la 24 ore dupa ultima administrare de ciclofosfamida si se traduc prin vacuolizari citoplasmatice ce pot fi vizibile la o parte dintre celule atat din corticala cat si din medulara, fara ca numarul acestor celule sa fie mare. Analiza ultrastructurala a suprarenalelor loturilor tratate cu numai cu ciclofosfamida ne indica totusi o oarecare alterare datorata citostaticului, fapt demonstrat prin prezenta nucleilor spongiocitelor cu contur neregulat pronuntat, o alterare usoara a componentei steroidice a granulelor hormonale si o polimorfizare si mielinizare a mitocondriilor in unele zone. Sub actiunea ambelor extracte de Echinacea alterarile datorate administrarii citostaticului sunt mult diminuate, dar totusi in unele imagini electronomicroscopice mitocondriile isi mentin polimorfismul.

In concluzile, administrarea extractelor de Echinacea la animalele tratate cu Ciclofosfamida a avut efecte vizibile de stimulare a proceselor de refacere structurala a unor organe endocrine si limfoide, precum si a homeostaziei enzimatice din aceste organe. De asemenea se remarca efectul hepatoprotector al extractelor testate, demonstrata prin refacerea structurala a ficatului dupa administrarea de ciclofosfamida.

Efectele timotrope si splenotrope observate dupa administrarea celor doua extracte de Echinacea, ne sugereaza utilitatea administrarii acestora ca potentiali agenti modulatori ai unor functii ale sistemului endocrin si imunitar in cursul si mai ales dupa terapia citostatica.

Rezultatele studiului clinic sunt in concordanta cu datele complexe obtinute in urma cercetarilor de laborator, observandu-se urmatoarele: stimularea activitatii fagocitare a granulocitelor, evidentiata prin cresterea numarului de neutrofile, a indicelui opsono-citofagic. De asemenea, la 10 zile de la administrarea primei doze de Echinacea, nivelul de monocite si limfocite este superior inceperii tratamentului si a celui de la lotul placebo. Aceste date ne sugereaza faptul ca administrarea extractului a avut un efect de stimulare la nivelul maduvei hematogene, a seriei granulocitare, monocitare si limfocitare.

Aceste rezultate practice ar putea avea o importanta majora in tratamentul tumorilor maligne, deoarece pe de o parte citostaticele produc imunosupresie, iar pe de alta parte asocierea preparatelor vegetale in tratament ar putea determina scurtarea perioadelor dintre doua aplicari chimioterapeutice care este necesara pentru refacerea sistemului imunitar.

4. CONCLUZII FINALE

1. Administrarea extractelor de Echinacea pallida si Echinacea purpurea sobolanilor Wistar in conditii normale pe o perioada de 10 zile, nu manifesta efecte toxice secundare la nivelul organelor studiate: maduva hematogena, timus, splina, suprarenale si ficat .

2. Investigatiile structural-functionale efectuate, demonstreaza faptul ca extractele vegetale testate stimuleaza intr-o oarecare masura proliferarea, diferentierea si maturarea celulelor la nivelul organelor hemato-si limfopoietice, precum si o potentare a activitatilor metabolice hepatice si mai putin a celor suprarenaliene.

3. Administrarea ciclofosfamidei pe o perioada de 3 zile a determinat o alterare structurala a organelor studiate, precum si o dereglare a unor parametri biochimici ai acestor organe.

4. Actiunea toxica a ciclofosfamidei este indreptata preponderent asupra organelor cu diviziuni celulare intense, cele mai afectate fiind maduva hematogena, timusul si splina, organe caracterizate printr-o profunda perturbare a componentei celulare cat si a celei vasculare: depletie celulara (prin blocarea diviziunilor mitotice) cu depopulare masiva urmata de fibrozare, staza sanguina si congestie vasculara, edeme perivasculare si uneori focare hemoragice.

5. Desi au o amploare si o extindere deosebita, modificarile structurale si ultrastructurale induse de ciclofosfamida sunt reversibile, ceea ce dovedeste relularea functionalitatii organelor studiate. Totusi la 10 zile de la administrarea ultimei doze de citostatic, parametrii morfo-functionali sunt mult inferiori martorului.

6. Extractele de Echinacea administrate prin gavaj intragastric sobolanilor tratati cu Ciclofosfamida au determinat o stimulare a proceselor de refacere structurala si functionala de la nivelul organelor studiate: maduva hematogena, timus, splina, suprarenale si ficat .

7. Administrarea celor doua extracte de Echinacea a determinat restabilirea structurala si functionala a timusului afectat de administrarea citostaticului, care consta in refacerea structurala a lobulului timic (restabilirea raportului corticala/medulara), in stimularea mitozelor in corticala timica la un nivel similar martorului, precum si restabilirea homeostaziei enzimatice (activitatea unor enzime timice este restabilita).

8. Administrarea extractelor de Echinacea sobolanilor tratati cu ciclofosfamida a determinat la nivelul splinei o accelerare a proceselor de refacere structurala si ultrastructurala, dereglate de administrarea citostaticului. Fenomenele de refacere au fost observate la nivelul foliculilor splenici care sunt bine reprezentati si cu centru germinativ foarte dezvoltat. Atat distributia, cat si ultrastructura celulelor reticulare, a fibrocitelor si a diferitelor categorii de limfocite apar in splina loturilor animalelor tratate consecutiv cu ciclofosfamida si extracte vegetale, apropiate de martor. Parametri biochimici determinanti sunt doar partial restabiliti.

9. Administrarea extractelor de Echinacea a avut un efect de refacere structurala si functionala a ficatului afectat de tratamentul cu ciclofosfamida, sub actiunea ambelor extracte restabilindu-se activitatea metabolica hepatica normale, fapt dovedit de imaginile ultrastructurale provenite de la cele doua loturi tratate cu extracte vegetale.

10. Administrarea extractelor de Echinacea sobolanilor tratati cu ciclofosfamida a determinat refacerea partiala a morfologiei glandelor suprarenale si a parametrilor biochimici.

11. Administrarea extractelor de Echinacea sobolanilor tratati cu ciclofosfamida a determinat o restabilire partiala a parametrilor biochimici serici. Restabilirea valorilor normale a formulei leucocitare a sobolanilor tratati cu extracte de Echinacea fata de lotul tratat numai cu citostatic, ne indica reluarea procesului de repopulare sanguina cu elemente figurate, datorata probabil stimularii granulocitopoiezei, limfocitopiezei si monocitopiezei la nivelul maduvei hematogene sub actiunea extractelor vegetale.

12. Administrarea extractelor de Echinacea pacientilor voluntari cu sistem imunitar depresat, pe o perioada de 10 zile, a determinat o restabilire a valorlor normale a parametrilor imunologici, biochimici si hematologici.

In concluzie refacerea structurala si functionala a organelor sobolanilor Wistar, afectate de tratamentul cu ciclofosfamida este mult mai rapida sub actiunea extractelor de Echinacea comparativ cu refacerea de la sine. Coroborarea acestor rezultate cu cele obtinute din studiul clinic ne sugereaza posibila aplicare a acestor extracte vegetale in chimioterapie ca adjuvante, scurtandu-se astfel perioada dintre doua cure chimioterapeutice in oncologie.

Datorita limitarii dimensiunilor fisierului nu am putut introduce poze, care au dimensiuni mari fiind scanate la rezolutie mare.

Rezultatele, discutiile si concluziile se bazeaza pe 240 de imagini de microscopie optica si electronica si 35 de grafice.

Raportul amplu are 300 de pagini si se afla depus la biblioteca Universitatii de Vest Vasile Goldis din Arad.

5. BIBLIOGRAFIE

Ardelean A., Miclaus V., Craciun C., Pasca C., Craciun V., Reactivation of the hematopoiesis in the spleen and liver of the adult mice induced by two experimental compounds with an antiinflamatory action, Current problems in Cellular and Molecular Biology, Vol.IV., A.Ardelean, C.Craciun Editors, Ed.Risoprint Cluj-Napoca, p.299-304, 1999.

Ardelean A., Miclaus V., Craciun C., Craciun V., Hermenean A., Histological studies concerning the action of cyclophosphamide on the hematopoietic system of Wistar rats, Current Problems in Cellular and Molecular Biology, vol.V, C.Craciun, A.Ardelean editors, Ed.Risoprint Cluj-Napoca, pag.171-179, 2000.

Ardelean A., Miclaus V., Hermenean A., Craciun C., Testarea efectului protector al unor extracte vegetale asupra structurii rinichiului de sobolan in urma tratamentului cu cisplatin, ANALELE SNBC, Vol.VII, Nr.1, Ed. Risoprint, Cluj-Napoca, pag.278-286, 2002.

Ardelean A., Hermenean A., Craciun C., Modificari ultrastructurale induse de ciclofosfamida in hepatocitele sobolanilor Wistar si testarea actiunii hepatoprotectoare a extractului de Echinacea pallida,Volumul de rezumate ale Zilelor Academice Aradene, Vasile Goldis Univ. Press, p.169, Arad, 2003.

Ayres DC, Like JD, Lignans. Chemical, Biological and Clinical Properties. Cambridge Univ. Press, 1990.

Baker RA, Immune Modulating Therapy: Interleukin-2 and interleukin-12. BETA(Bulletin of Experimental Treatments for AIDS):12-19, 1994.

Bauer and Wagner H, Echinacea species as potential immunostimulatory drugs, Econ. Med. Res., 5:253-321, 1991.

Bauer R, Echinacea drugs - effects and active ingredients, In:Arytl. Fortbild (Jena), 90(2):111-5, 1996.

Bauer R, Influence of Echinacea extracts on phagocitic activity, Zeit. Phytother., 10:43, 1989.

Bauer R, Remiger P, Wagner H, Alkamides from the roots of Echinacea angustifolia, Phytochemistry, vol.28, no.2, 505-508, 1989.

Bauer R, Wagner H, Echinacea - Handbuch, Wissnschftliche Verlagsge-sellschaft mbH Stuttgart, 1990.

Bauer VR, Jurcic K, Puhlmann J, Wagner H, Immunologic "in vivo" and "in vitro" studies on Echinacea extracts (Published in German), In: Arzneimittelforschung, 38(2): 276-81, 1988.

Barrutia M.G., Torroba M., Fernandez m., Vicente A., Zapata A.G., Macrophages and epithelial cells of the thymus gland, Tissue and Cell, 21, 6781, 1989.

Beuscher N., Bodinet C., Willingmann I., Egert D., Immune Modulating Properties of Root Extracts of Different Echinacea Species, Zeitschrift Phytoterapie, 16:157-166, 1995.

Bone K: Echinacea: What Makes It Work ?, Medi Herb, 30:19-23, 1997.

Borsa M., Abraham A., "In vitro" and "in vivo" studies of TROFOPAR Influence upon the Lipid "de novo" Synthesis in Normal and Allyl Alcohol-Intoxicated Wistar Rats, In: Pathological models in toxicological studies, Industrial Head-Office For Medicinal Drugs and Cosmetics, Bucharest, 329-333, 1985.

Borsa M., Madar J., Sildan N., gavan N., Fluocinolone-induced changes in serum and hepatic enzyme activities in Wistar rats. In:Current problems and Techniques in Cellular and Molecular Biology, C.Craciun, A.Ardelean eds., Ed.Mirton, Timisoara, p.297-300, 1996.

Braunig B, Dorn M, Limburg E, Knick E. Enhancement of Resistance in Common Cold by Echinacea Purpurea, Z Phytother., 13:7-13, 1992.

Brinkeborn R.M., Shah DV, Degenring F.H., Echinacea and other Echinacea fresh plant preparations in the treatment of the common cold. A randomized, placebo controlled, double/blind clinical trial, In: Phytomedicine, 6 (1): 1-6, 1999.

Bukovski M, Kostalova D, Magnusova R, Vaverkova S, Testing for immunomodulating effects of ethanol-water extracts of the above-ground parts of the plants Echinacea (Moench) and Rudbeckia L. (Published in Slovak), In:Cesk.Farm., 42 (5):228-31, 1993.

Bukovsky M, Vaverkova S, Kostalova D, Immunomodulating activity of Echinacea gloriosa L, Echinacea angustifolia DC and Rudbeckia speciosa Wenderoth ethanol-water extracts (Published in Slovak), In: Pol.J. Pharmacol, 47(2):175-7, 1995.

Bukovsky M, Vaverkova S, Kostalova D, Magnusova R, Immunomodulating activity of ethanol-water extracts of the roots of Echinacea gloriosa L, E.angustifolia DC and Rudbeckia speciosa Wenderoth tested on the immune system in C57BL6 inbred mice (Published in Slovak), In: Cesk Farm, 42(4):184-7, 1993.

Bumbasirevic V., Skaro-Milic A., Arsic D., Djuricic B., Morphology of cell death of mitotically arrested thymocytes, Electron Microscopy, ICEM 14, Cancun, Mexico, p.825-826, 1998.

Burger RA, Torres AR, Warren RP, Caldwell VD, Hughes BG. Echinacea-induced Cytokine Production by Human Macrophages, Int. J. Immunopharmacol., Jul 19(7):371-9, 1997.

Burkitt H.G., Young B., Heath J.W., Wheater's Functional Histology, Churchill Livingstone Edinburg-London-Madrid-Melbourne-New York and Tokyo, 1993.

Chihara G, Hamuro J, Maeda Y, Arai Y, Fukoka F, Fractionation and purification of the polysaccharides with maked antitumor activity, especially lentinan, from Lentinus edodes (Berk) Sing (an edible musroom), Cancer Res, 30(11): 2776-81, 1970.

Chis I., Abraham A.D., TROFOPAR Effect upon the Rate of (1-14C) Leucine Incorporation into Tissues proteins of Allyl Alcohol-intoxicated Wistar Female Rats, In: Pathological models in toxicological studies, Industrial Head-Office For Medicinal Drugs and Cosmetics, Bucharest, 323-328, 1985.

Chiricuta I., Bologa S., Risca R., Ghergariu S. Biologia animalului de laborator si oncologie comparata, Material de informare si indrumare metodologica, Cluj-Napoca, vol.19, 1992.

Ciulei I, Grigorescu E, Stanescu Ursula, Plante medicinale, fitochimie si fitoterapie-Tratat de farmacognozie, vol.II, Ed.Medicala, Bucuresti, 1993.

Claasen E, Leeuw W, P de Greve, Hendriksen C, Boersma W, Freund's complete adjuvant: an effective but disagreable formula, Research in Immunology, 143:478-483, 1992.

Cooper PD, Mc Comb C, Steele EJ, The adjuvanticity of Algammulin, a new vaccine adjuvant.Vaccine 9: 408-415, 1991.

Collins E., Berkoff N., Echinacea and immunity, Prima Publishing, 160 pag., 1999.

Conkling W., Secrets of Echinacea, St. Martin's Paperbacks, 192 pag., 1999.

Craciun C., Electron Microscopy Investigations on rat Hepatocytes in Acute Allyl Alcohol Intoxication and after Trofopar Treatment, In: Pathological models in toxicological studies, Industrial Head-Office For Medicinal Drugs and Cosmetics, Bucharest, 252-271, 1985.

Craciun C., Sildan N., Craciun V., Madar J., Modificari ultrastructurale induse de ciclofosfamida in hepatocitele sobolanilor Wistar si testarea actiunii hepatoprotectoare a extractului de Calendula officinalis L. Si a acidului oleanolic, Revista Medicala Oradeana, nr.1,pag.37-41, 1994.

Craciun C., Miclaus V., Studiu electronomicroscopic al timusului la tineretul bovin in varsta de doi ani, Buletinul Universitatii de Stiinte Agricole Cluj-Napoca, Seria Zootehnie si Medicina Veterinara, 1997.

Craciun C., Ardelean A., Madar J., Tarba C., Sildan N., Craciun V., Farcas T., Ultrastructural studies of the secondary effects induced at the level of thymus by topic application of fluoccinolone-acetonide-N in prepubertal rats, In: Current Problems in Cellular and Molecular Biology (eds. A.Ardelean and C.Craciun), Ed.Risoprint, Cluj-Napoca, pp.176-136, 1997.

Craciun C., Tarba C., Madar J., Ardelean A., Sildan N., Farcas T., Craciun V., Study of the secondary effects induced by the topic application of fluoccinolone-acetonide-N in thymus ultrastructure of pubertal rats, In: Current Problems in Cellular and Molecular Biology (eds. A.Ardelean and C.Craciun), Ed.Risoprint, Cluj-Napoca, pp.187-199, 1997.

Craciun C., Madar J., Fratila S., Craciun V., Miclaus V., Ardelean A., Ilyes I., Comparative study of thymus ultrastructure, thymolysis and thymus and blood serum lipids in prepubertal rats, treated with topical corticosteroids, In: Current problems in cellular and Molecular Biology, III, Ed. By C.Craciun, A.Ardelean, ed.Risoprint, Cluj-Napoca, p.200-217, 1998.

Craciun C., Madar J., Tarba C., Fratila S., Ardelean A., Craciun V., Ilyes I., Correlation between ultrastructural thymus modifications, thymolysis, thymus and blood-serum lipids in response to epicutan-applied dermocorticoids in pubertal rats. In: Current problems in cellular and Molecular Biology, III, Ed. By C.Craciun, A.Ardelean, ed.Risoprint, Cluj-Napoca, p.218-235, 1998.

Craciun C., Fratila S., Ultrastructural and biochemical studies concerning the action of some topical dermocorticoids on prepubertal rat thymuses, before and simultaneously with beta-adrenoreceptors blocking, Current problems in Cellular and Molecular Biology, Vol.IV., A.Ardelean, C.Craciun Editors, Ed.Risoprint Cluj-Napoca, p.209-248, 1999.

Craciun C., Kis E., Sandu V., Pasca C., Puica C., Craciun V., Comparative studies of the adrenal cortex structure and ultrastructure, in prepubertal rats treated with topical dermocorticoids, Current problems in Cellular and Molecular Biology, Vol.IV., A.Ardelean, C.Craciun Editors, Ed.Risoprint Cluj-Napoca, p.305-314, 1999.

Craciun C., Miclaus V., Pasca C., Kis E., Sandu D., Craciun V., Papuc I., Munteanu C., Histological and ultrastructural studies of the thymus of the rats inoculated with a single therapeutic dose of cyclophosphamide, Current problems in Cellular and Molecular Biology, Vol.IV., A.Ardelean, C.Craciun Editors, Ed.Risoprint Cluj-Napoca, p.329-337, 1999.

Craciun C., Rosioru C., Ultrastructural and biochimical modifications induced by simultaneous treatments with dermocorticoids and propranolol in the liver of rats, Current Problems in Cellular and Molecular Biology, vol.V, C.Craciun, A.Ardelean editors, Ed.Risoprint Cluj-Napoca, pag.135-165, 2000.

Craciun C., Ardelean A., Craciun V., Miclaus V.Tudoran-barbu L., Structural and ultrastructural modifications induced by simultaneous treatments with dermocorticoids and propranolol in the adrenal glands, Current Problems in Cellular and Molecular Biology, vol.V, C.Craciun, A.Ardelean editors, Ed.Risoprint Cluj-Napoca, pag.225-245, 2000.

Craciunas C., Coman N., Dordea M., Buzila R., Clastogenic effects of cyclophosphamide and the use of a bioactive extract of Calendula officinalis as adjuvant, Current problems in Cellular and Molecular Biology, Vol.IV., A.Ardelean, C.Craciun Editors, Ed.Risoprint Cluj-Napoca, p.345-350, 1999.

Dezube B, Pardee AB, Chapman B et al, Pentaxifylline (Trental) decreases tumor necrosis factor (TNF) and HIV replication in patients with AIDS.VIII Int. Conference on AIDS/III STD World congress, Amsterdam, oral abstract M0019, 1992.

Dhamodharat R, et all, Vinblastine Suppresses Dynamics of Individual Microtubules in Living Interphase Cells, Mol. Biol. Cell, 6:1215, 1995.

Dorn M, Knick E, Lewith G. Placebo-controlled, Double-blind Study of Echinacea Pallida Radix in Upper Respiratory tract Infections, J.Allergy Clin. Immunol., 95:1133-8, 1995.

Dorsch W, Critical application of extracts of Echinacea purpurea or Echinacea pallida. Critical evaluation of controlled clinical studies, In: Z. Arztl.Forbild (Jena), 90(2):117-22, 1996.

Duke JA, Promising phytomedicinals, J.Janick and JE Simon (eds.), Advances in new crops. Timber Press, Portland, OR, 491-498, 1990.

Dumitrescu R., Craciun V., Madar J., Craciun C., Ardelean A., Ultrastructural studies of liver on prepubertal and pubertal rats after treatment with topical dermocorticoids, Current problems in Cellular and Molecular Biology, Vol.IV., A.Ardelean, C.Craciun Editors, Ed.Risoprint Cluj-Napoca, p.456-469, 1999.

Egert D, Beuscher N, Studies on antigen specificity of immunoreactive arabinogalactan proteins extracted from Baptisia tinctoria and Echinacea purpurea. In:Planta Med, 58(2):163-5, 1992.

Egert D., Beuscher N., Virus-inhibition by Echinacea purpurea, Planta Med., 58: 163-165, 1992.

Elsasser-Beile U, Willenbacher W, Bartsch HH, Gallati H, Schulte Monting J, von Kleist S, Cytokine production in leukocyte cultures during therapy with Echinacea extract, In:J.Clin.Lab.Anal., 10(6):441-5, 1996.

Ewisk, van W., T-cell differentiation is influenced by thymic microenvironment , Annu.Rev.Immunol., 9, 591-615, 1991.

Facino RM, Carini M, Aldini G, Marinello C, Arlandini E, Franzoi L, Colombo M, Pietta P, Mauri P, Direct characterization of caffeoyl esters with antihyaluronidase activity in crude extracts from Echinacea angustifolia roots by fast atom bombardament tandem mass spectrometry, In: Farmaco, 48(10):1447-61, 1993.

Facino RM, Carini M, Aldini G, Saibene L, Pietta P, Mauri P. Echinacoside and Caffeoyl Conjugates Protect Collagen from Free Radical-Induced Degradation: A potential Use of Echinacea Extracts in the Prevention of Skin Photo damage, Planta Med., Dec 61(6):510-4, 1995.

Fratila S., Miclaus V., Craciun C., Benedek F., Craciun V., Cuparencu B., Histopathological and ultrastructural changes of the rat thymus induced by short treatment with topical glucocorticoids, Current problems in Cellular and Molecular Biology, vol.III, C.Craciun, A.Ardelean editors, Ed.Risoprint Cluj-Napoca, pag.236-242, 1998.

Fukomoto T., Precise analysis of the structure of the thymus for establishing details of the mechanism underlying thymocyte proliferation and maturation, Acta Histol.Cytol., 60, 1-8, 1997.

Gaisbauer M, Schleich T, Stickl HA, Wilczek I, The effects of Echinacea purpurea Moench on phagocytosis in granulocytes measured by chemiluminiscence (Published in German), In: Arzneimittelforschung, 40(5): 594-8, 1990.

Gallo M., Maumita S., Waisye A., Pietrzak K., Comas B., Smith M., Pregnancy Outcome Following Gestational Exposure to Echinacea: A Prospective Controlled Study, Arch.Intern.Med., 160:3141-3143, 2000.

Gao BY, Xy L, Liu L et al, Effects of panaxatriol saponins isolated from Panax notaginseng (PTS) on myocardial ischaemic arrhythmia in mice and rats. Yao Hsueh Hsueh Pao, 27:641-644, 1992.

Gaudecker B. von, Ultrastructure of the age-involuted adult human thymus, Cell Tiss.res., 186, 507-525, 1978.

Gaudecker B. von, Functional histology of the human thymus, Anatomy and Embryology, 183, 1-15, 1991.

Gadaleanu V., Craciun C., Ultrastructural examination of the spleen after respiratory and general antigenic stimulation, Rev. Roum. Morphol. Embryol., Physiol., MORPHOL:-EMBRYOL., XXVII,1, p.67-72, 1981.

Giurgea R., Corelatii endocrino-imunitare, 166 pag., 1994.

Goldbach PS, Durmont R, Kessler P., Poindron , Stamm A, In situ activation of mouse alveolar macrophages by aerolized liposomal interferon (gamma) and muramyl tripeptide, Am.J.Physilo, 1995.

Goodman A, Sanford L, Gilman A, Goodman Gilman eds.The Pharmacological Basis of Therapeutics, 8th Edition, Elmsford, NY, Pergamon Press, 1990.

Grim W., muller HH, A randomised controlled trial of the effect of fluid of Echinacea purpurea on the incidence and severity of colds and respiratory infections, Am. J.Med., 106 (2): 256-60, 1999.

Haelst V., von, Light and electronmicroscopic study of the normal and pathological thymus of the rat.II. The acute thymus involution, Z.Zellforsch, 80, 153-182, 1967.

Harborne JB, Baxter H, Phytochemical Dictionary: A Handbook of Bioactive Compounds from Plants. Washington DC: Taylor and Francis, 1993.

Heinzer F, Mensy JP, Chavanne M, Echinacea pallida and Echinacea purpurea. Followup of weight development and chemical composition for the first two culture years. 36th Annual Congress of the Society of Medicinal Plant Research, Preiburg, Germany, Sept.12-16, 1988.

Henneicke-von Zepelin H., Heutschel C., Schnitker J., Kohnen R., Kohler G., Wustenberg P., Efficacy and safety of a fixed combination phytomedicine in the treatment of the common colds (acute viral respiratory tract infection): results of a randomised, double blind, placebo controlled, multicentre study, In: Curr Med. Res. Opin., 15 (3):214-27, 1999.

Herbert WJ, Mineral-oil adjuvants and the immunization of laboratory animals, In handbook of Experimental Immunology D.M.Weir, 3rd ed., Blackwell Scientific Publications, Oxford, A3.1-A3.15, 1978.

Hermenean A., Soran V., Ardelean A., Toxicitatea hematologica - principalul efect secundar al tratamentului cu citostatice in cancer, Studia Universitatis "Vasile Goldis" Arad, Vol.5, p.164-168, 1995.

Hermenean A., Ardelean A., Echinacea - un gen de plante medicinale cu reale proprietati imunostimulatoare, Studia Universitatis "Vasile Goldis" Arad, Vol.6, Seria A, pag.96-105,1996.

Hermenean A., Aurel Ardelean, Coralia Hermenean, Hortensia Ionita, Echinacea - a group of medicinal plant with real immunostimulation features, ECBO 97, Brighton, 1997, pg.117.

Hermenean A., Ardelean A., Ardelean C., The immunostimulatory effects induced after treatment with Echinacea extracts upon the patients suffering from tuberculosis, Current Problems in Cellular and Molecular Biology, vol.II, A. Ardelean, C.Craciun Editors, Ed.Risoprint, Cluj Napoca, p. 249-254, 1997.

Hermenean A., Craciun C., Researches concerning "in vitro" and "in vivo" tests with Echinacea extracts, Current problems in Cellular and Molecular Biology, vol.III, C.Craciun, A.Ardelean editors, Ed.Risoprint Cluj-Napoca, pag.173-176, 1998.

Hermenean A., Fitoterapia si sistemul imunitar, Studia Universitatis "Vasile Goldis" Arad,Vasile Goldis univ.Press, Vol. 8, p.306-307, 1998.

Hermenean A., CraciunC., Ardelean A., Potentarea raspunsului imunitar cu ajutorul imunomodulatoarelor, Studia Universitatis "Vasile Goldis" Arad, Vasile Goldis univ.Press,Vol. 9, p.293-303, 1999.

Hermenean A., Ispravnic A., Plants and cancer research, Current problems in Cellular and Molecular Biology, Vol.IV., A.Ardelean, C.Craciun Editors, Ed.Risoprint Cluj-Napoca, p.490-492, 1999.

Hermenean A., Ardelean A., Craciun C., Borsa M., Miclaus V., Testarea comparativa a efectului imunomodulator a doua extracte de Echinacea in terapia cu ciclofosfamida la sobolan, ANALELE SNBC, Vol.VII, Nr.1, Ed. Risoprint, Cluj-Napoca, pag.291-297, 2002.

Hermenean A., Ardelean A., Craciun C., Modificari ultrastructurale induse de ciclofosfamida in hepatocitele sobolanilor Wistar si testarea actiunii hepatoprotectoare a extractului de Echinacea purpurea,Volumul de rezumate ale Zilelor Academice Aradene, p.168, Arad, 2003.

Hermenean A., Ardelean A., Craciun C., Miclaus V., Tamas M., Efectele administrarii extractelor de Echinacea asupra structurii si ultrastructurii timusului de sobolanilor Wistar, consecutiv terapiei cu ciclofosfamida, Buletinul Societatii Nationale de Biologie celulara,a XX-a Sesiune Stiintifica Anuala a S.N.B.C. ,nr.31, Zalau,2003.

Hermenean A., Craciun C., Ardelean A., Miclaus V., Tamas M., Efectele administrarii extractelor de Echinacea asupra structurii si ultrastructurii splinei sobolanilor Wistar, consecutiv terapiei cu ciclofosfamida, Buletinul Societatii Nationale de Biologie celulara,a XX-a Sesiune Stiintifica Anuala a S.N.B.C. ,nr.31, Zalau,2003.

Hill N, Stam C, van Haselen RA, The efficacity of Prrikweg gel in the tratment of insect bites: a double-blind, placeo-controlled clinical trial, In: Pharm World Sci, 18(1):35-41, 1996.

Hobbs C, Echinacea - The Immune Herb, Botanica Press, Second ed., 1994.

Hobbs C, Medicinal Mushrooms an exploration of Traditional, Healing and Culture, 121-124, 1995.

Hoffman D, Herbal medicine, Botanica Press, 1997.

Hoheisel O, Sandberg M, Bertram S, et al. Echinagard Treatment Shortens the Course of the Common Cold: a Double-blind, Placebo-controlled Clinical trial, Eur. J. Clin. Res., 9:261-8, 1997.

Hu JG, Kitagawa T, Studies of the optimal immunization schedule of experimental animals.VI.Antigen dose-response of aluminium hydroxide-aided immunization and booster effect under low antigen dose.Chem.Pharm.Bull: 38:2775-2779, 1990.

Hunter R, Olsen M, Buynitzky, Adjuvant activity of non-ionic block copolymers.IV.Effect of molecular weight and formulation on titer and isotype of antibody, Vaccine 9:250-256, 1991.

Iwanaga T., Apoptosis of enterocytes and involvment of lymphocytes and macrophages, Italian J.of Anat. And Embryol., 104, Suppl.1, p.316, 1999.

James J and others, Thymomodulin. AIDS Treatment news, 202:1-7, 1998.

Janeway C.A., Travers P., Imunobiology. Blacwell Sci.Publ., Oxford, 1994.

Jelea S., Giurgea R., Efectele acetatului de plumb asupra timusului sobolanilor Wistar, ANALELE SNBC, Vol.VII, Nr.1, Ed. Risoprint, Cluj-Napoca, pag.380-386, 2002.

Johnson HM and others, How interferon fight disease, Scientific American 270(5):68-75, 1994.

100. Junquiera L.C., Carneiro J., Long., Basic Histology, Lange Medical publications, California, 5-th ed., 1986.

101. Kahlos K, Antitumor Activity of Some Extracts and Compounds from Innotus radiatus, Fitoterapia, vol.60, no.6, 1996.

102. Kim LS, Waters RF, Burkholder PM, Immunological Activity of larch Arabinogalactan and Echinacea: A preliminary, randomized Double-blind, Placebo-controlled Trial, Altern.med.Rev., 7 (2): 138-149, 2002.

103. Kleinman NR, Kier AB, Diaconu E, Lass JH, Posterior paresis induced by Freund's adjuvant in guinea pigs, Laborator Animal Science, 43:364-366, 1993.

104. Kubota K, Fukmiya N, Tokuda H, Nishino H, Tagahara K, Le KH, Okam M, Quassinoids as inhibitors of Epstein Barr virus early antigen activation, Cancer Lett, 113 (1-2), 165.8, 1997.

105. Landanyi A, Timar J, Lapis K, Effect of lentinan on macrophage cytotoxicity against metastatic tumor cells, Cancer Immunol., Immunother, 36(2):123-6, 1993.

106. Lersch C, Zeuner M, Bauer A, Siemens M, Hart R, Drescher M, Fink U, Dancygier H, Classen M, Nonspecific immunostimulation with low doses of cyclophosphamide extracts (echinacin) in patients with far advanced colorectal cancers: preliminary results, In: Cancer Invest, 10 (5): 343-8, 1992.

107. Lindhout E., Groot C., Follicular dendritic cells and apoptosis: life and death in the germinal centre. Histochem.J., 27, 167-183, 1995.

108. Lohmann-Matthes, Wagner H, Macrophage activation by plant polysaccharides, Zeit Phytother, 10:52, 1989.

109. Luettig B, Steinmuller C, Gifford GE, Wagner H, Lohmann-Matthes ML, Macrophage activation by the polysaccharide arabinogalactan isolated from plant cell cultures of Echinacea purpurea, In: J.Nat. Cancer Inst., 81(9):669-75, 1998.

110. Madar J., C.Craciun, Giurgea R., Borda D., Roman I.., Craciun V., Ilyes I., Antiglucocorticoid effects of propranolol on thymolysis and on thymus metabolic and ultrastructural disorders induced by percutan-absorbed hydrocotisone-17-butyrate in young rats, Current problems in Cellular and Molecular Biology, vol.III, C.Craciun, A.Ardelean editors, Ed.Risoprint Cluj-Napoca, pag.243-253, 1998.

111. Mauricek Gately et al., The interleukin-12/interlukin-12 receptor system: Role in Normal and Pathologic Immune Responses; Annu.Rev.Immunol, 16:495-521, 1998.

Melchart D, Linde K, Worku F, Bauer R, Wagner H. Immunomodulation with Echinacea: A Systematic Review of Controlled Clinical Trials, Phytomedicine, 1:245-254, 1994.

112. Melchart D, Linde K, Worku F, Sarkady L, Holzmann M, Jurcic K, Wagner H. Results of five Randomized Studies on the Immunomodulatory Activity of Preparations of Echinacea, J. Altern Complement Med., Summer 1 (2):145-60, 1995.

113. Melchart D, Malther E, Linde K, Brandmaier R, Lersch C. Echinacea Root Extracts for the Prevention of Upper Respiratory Tract Infections: A Double-blind, Placebo-controlled Randomized Trial, Arch. Fam. Med., Nov-Dec 7(6):541-5, 1998.

114. Melchart D., Linde K., Fischer P., Kaesmayr J., Echinacea for preventing and treating the common cold, Cohrane Database Syst.Rev., (2): 6D000530, 2000.

115. Melchart D., Clemm C., Weber B., Draczynski T., Worku F., Linde K., Weidenhammer W., Wagner H., Saller R., Polysaccarides isolated from Echinacea purpurea herba cell cultures to counteract undesired effects of chemotheraphy - a pilot study, Phytother., 16 (2): 138-142, 2002.

116. Mengs U, Clare CB, Poiley JA, Toxicity of Echinacea purpurea. Acute, subacute and genotoxicity studies, Arzneimittelforschung, 41(10):1076-81, Oct, 1991.

117. Miclaus V., C.Craciun, The appearance of cavity formations in rat thymus after treatment with an epicutan-applied dermocorticoid, Current problems in Cellular and Molecular Biology, Vol.IV., A.Ardelean, C.Craciun Editors, Ed.Risoprint Cluj-Napoca, p.288-298, 1999.

118. Miclaus V., Brudasca F., Pasca C., Oana L., Involution of the dog thymus in canin parvovirus - histological study, Current problems in Cellular and Molecular Biology, Vol.IV., A.Ardelean, C.Craciun Editors, Ed.Risoprint Cluj-Napoca, p.372-377, 1999.

119. Miclaus V., C.Craciun, The phagocitic activity of macrophages from lymph nodes in dog parvovirus, Current Problems in Cellular and Molecular Biology, vol.V, C.Craciun, A.Ardelean editors, Ed.Risoprint Cluj-Napoca, pag.341-345, 2000.

120. V.Miclaus, Participarea macrofagelor la morfogeneza corpusculilor Hassal, Analele Societatii Nationale de Biologie Celulara, C.Craciun, A.Ardelean Editors, Vol.II, Nr.2, Editura Risoprint Cluj-Napoca, p.258-263, 2002.

121. Miller LG, Arch Intern Med Herbal Medicinals: Selected Clinical Connsiderations Focusing on Known or Potential Drug-herb Interactions, 158(20):2200-11, Nov1998.

122.Milicevic N.M., Milicevic Z., Colic M., Camperdijk E.W.A., Hoesfsmit E.C.M., Ultrastructural study of macrophages of the thymus after cyclosporin treatment. Thymus, 22, 35-44, 1993.

123.Moncada CV, Israel Y, Simple method for the preparation of antigen emulsions for immunization, Journal of Immunological methods, 162:133-140, 1993.

124.Moraru I, Imunologie, Ed Medicala, Bucuresti, 1984.

125.Morein B, Lovegren K, Ronneberg B, Sjolander A, Villacres-Eriksson M, Immunostimulating complexes:Clinical potential in vaccine development, Clinical Immunoterapeutics 3: 461-475, 1995.

126.Mosmann TR, Cytokine patterns during the progression to AIDS, Science, 265:193-194, July 8, 1994.

127.Munteanu L, Tamas M, Specii de Echinacea de perspectiva in Romania, Herba Romanica, 9:79-85, 1989.

128.Mutschler E, Derendorf H, Drug Actions: Basic Principles and Therapeutic Aspects, Stuttgart, Germany, Medpharm Scientific Publishers, 1995.

129.Nabarra B., Adrianarison I., Ultrastructural studies of mouse thymic reticulum.I. Epithelial component, Thymus, 9, 95-124, 1987.

130.Nabarra B., Adrianarison I., Ultrastructural studies of mouse thymic reticulum.II. Non-Epithelial component, thymus, 9, 95-124, 1987.

131.Ogawara M, Sone S, Ogura T, Human alveolar macrophages: Wheat germ agglutinin-dependent tumor cell killing, Journal of Cancer Research, Vol.78, 3:288-295, 1987.

132.Ogawara M, Utsugi M, Yamazaki M, Sone S, Introduction of human monocyte-mediated tumor cell killing by a plant lectin, wheat germ agglutinine, Japanese Journal of Cancer Research, Vol.76, 11:1107-1114, 1985.

133.Ogura M, Cordell GA, Kinghorn AD, Farnsworth NR, Potential anticancer agents VI. Constituents of Ailanthus excelsa (Simaroubaceae) Lloydia, 40(6): 579-84, 1997.

134.Olinic A, Toader-Radu M, Muresan VD si colab., Curs de Histologie, Lito.UMF Cluj-Napoca, 1992.

135.Paranich AV, Pocherniaeva V, Dubinskaia GM, Mishchenko VP, Mironova NG, Gugalo VP, Nazarets VV. Effect of Supposed Radioprotectors on Oxidation-Reduction of Vitamin E in the Tissues of Irradiated Rats (Published in Russian), Radiats Biol Radioecol., 33 (5):653-7, Sep-Oct, 1993.

136.Parnham MJ, Benefit - Risk Assessment of the Squeezed Sap of the Purple Coneflower (Ecinacea purpurea) for a long-term Oral Immunostimulation, Phytomed, 3:95-102, 1996.

137.Pasca C., Kis E., Sandu D., Miclaus V., Giurgea R., Puscasiu M., Histological studies on the effects of different doses of Epirubicin (Farmorubicin) on the rat liver, Current problems in Cellular and Molecular Biology, vol.III, C.Craciun, A.Ardelean editors, Ed.Risoprint Cluj-Napoca, pag.271-275, 1998.

138.Pasca C., Craciun C., Ardelean A., Efecte secundare ale unor citostatice asupra organismului, Ed. Risoprint, Cluj-Napoca, 307 pag., 2000.

139.Pasca C., Miclaus V., Ardelean A., Kis E., Sandu D., Craciun V., papuc I., Structural and ultrastructural aspects of the rat thymus after carboplatin chemotherapy, Current Problems in Cellular and Molecular Biology, vol.V, C.Craciun, A.Ardelean editors, Ed.Risoprint Cluj-Napoca, pag.276-284, 2000.

140.Pasca C., Craciun C., Kiss E., Structural and ultrastructural modifications induced by two therapeutic doses of CIS-diamminedichloroplatinum (II) (Cisplatin) on some lymphoid organs in white Wistar rats, Studia Universitatis Babes-Bolyai, Biologia, XLVI, 2, pag. 65-74, 2001.

141.Percival SS, Use of Echinacea in medicine, In: Biochem Pharmacol, 60 (2): 155-8, 2000.

142.Petrescu I., Tarba C., Craciun C., Apoptotic effect of different xenobiotics at the hepatic level: I. Apoptosis vs.necrosis; the mecanism of apoptosis, Current problems in Cellular and Molecular Biology, vol.III, C.Craciun, A.Ardelean editors, Ed.Risoprint Cluj-Napoca, pag.39-45, 1998.

143.Pezzuto JM, Swanson SM, Mar W, Che CT, Corell GA, Fong HH, Evaluation of the mutagenic and cytostatic potential of aristolochic acid (3,4-methylenedioxy-8-methoxy-10-nitrophenanthrene-1-carboxylic acid) and several of its derivates, Mutant Res, 206 (4): 447-54, 1988.

144.Philippart C., Dourov N., Histopathology and ultrastructure of the thymus in OP-OP rats with special focus on thymus macrophages. Effect on bone marrow transplantation, Prath.Res.Pract., 191, 499-505, 1995.

145.Ploaie P., Petre Z., Introducere in microscopia electronica cu aplicatii in biologia celulara si moleculara. Ed.Academiei, bucuresti, 1979.

146.Prudden JF, The treatment of human cancer with agents prepared from bovine cartilage, J. of Bio.Response Mod., 4:551-584, 1985.

147.Prudden, J.F. A potent normalization; An interview .The Cancer Chronicles, No.16, 1993.

148.Pusztai A, Plant lectins.Cambridge Univ.Press, Cambridge, 1991.

149.Rai SS, Wolff, Localization of the vinblastine - Binding Site on b-Tubulins, J.Biol.Chem. 271, 14707, 1996.

150.Roesler J, Emmendorffer A, Steinmuller C, Luettig, Wagner H, Lohmann-Mathes ML, Application of purified polysaccharides from cell cultures of the plant Echinacea purpurea to test subjects mediates activation of the phagocyte system, In: J.Immunopharmacol, 13(7):931-41, 1991.

151.Roesler J, Steinmuller C, Kiderlen A, Emendorffer A, Application of purified polysaccharides from cell cultures of the plant Echinacea purpurea to mice mediates protection against systemic infection with Listeria monocytogenes and Candida albicans, In: Immunopharmacol, 13(1):27-37, 1991.

152.Rosioru C., Craciun C., Miclaus V., Petrescu I., Craciun V., Ilea C., Structural, ultrastructural and biochemical effects of certain alcohols and aldehydes on rat isolated, perfused liver, Current problems in Cellular and Molecular Biology, Vol.IV., A.Ardelean, C.Craciun Editors, Ed.Risoprint Cluj-Napoca, p.393-408, 1999.

153.Rudbach JA, Cantrell JL, Ulrich JT, Molecularly engineered microbial immunostimulators, In: Technological Advances, In Vaccine Development. R. Alan (ed) Liss, Inc:NY, 443-454, 1988.

154.Rusu V.M., Abraham A.D., Puica C., Effects of TROFOPAR on Morphological and Histo-Enzymatical Aspects of Thymus and Spleenin Allyl Alcohol-Intoxicated rats, In: Pathological models in toxicological studies, Industrial Head-Office For Medicinal Drugs and Cosmetics, Bucharest, 339-345, 1985.

155.Rusu V.M., Craciun C., Duca C., Ultrastructural changes of the hypertrophic epitelial cells in the thymus of splenectomized chickens. Thymus, 3, 213-222, 1981.

156.Rusu M., Borsa M., Roman I., Puica C., Implicarea radicalului liber CCl3- in modificarea activitatii enzimatice la nivelul unor organe metabolice si imuno-endocrine, Analele Societatii Nationale de Biologie Celulara, C.Craciun, A.Ardelean Editors, Vol.II, Nr.1, Editura Risoprint Cluj-Napoca, p.257-261, 2002.

157.Sandu V.D., Abraham A.D., Morphological and Histo-Enzymatycal Studies on the testis of allyl Alcohol Intoxicated Wistar Rats Treated with TROFOPAR, In: Pathological models in toxicological studies, Industrial Head-Office For Medicinal Drugs and Cosmetics, Bucharest, 349-353, 1985.

158.Scaglione F., Lund B., Efficacity in the Treatment of the common cold of a Preparation Containing an Echinacea extract, Int.J.Immunotheraphy, 21 (4): 163-166, 1995.

159.Schar D., Echinacea - the plant that boost your immune system, Sec. ed., North Atfantic Books, berkley, California, 144 pag., 2002.

160.Schoneberger D. Influence of the Immunostimulating Effects of the Pressed Juice of Echinacea Purpurea on the Duration and Intensity of the Common Cold: Results of a Double-blind Clinical trial, Forum Immunol, 2:18-22, 1992.

161.Schranner I, Wurdinger M, Klumpp N, Lorsch U, Okpanyi SN, Modification of avian humoral immunoreactions by Influex and Echinacea angustifolia extract, In: Zentralbl Veterinarmed [B], 36(5):353-64, 1989.

162.Schreiner J, Berger B, Root of success (ginseng crops in British Columbia), Canadian Geographic, 6:114, 1994.

163.Schulten B., Bulitta M., Ballering-Bruhl B., Koster V., Schafer M., Efficacity of Echinacea purpurea in patiens with a common cold. A placebo-controlled, randomsed, double-blind clinical trial, Arzneimittelforschung, 51 (7): 563-568, 2001.

164.Schumacher A, Friedberg KD, The effect of Echinacea angustifolia on non-specific cellular immunity in the mouse, (Published in German), In: Arzneimittelfrschung, 41(2):141-7, 1991.

165.See DM, Broumand N, Sahl L, Tilles JG, In vitro effects of Echinacea and ginseng on natural killer and antibody-dependent cell citotoxicity in healthy subjects and chronic fatigue syndrome or aquired immunodeficiency syndrome patients, Immunopharmacology, 35(3):229-35, 1997.

170.See DM, Berman S., Justis J., Broumand N., Chon S., Chang J., Tilles J., A Phase I Study on the safety of Echinacea angustifolia and its Effect on Viral Load in HIV Infected Individuals, JANA, 1 (1): 14-17, 1998.

171.Schiopu S., Coprean D., Moisa G.I., Zamfirescu S., Studiul efectului hepatoprotector al extractului de Artemisia vulgaris in intoxicatia acuta cu CCl4 la sobolanul Wistar, ANALELE SNBC, Vol.VII, Nr.1, Ed. Risoprint, Cluj-Napoca, pag.376-379, 2002.

172.Soga H., Nakamura M., Yagi H., Kayaba S., Ishii T., Gotoh T., Itoh I., Heterogeneity of mouse thymic macrophages. I. Immunohistochemical analysis, Arch.Histol.Cytol., 60, 1, 53-63, 1997.

173.Simone C, Presentation at a hearing on alternative medicine before a subcommitee of the Committee of Appropiations, U.S.Senate, 13rd Congress, June 24, 1993.

174.Smirnov VV, Bondarenko AS, Prikhodko VA, Antimicrobial activity of sesquiterpene phenol from Bidens cernua, Fitoterapia LXIX (1), 84-85, 1998.

175.Stahl M, Reifenberg K, Okpanyi S, Losch U, Porcine granulocyte functions: evaluation and modulation, In: Zentralbl Veterinarmed [B], 37(4):261-7, 1990.

176.Steinmuller C, Roesler J, Grottrup E, Franke G, Wagner H, Lohmann-Matthes ML, Polyssacharides isolated from plant cell cultures of E.purpurea enhance the resistance of immunosuppressed mice against systemic infections with Candida albicans and Listeria monocytogenes, In: Int.J. Immunopharmacol., 15(5):605-14, 1993.

177.Spinu Marina, Rodica Giurgea, Alcoholic Calendula officinalis and Echinacea angustifolia extractions influence some metabolic indicators of immune organs in chickens, Current problems in Cellular and Molecular Biology, Vol.IV., A.Ardelean, C.Craciun Editors, Ed.Risoprint Cluj-Napoca, p.186-190, 1999.

178.Spinu Maria , Dobrean V., Brudasca Gh., Vasiu A., The influence of some vegetal extractions on the blast transformation indices in chicken, Current problems in Cellular and Molecular Biology, Vol.IV., A.Ardelean, C.Craciun Editors, Ed.Risoprint Cluj-Napoca, p.191-193, 1999.

179.Spinu M., Giurgea R., A comparative study on the influence of Calendula officinalis and Echinacea angustifolia alcoholic extractions on the chicken immune organs, Current Problems in Cellular and Molecular Biology, vol.V, C.Craciun, A.Ardelean editors, Ed.Risoprint Cluj-Napoca, pag.180-182, 2000.

180.Spinu M., Giurgea R., Correlations between biochemical indicators of immune organs in chickens treated with Echinacea angustifolia and Calendula officinalis alcoholic extractions, Current Problems in Cellular and Molecular Biology, vol.V, C.Craciun, A.Ardelean editors, Ed.Risoprint Cluj-Napoca, pag.183-185, 2000.

181.Stills HF, Polyclonal antibody production, In:The Biology of the laboratory Rabbit P.J.Manning D.H., Ringler and C.E.Newcomber, eds.Acad.Press, Inc., New York, 435-448, 1994.

182.Stimpel M et al., Macrophage activation and induction of macrophage cytotoxicity by purified polysaccharide fractions from the plant Echinacea purpurea, Infection Immunity, 46:845-9, 1984.

183.Stevens A., Lowe J., Histology.Grower Medical Publ., London, 1992.

184.Suto T, Fukuda S, Moriya N, Watanabe Y, Sasaki D, Yoshida Y, Sakata Y, Clinical study of biological response modifiers as maintenance therapy for hepatocellular carcinoma, Cancer Chemother.Pharmacol., 33:145-8, 1994.

185.Szolomicki j., Samochowic l., Wojcicki J., Drozdzik M., Szolomicki S., The influence of active components of Eleutherococcus senticosus on cellular defence and physical fitness in man, in: Phytother Res, 14 (1):30-5, 2000.

186.Taguchi T, Effects of lentinan in advanced or recurrent cases of gastric, colorectal and breast cancer, Gan To, Kagaku Ryoho, 10(2Pt2): 387-93, 1983.

187.Tamas M, Rosca M, Pop L, Pacurar Pompilia, Izolarea si analiza polizaharidelor imunomodulatoare din Echinacea angustifolia DC, St cerc biochim, 34, 1-2, 49-52, 1991.

188.Tarba C., Orbai P., Honea A., Testing of Allyl alcohol hepatotoxicity of Mitochondrial functional Indices. Hepatoprotective Effect of TROFOPAR and Calcium and Magnesium Gluconolactate, In: Pathological models in toxicological studies, Industrial Head-Office For Medicinal Drugs and Cosmetics, Bucharest, 312-322, 1985.

189.Tarba C., Craciun C., Petrescu I., Apoptotic effect of different xenobiotics at the hepatic level: II. Selected examples, Current problems in Cellular and Molecular Biology, vol.III, C.Craciun, A.Ardelean editors, Ed.Risoprint Cluj-Napoca, pag.46-60, 1998.

190.Tari K, Sataki I, Nakagomi K, Ozawa K, Oowada F, Higashi Y, Negishi T, Yamada T, Saido H, Yoshida K, Effect of lentinan for advanced prostate carcinoma, Hinyokika Kiyo, 40(2): 119-23, 1994.

191.Thompson KD: Antiviral Activity of Viracea Against cyclovir Susceptible and cyclovir Resistant Strains of Herpes simplex Virus, Antiviral Res., 39(1):55-61, Jul, 1998.

192.Timar M., Role of the Liver-Spleen-Adrenal functional Axis in the mechanism of liver Injuries, In: Pathological models in toxicological studies, Industrial Head-Office For Medicinal Drugs and Cosmetics, 272-287, 1985.

193.Timar M., Talos I., Ilica E., Ionescu M., Spleen-Adrenal Activity in Acute Experimentally Induced Liver Injuries in rats, In: Pathological models in toxicological studies, Industrial Head-Office For Medicinal Drugs and Cosmetics, Bucharest, 334-338, 1985.

194.Timar M., Pharmacological bases of relational liver therapy, Edited by the Ministry of Chemical Industry, Bucharest, 1984.

195.Tragni E et al, Evidence from two classic irritation tests for an anti-inflamatory action of a natural extract. Echinacin B, Food Chem.Toxicol., 23:317-9, 1985.

196.Tragni E, Galli CL, Tubaro A, Del Negro P, Della Loggia R. Anti-inflamatory activity of Echinacea angustifolia fractions separated on the basis of molecular weight, Pharmacol. Res. Commun. 20 Suppl 5: 87-90, 1988.

197.Trentham DE, Dynesius-Trentham RA, Orav EJ et al., Effect of oral administration of type II collagen of rheumatoid arthrits. Science, 261:1727-1730, 1993.

198.Tubaro A et al, Anti-inflamatory activity of a polisaccharide fraction of Echinacea angustifolia root, J.Pharm.Pharmacol, 39:567-9, 1987.

199.Turner RB, Riker DK, Gangemi JD, Ineffectiveness of Echinacea for prevention of experimental rhinovirus colds, In: Antimicrob. Agents chemother., 44 (6): 1708-9, 2000.

200.Tyler VE, Brady LR, Robbers JE, Pharmacognosy, 9th ed, Philadelphia:Lea and Febiger, 1988.

201.Vestweber AM, Beuth J, Ko HL, Tunggal L, Buss G, Pulverer G, In vitro activity of Mercurius cyanatus complex against relevant pathogenic bacterial isolates, (Published in German), In: Arzneimittelforschung, 45(9):1018-20, 1995.

202.Violin C, Belgian (Chinese herb) nephropathy:why ?, J.Pharm Belg., 52(1):7-27, 1997.

203.Vonan B., Chard S., Mandalia S., Wilkinson d., Barton SE., Does the extract of the plant Echinacea purpurea influence the clinical course of recurrent genital herpes ?, Int J STD AIDS, 12 (3): 154-158, 2001.

204.Wagner and Proksch, Economic and Medicinal Plant Research, Academic Press, Orlando, 1985, p.113.

205.Wagner et al: In vitro inhibition of arachidonate metabolism by some alkamides and phenylated phenols, Planta Medica, 55:566-7, 1989.

206.Wagner H et al, Immunostimulating Polysaccharides (heteroglycans) of higher plants, Arzneim.Forsch., 35:1069-71, 1985.

207.Wagner H, Jurcic K, Immunologic studies of plant combination preparations. In vitro and in vivo studies on the stimulation of phagocytosis (Published in German), In: Arzneimittelforschung, 41(10):1072-6, 1991.

208.Wagner H, Proksch A, Immunostimulatory Drugs of Fungi and Higher Plants, Economic and Medicinal Plant Research, vol.1, Academic Press, New York, 1985.

209.Wagner H, Proksch A, Riess-Maurer I, Vollmar A, Odenthals, Stuppner H, Jurcic k, Turdu M, Fang JN, Immunostimuliered wirkende Polysaccharide (Heteroglycane) ans hoheren Pflanzen, Arzneim.Forsch., 35:1069-1075, 1985.

210.Wagner H, Stuppner H, Schafer W, Zenk MA, Immunologically Active Polysaccharides of Echinacea purpurea Cell Cultures. Phytochemistry, 27:119-126, 1988.

211.Wekley B.S., A beginner's handbook in biological transmission electron microscopy. Churchill Livingstone, Edinburgh, 1981.

212.Wildfeuer A, Mayerhofer D, The effect of plant preparations on cellular functions in body defense (Published in German), In: Arzneimittelforschung, 43(3):361-6, 1994.

213.Yamakido M, Ishioka S, Hozawa S et al, Effect of Nocardia rubra cell-wal skeleton on cancer prevention in humans. Cancer Immunol Immunother, 34:389-392, 1992.

214.Zhon LG, Zheng GZ, Gan FY et al. Separation and identification of main medicinal saponin components from mass cultures of Panax notaginseng (Burk), F.H.Chen, Yao Hsueh Hsueh Pao, 26:876-880, 1991.

215.Zink, Therese MD, Chaffin MPH, Jodi RPH. Herbal Health Products:What Family Physicians Need to Know, American Family Physician, October 1, 1998.