UTILIZAREA GAZ-CROMATOGRAFIEI IN ANALIZA DOPING

UTILIZAREA GAZ-CROMATOGRAFIEI IN ANALIZA DOPING

1.Introducere

Cromatografia este cel mai comun procedeu de separare utilizat in analiza chimica contemporana. Gaz-cromatografia a fost inventata de A.J.P. Martin care impreuna cu R.L.M. Synge au sugerat posibilitatea inlocuirii fazei mobile lichide din lichid cromatografie cu un gaz potrivit. Ei si-au bazat recomandarea pe faptul ca, difuzia solutului in gaz este mai mare comparativ cu difuzia solutului in lichid, procesul de echilibru implicat in analiza cromatografica poate fi mai rapid si astfel, coloanele sunt mult mai eficiente si timpul de separare mult mai scurt.

Intr-o singura etapa un amestec se separa in componente individuale si simultan se poate estima cantitativ fiecare constituent in parte

2.Principiile gaz-cromatografiei

Principii generale

Cromatografia de gaz este o metoda de separare bazata pe repartitia diferentiata a moleculelor componentilor amestecului de separat intre o faza mobila gazoasa si o faza stationara lichida distribuita uniform pe un suport solid inert - cromatografie de repartitie gaz-lichid, sau o faza stationara solida cu proprietati adsorbante - cromatografie de repartitie gaz-solid[2,3,4].

Indiferent in care din cazurile de mai sus ne situam, componentii amestecului de separat trebuie sa posede o stabilitate termica pronuntata si o temperatura de volatilizare relativ coborata, in general sub 300⁰C, oricum situate sub temperatura de descompunere. Substantele labile din punct de vedere termic ori cu temperaturi de volatilizare foarte inalte nu se poate separa prin cromatografie de gaz.

In cromatografia de gaz, proba este vaporizata si injectata intr-o coloana cromatografica. Eluarea este determinata de debitul gazului inert al fazei mobile. In contrast cu cele mai multe tipuri de cromatografie, faza mobila nu interactioneaza cu moleculele de analit, are doar rolul de transportor al analitului de-a lungul coloanei.

Coloana cromatografica este sediul procesului de separare. Componentele din amestecul de separat interactioneaza cu faza stationara si in functie de constantele de echilibru dintre cele doua faze se produce o diferentiere a vitezelor lor de migrare producandu-se separarea.

Acei componenti cu solubilitate mai pronuntata in faza stationara, vor fi mai puternic retinuti pe coloana cromatografica si deci vor fi eluati mai incet. Componentii mai solubili in faza mobila se vor elua mai repede de pe coloana cromatografica.

Marimi ce caracterizeaza retentia componentului

Retentie. Volum de retentie. Timp de retentie

Un sistem cromatografic consta dintr-o faza mobila si o faza stationara. Solutul situat in sistemul cromatografic este distribuit intre cele doua faze, dar este deplasat de-a lungul sistemului de faza mobila. In consecinta, substanta distribuita de preferinta in faza mobila se deplaseaza mai rapid de-a lungul sistemului decat componentul distribuit in faza stationara. Cel care este distribuit de preferinta in faza stationara spunem ca este "retinut" in faza stationara. Retentia in faza stationara este determinata de existenta fortelor intermoleculare - forte de dispersie, forte polare, forte ionice care exista intre moleculele de solut si acelea ale fazei stationare care sunt mai mari decat fortele intermoleculare care exista intre moleculele de solut si acelea ale fazei mobile . Retentia este masura vitezei de deplasare a substantei in sistemul cromatografic.

Retentia poate fi masurata intr-un numar diferit de moduri. Timpul dintre injectia si elutia maximului picului unui compus este denumit timp de retentie, t_R. Timpul de retentie este acelasi pentru un component pur sau in amestec.

In gaz-cromatografie trebuie sa tinem cont de compresibilitatea fazei mobile gazoase. Volumul de retentie, V_R este volumul de gaz necesar pentru transportul centrului benzii componentului pe intreaga lungime a coloanei

Distanta dintre punctul de injectie si maximul picului inregistrat de computer este denumit distanta de retentie. Retentia solutului in sistemul cromatografic este o caracteristica a solutului si poate fi utilizat la identificarea solutului.

Unde:

Q_C - debitul gazului purtator prin coloana

V_M - volumul de gaz purtator prezent in coloana cromatografica

t_M - timpul necesar traversarii frontului de gaz purtator prin coloana cromatografica

Procesul de repartitie

Faza mobila si faza stationara tind intotdeauna spre starea de echilibru. Modul in care moleculele unui component din amestecul de separat se repartizeaza intre faza mobila si cea stationara este descris de constanta de repartitie K, definita de relatia

Unde:

c_S - concentratia componentului in faza stationara

c_M - concentratia componentului in faza mobila

n_S - numarul de moli de component in faza stationara

n_M - numarul de moli de component in faza mobila

V_S - volumul fazei stationare

V_M - volumul fazei mobile

Cu cat K creste cu atat timpul de separare a solutului este mai lung.

3.Partile componente ale unui gaz-cromatograf

Componentele de baza sunt prezentate in figura 1. Urmeaza o descriere a fiecarei parte componente in parte.

Fig.1. Schema de functionare a unui gaz-cromatograf

3.1.Gazele de rezerva

In functie de detectorul ales sunt implicate un numar diferit de gaze. De exemplu, pentru detectorul cu ionizare in flacara, FID si detectorul specific azot/fosfor, NPD este necesar hidrogenul, drept gaz de ardere, aer/oxigen drept gaz de intretinere a arderii si azot, hidrogen, heliu sau alt gaz inert ca faza mobila.

Azotul este utilizat drept gaz purtator in cazul utilizarii detectorului cu ionizare in flacara, FID si detectorului termoionic, NPD. De obicei, drept gaz de transport se utilizeaza un gaz inert, heliu datorita vitezei mari de transport a particulelor de-a lungul coloanei. De asemenea, se mai utilizeaza si hidrogenul care are proprietati bune ca si gaz purtator.

In figura 2 este prezentata relatia dintre viteza de curgere functie de tipul de gaz purtator utilizat. Determinarile au fost efectuate utilizand aceeasi coloana si aceeasi proba.

Fig.2. Viteza de curgere functie de tipul de gaz purtator

Alegerea tipului de gaz purtator influenteaza rezolutia asa cum se vede din figura 3. Astfel, in cazul utilizarii azotului drept gaz purtator, cei doi compusi nu sunt separati, rezolutia creste odata cu utilizarea heliului si este foarte buna in cazul utilizarii hidrogenului drept gaz de transport.

Fig.3. Gazul purtator si rezolutia

Generatorul de aer de puritate ridicata este de un compresor de aer dotat cu filtru de 0.5mm pentru indepartarea urmelor de ulei si apa si un filtru de celuloza de 0.01mm care retine impuritatile.

Generatorul de azot este de fapt acelasi compresor de aer. Azotul obtinut contine mai putin de 0.5ppm oxigen, mai putin de 0.5ppm vapori de apa si mai putin de 2.0ppb halocarbonati sau hidrocarbonati.

Generatorul de hidrogen. Hidrogenul este generat electrolitic din apa pura deionizata. Se obtine hidrogen de inalta puritate, de 99.999% puritate.

Gaz-cromatografele moderne sunt echipate cu aparate de control electronic al presiunii gazelor si cu aparate de masurare a debitului controlate electronic care mentine debitul la nivelul dorit[6].

3.2.Sistemul de injectie

Pentru o buna precizie si acuratete a analizei gaz-cromatografice este necesara o injectie a probei cat mai exacta si reproductibila. Pentru o buna eficienta a coloanei este necesar ca proba sa aiba marimea potrivita si sa fie introdusa cu viteza adecvata si constanta sub forma de "spray" de vapori. O viteza de injectie mica a probei determina o rezolutie de separare slaba (figura 4).

Fig.4.Modul de injectie lent/rapid

Cea mai comuna metoda de injectie implica utilizarea unei microseringi care injecteaza proba lichida sau gazoasa printr-un septum la capatul coloanei. Initial se utiliza injectia manuala a probei. Se utiliza o microseringa cu care era injectat manual de catre operator un volum dat. Rezultatele nu erau intotdeauna reproductibile.

Odata cu dezvoltarea tehnicii analitice s-a trecut la utilizarea unui sistem de injectie performant care aducea in plus injectia automata a probei, injectie controlata electronic din softul sistemului cromatografului de gaze. Autoinjectorul este prevazut cu un sistem optic pentru masurarea exacta a volumelor de proba injectate, eliminand erorile de masurare ce apar la volume foarte mici in injectia manuala.

In cazul probelor lichide, temperatura portului de injectie trebuie sa fie cu peste 50⁰C peste punctul de fierbere al componentului cel mai putin volatil din proba astfel incat intregul volum de proba sa fie vaporizat. In figura 5 este prezentat portul de injectie al unui sistem GC.

Fig.5. Portul de injectie

Utilizarea coloanelor capilare care necesita volume de proba foarte mici, de aproximativ 10^-3l a impus utilizarea sistemului de injectie cu splitare. Astfel, in coloana cromatografica se introduce o fractie stabilita din proba, restul este indepartat.

De asemenea, utilizarea unui sistem de injectie automata, injectie controlata electronic din softul sistemului permite setarea automata a capacitatii seringii, volumului de injectie, a modului de injectie splitt/splittless. Pentru o injectie cat mai reproductibila se pot stabili un numar de pompari ale pistonului seringii inainte de injectia propriu-zisa. De asemenea, se seteaza automat modul de spalare a seringii, pre sau postinjectie precum si numarul de spalari cu solvent A sau B sau chiar proba[6,7].

3.3.Coloane gaz-cromatografice si faze stationare

Coloane gaz- cromatografice

Cea mai importanta componenta a unui sistem cromatografic este reprezentata de coloana cromatografica de separare. Coloana cromatografica separa amestecul in componenti.

Factorii care influenteaza separarea unui amestec multicomponent sunt

-alegerea fazelor, a fazei mobile si a fazei stationare

-dimensionarea coloanei, lungimea si diametrul intern al coloanei

-tipul si viteza gazului purtator

- temperatura coloanei

-umplutura coloanei, faza stationara, grosimea filmului

Coloanele utilizate in gaz-cromatografie sunt

-coloane cu umplutura, impachetate

-coloane capilare, coloane tubulare deschise

Coloane cu umplutura, impachetate

Coloanele impachetate sunt coloanele in care faza stationara este un film subtire de lichid adsorbit pe suprafata unui solid inert fin divizat.

Coloanele impachetate sunt coloane cu diametrul interior cuprins intre 2 - 8mm, cele mai utilizate sunt cele cu diametru interior de 4mm. Sunt confectionate din cupru, alama, otel inox, aluminiu, nichel, cuart, teflon. Lungimea acestoara poate varia de la cativa zeci de metri la cativa metri

Primele incercari gaz-cromatografice in analiza doping au fost efectuate pe coloane impachetate in anii 60 - 70, cand a fost dezvoltata procedura screening pentru substante doping volatile, substante apartinad clasei stimulentelor

Coloanele impachetate au o capacitate mai mare de proba, insa performantele de separare a coloanelor capilare sunt net superioare (figura 6).

Fig.6. Eficacitatea coloanelor GC

Coloane capilare, coloane tubulare deschise

Coloanele capilare sunt coloanele in care faza stationara este un film de lichid de cativa micrometri grosime, 0.1-1.0mm uniform distribuit care imbraca peretii interiori ai unui tub capilar cu diametru interior de 100 - 500mm.

Coloanele capilare cu toate ca au eficacitate ridicata, au 300.000 talere teoretice, dupa inventarea lor timp de 2 decenii nu au fost utilizate pentru ca

au capacitate mica,

fragilitatea coloanei,

probleme mecanice asociate cu introducerea probei si conectarea coloanei la detector,

dificultati in obtinerea uniforma si reproductibila a stratului de lichid dispus pe interiorul coloanei,

timp de viata scurt a coloanelor pregatite prost,

tendinta de infundare a coloanei.

In anii 1970 aceste probleme au fost rezolvate si cateva companii de instrumente au inceput sa le ofere la un pret rezonabil.

Coloane tubulare deschise sunt de doua tipuri

- coloane tubulare deschise cu perete imbracat, wall-coated, WCOT

- coloane tubulare deschise cu suport imbracat, support-coated, SCOT

Coloanele tubulare deschise cu perete imbracat sunt tuburi capilare simple imbracate cu un strat subtire de faza stationara.

In coloanele tubulare deschise cu suport imbracat, pe suprafata interioara a tubului capilar este dispus un film subtire de aproximativ 30μm a unui suport material. Acest tip de coloana este mult mai rezistent si are o capacitate a probei mai mare.

In general, eficienta coloanelor tubulare deschise cu suport imbracat, SCOT este mai mica decat a coloanelor tubulare deschise cu perete imbracat, WCOT dar semnificativ mai mare decat a coloanelor impachetate.

Primele coloane tubulare deschise cu perete imbracat, WCOT au fost confectionate din otel inoxidabil, aluminiu, cupru, plastic sau sticla. Sticla a fost utilizata pentru determinarea acidului clorhidric gazos, a acidului clorhidric concentrat si a fluorurii acide de potasiu.

Noile coloane tubulare deschise cu perete imbracat au aparut in 1979, coloane tubulare deschise din silice topita, coloane FSOT.

Tuburile capilare din silice topita sunt dintr-o silice speciala, care contine cantitati mici de oxizi metalici. Aceste tuburi capilare au pereti de finete mare. Tuburile sunt imbracate pe dinafara cu un strat de poliamide protectoare. Rezulta o coloana flexibila si cu diametru interior de cativa m. Coloanele tubulare deschise din silice au cateva avantaje, au rezistenta mare, au reactivitate mica la componentele probei si au flexibilitate. Pentru multe aplicatii, ele au inlocuit vechile coloane WCOT.

Cele mai utilizate coloane capilare din silice au diametru interior de 320 - 260μm. Coloanele cu rezolutie mare sunt cele cu diametru intre 200 - 150 μm. Acestea sunt greu de utilizat deoarece pot determina defectiuni ale sistemului de injectie probe si la sistemul de detectie al cromatografului. Splitarea probei este utilizata pentru reducerea marimii probei injectate si pentru mai multa sensibilitate a detectorului si de asemenea, pentru raspunsul rapid in timp al detectorului[6].

Faze stationare

In cazul cromatografiei de repartitie gaz-lichid trebuie luat in discutie cuplul faza stationara - suport solid inert.

Fazele stationare lichide prezinta structuri chimice diverse, adecvate naturii componentilor amestecului de separat. Proprietatile necesare pentru faza lichida depusa pe coloana gaz-cromatografica

1. Volatilitate scazuta, ideal ar fi ca punctul de fierbere al lichidului sa fie mai mare de 100⁰C fata de temperatura maxima de operare a coloanei
2. Stabilitate termica
3. Inertie chimica
4. Factorii de retentie ai componentilor probei sa fie intr-un domeniu potrivit.

Timpul de retentie al unui solut pe coloana depinde de constanta de distributie a acestuia. Faza lichida depusa genereaza constante de distributie diferite pentru soluti diferiti. In plus, aceste constante trebuie sa nu fie mari sau mici deoarece un timp de retentie prea lung sau prea scurt determina o separare incompleta.

Pentru a avea un timp de retentie rezonabil, componentii probei trebuie sa aiba o oarecare compatibilitate cu faza stationara indeosebi in ceea ce priveste polaritatea. Polaritatea este reprezentata de campul electric din imediata vecinatate a moleculelor si este masurata prin momentul de dipol al speciilor.

Fazele stationare polare contin grupe functionale ca, -CN, -CO, -OH. Fazele stationare de tipul C-hidro si dialchil siloxani sunt nepolare, fazele cu poliesteri au polaritate ridicata. Alcoolii, acizii, aminele sunt solutii polare eterii, cetonele si aldehidele au polaritate medie. Hidrocarburile saturate sunt nepolare. In general, polaritatea fazei stationare trebuie sa se potriveasca cu cea a componentelor probei. Cand polaritatea este asemanatoare, ordinea de elutie este determinata de punctele de fierbere ale eluantilor[6].

Suportul fazei stationare

In cazul cromatografiei de repartitie gaz-lichid, faza stationara lichida este depusa pe un suport solid care are rolul de a retine faza stationara lichida si formarea unei interfete mari eluent-faza stationara, fara sa interactioneze cu componentii probei.

Ca suport se utilizeaza pamanturi diastereoatomice sau Kieselgur in stare amorfa hidratata, cu o structura      foarte poroasa si care contin oxizi de aluminiu, fier, magneziu, calciu, sodiu, potasiu

Cateva faze stationare cunoscute si utilizate

In tabelul 1 sunt prezentate faze stationare pentru coloane gaz-cromatografice impachetate si capilare in ordinea cresterii polaritatii. Aceste 6 lichide pot avea o capacitate de separare a probei de 90 sau mai mare.

Tabel 1. Cateva faze stationare cunoscute si utilizate in cromatografia de repartitie gaz-lichid

5 din aceste lichide sunt polidimetilsiloxani cu structura generala

Cand toti R- sunt -CH₃ faza lichida este nepolara. Odata cu introducerea substituentilor R-,

-C₆H₅, fenil, C₃H₆CN, cianopropil, -C₃H₆CF₃, trifluorpropil creste polaritatea lichidului

Pelicula de faza stationara lichida, Grosimea filmului

Pentru obtinerea unei coloane cu eficienta mare si cu selectivitate adecvata, cea mai importanta operatie este depunerea pe peretii interiori ai coloanei a unei pelicule lichide de faza stationara

Coloanele cele mai bune au faze stationare cu grosimea filmului 0.1-5μm. Grosimea filmului are efect asupra caracterului de retentie si a capacitatii coloanei.

Filmul subtire este utilizat pentru analiti foarte volatili deoarece aceste filme retin solutul un timp indelungat, marind timpul de separare. Separarea speciilor cu volatilitate mica se realizeaza intr-un timp rezonabil. Pentru cele mai multe aplicatii grosimea filmului recomandat este de 0,26μm

Adsorbtia pe coloane impachetate sau pe peretii capilari ai coloanei tubulare deschise

O problema in gaz-cromatografie o reprezinta procesul de adsorbtie fizica a speciilor analitice polare sau polarizabile ca alcoolii sau hidrocarburile aromatice pe suprafetele silicate ale coloanelor impachetate sau pe peretii capilari ai coloanelor capilare deschise. Rezultatul unei adsorbtii necorespunzatoare este prezent in forma picurilor, picuri deformate, picuri cu cozi. Suprafetele cu silicati hidroxilati au urmatoarea structura

Grupurile SiOH au o puternica afinitate pentru moleculele organice polare. Pentru evitarea fenomenelor de adsorbtie este bine ca gruparile hidroxi, -OH superficiale ale suportului solid si ale fazei stationare sa fie silanizate. Astfel, materialul suport poate fi dezactivat prin silanizare cu dimetilclorsilan, DMCS[2,6]. Reactia este:

Apoi, prin spalare cu metanol, clorul este inlocuit cu grupul metoxi, -OCH₃

Silicele topit utilizat la obtinerea coloanelor capilare este fara acest tip de impuritati.

3.4.Configurarea coloanei si a temperaturii cuptorului

In cromatografia de gaze se cunosc doua tipuri de coloane coloane impachetate si coloane capilare. Coloanele impachetate au fost inlocuite de mai eficientele si rapidele coloane capilare, cu exceptia aplicatiilor speciale care necesita utilizarea coloanelor impachetate.

Coloanele cromatografice pot avea lungimi de la mai putin de 2 metri pana la 50 metri sau mai mult. Ele sunt contruite de otel, sticla, siliciu topit sau teflon si sunt incolacite in spire de 10 - 30cm pentru a putea fi introduse in cuptorul gaz-cromatografului.

Temperatura coloanei este o variabila importanta ce trebuie controlata pentru precizia rezultatelor. De asemenea, rezolutia depinde de temperatura. In general, rezolutia optima este asociata cu temperaturi minime. Pentru obtinerea de rezultate optime, coloanele sunt de obicei introduse intr-un cuptor termostat. Temperatura cuptorului GC poate fi programata pentru a optimiza separarea si rezolutia componentilor probei. Controlul precis al temperaturii cuptorului este esential pentru reproductibilitatea cromatogramei. Temperatura optima a coloanei depinde de punctul de fiebere al probei si de temperatura de separare necesara, de gradul de separare dorit. Temperatura coloanei este setata la valori putin peste media punctului de fiebere a probei obtinandu-se un timp de elutie rezonabil, de la 2 la 30 minute

Rezolutia caracterizeaza modul de separare a componentilor unui amestec de separat, este direct corespunzatoare cu timpul dintre picuri si latimea acestora asa cum se vede din figura 7. Eficienta coloanei si selectivitatea ei sunt date de o rezolutie buna sau mai putin buna

Fig.7. Influenta separarii si a latimii picului asupra rezolutiei

In tabelul 2 sunt prezentate cateva cauze care pot interveni in scaderea rezolutiei datorita aparitiei problemelor de separare precum si solutiile practice care pot fi aplicate.

Un alt mod de marire a rezolutiei este acela de a actiona in sensul reducerii latimii picului, tabel 3.

Tabel 2. Scaderea rezolutiei datorita aparitiei problemelor de separare.

Tabel 3. Scaderea rezolutiei datorita cresterii latimii picului.

Conditii izoterme de temperatura

In conditii izoterme de analiza a unui amestec se constata ca primii componenti care ies din coloana dau picuri inguste si apropiate, suprapuse uneori, pe cand componentii mai putin volatili care necesita temperaturi de vaporizare mari, dau picuri mult mai late si care uneori nu sunt eluati, raman pe coloana.

Aceste probleme au fost rezolvate prin utilizarea unui program de temperatura, temperatura coloanei variaza in timp dupa un anumit program bine stabilit. Prin programarea temperaturii, separarea amestecului se realizeaza intr-un timp mai scurt si cu o rezolutie mai buna. Cromatografele sunt prevazute cu dispozitive electronice de programare a temperaturii

Programul de temperatura intr-o singura rampa

Se poate lucra in conditii combinate, izoterm intr-un anumit interval de timp, urmat de un program de temperatura. Sistemul Agillent GC-NPD din dotarea laboratorului permite programarea temperaturii cuptorului de la o temperatura initiala la o temperatura finala utilizand sase rampe de temperatura pentru o singura injectie.

Utilizarea unui program intr-o singura rampa se realizeaza prin programarea temperaturii cuptorului de la o temperatura initiala la o temperatura finala cu o rata de crestere specifica. Pe temperaturile initiale si finale cuptorul va fi setat sa ramana pentru o perioada de timp

Fig.8. Programul de temperatura intr-o singura rampa

Programul de temperatura multi-rampa, rampa multipla

Pentru probele care acopera un domeniu de temperaturi de fierbere este bine de utilizat un program de temperatura, temperatura coloanei creste continuu in trepte odata cu procesul de separare. Programul de temperatura multi-rampa este similar cu programul de temperatura intr-o singura rampa, programarea cuptorului de la o temperatura initiala la o temperatura finala se realizeaza cu variatia ratei, timpului si temperaturii intre ele. Rampa multipla poate fi programata pe temperaturi descrescatoare ca si crescatoare

Fig.9. Programul de temperatura multi-rampa

3.5. Sistemul de detectie

Dupa coloana cromatografica, detectorul constituie cea mai importanta parte componenta a unui sistem cromatografic. Detectorul trebuie sa deosebeasca o proprietate oarecare a componentului de detectat fata de gazul purtator.

Detectorii sunt clasificati in

Detectori universali, detectori sensibili la un numar mare de compusi,

Detectori specifici, detectori cu sensibilitate ridicata pentru un numar restrans de compusi

Caracteristicile detectorului ideal in gaz-cromatografie sunt[2,6]:

1. Sensibilitate adecvata. Sensibilitatea detectorului trebuie sa fie cat mai mare pentru a detecta compusi in concentratii cat mai mici (analiza de urme) la injectarea de probe de volume mici.

2. Buna stabilitate si reproductibilitate. Linia de fond si reproductibilitatea rezultatelor analitice sa fie cat mai putin afectate de conditiile de lucru de temperatura, presiune, debit, etc.

3. Raspuns liniar la solut. Liniaritatea. Sensibilitatea detectorului sa ramana constanta intr-un domeniu larg de concentratii.

4. Performante ridicate pe un domeniu de temperatura larg, de la temperatura camerei la 400⁰C.

5. Viteza de raspuns a detectorului sa fie cat mai mare. Timpul de raspuns a detectorului sa fie cat mai scurt si totodata independent de rata debitului.

6. Siguranta ridicata in exploatare, sa fie usor de utilizat. De asemenea, robustete in utilizare. Astfel, detectorul trebuie sa poata fi utilizat si de un operator neexperimentat.

7. Similaritate in raspuns fata de toti solutii sau alternativ o precizie ridicata sau raspuns selectiv fata de una sau mai multe clase de solut.

8. Nedistructiv daca se poate.

9. Limita de sensibilitate ridicata. Sensibilitatea reprezinta cantitatea minima de substanta la care se obtine un semnal.

Limita de detectie. Aceasta depinde de sensibilitate, in sensul ca o sensibilitate mai ridicata duce la o limita de detectie mai coborata. In analiza de urme este necesar un detector de sensibilitate ridicata. In figura 10 sunt prezentate sensibilitatea si domeniul de raspuns pentru detectorii GC.

Fig.10. Detectori GC - Sensibilitate si domeniu de raspuns

Detectori GC

Detectorii utilizati in gaz-cromatografie sunt:

Detectorul cu ionizare in flacara

Detector de conductivitate termica

Detector de chemiluminiscenta

Detector cu captura de electroni

Detector cu emisie atomica

Detector cu ionizare termoalcalina, termoionic, specific azot/fosfor

Detector cu fotoionizare

Detector flame fotometric

Cei mai utilizati detectori in gaz-cromatografie sunt prezentati impreuna cu caracteristicile lor in tabelul 4

Tabel 4. Caracteristicile de performanta ai celor mai utilizati detectori in gaz-cromatografie

Vom descrie cei mai utilizati detectori din gaz-cromatografie utilizati in analiza doping.

Detectorul cu ionizare in flacara, FID

Reprezinta primul detector utilizat in analiza doping. FID-ul este cel mai utilizat detector GC, avand o gama larga de utilizare, o sensibilitate ridicata si cu exceptia catorva compusi cu mase moleculare mici, sunt detectate toate substantele cu continut in carbon

Teoria operarii

FID utilizeaza flacara produsa de arderea hidrogenului si aerului. Efluentul din coloana este introdus in flacara, unde componentele amestecului organic sunt arse formand ioni. Ionii pozitivi sunt atrasi de catre electrodul polarizat producand un curent slab. Curentul este amplificat de un electrometru si produce un raspuns care este proportional cu concentratia probei prezente in flacara, a atomilor de carbon prezenti in flacara per unitate. Astfel, detectorul este mass/sensitive [1,9].

Pentru functionare, detectorul cu ionizare in flacara are nevoie de trei gaze de rezerva. Gazele utilizate sunt: hidrogenul pentru combustie, heliu sau azotul gazul purtator si oxigenul sau aerul ca agent de intretinere a arderii. Detectorul este introdus intr-un cuptor termostatat ceea ce asigura ca solutul nu va fi condensat pe tuburile componente

Design-ul FID-ului si configurarea electrodului

Detectorul este format dintr-un senzor si electronica asociata. Electronica asociata senzorului FID consta dintr-o sursa de voltaj ridicat si un amplificator de impedanta ridicata. Jetul si electrodul sunt conectate la o sursa de putere.

Corpul si electrodul cilindric este confectionat de obicei din otel inoxidabil

Diagrama unui senzor FID este prezentata in Figura 11.

Fig.11. Schema de principiu a detectorului cu ionizare in flacara

In analiza doping, detectia substantelor dopante a fost dezvoltata incepand cu 1969, odata cu pregatirea controlului doping pentru Jocurile Olimpice de la Mnchen din 1972. Pentru detectia compusilor din clasa stimulentelor, a compusilor volatili cu azot excretati liberi in urina, tehnica utilizata a fost, pentru inceput, gaz-cromatografia cu detector de ionizare in flacara, FID.

Cromatograma unui amestec de calibrare, Fig. 12, demonstreaza sensibilitatea procedurii de identificare a compusilor din clasa stimulentelor volatile, astfel doar 20ng din fiecare compus genereaza un semnal cromatografic. Trebuie mentionat ca in realizarea acestor prime analize s-au utilizat coloane impachetate

Fig.12. Cromatograma GC-FID a unui amestec etalon de stimulente volatile: (1)heptaminol, (2)amfetamina, (3)metamfetamina, (4)dimetamfetamina, (5)nicotina, (6)efedrina, (7)fenmetrazina, (8)niketamida, (9)pentilentetrazol, (10)SI-difenilamina, (11)cafeina

Detectorul specific azot/fosfor, NPD

In continuare, odata cu dezvoltarea tehnicilor cromatografice, pentru marirea preciziei analizei functie de compusii de detectat, s-a trecut la utilizarea detectorilor specifici.

Detectorul cu ionizare termoalcalina este un detector specific pentru compusii cu azot si fosfor cu sensibilitate ridicata. In prima sa varianta, acest detector a fost numit detector cu ionizare in flacara alcalina. Detectorul cu ionizare in flacara se bazeaza pe modificarea conductibilitatii electrice a gazelor in prezenta unor particule incarcate electric. La temperatura si presiune normala, gazele aflate intre doi electrozi incarcati electric sunt un mediu perfect izolator. Daca in gaz apar particule incarcate electric, ele se vor deplasa in campul electric dintre electrozi si gazul va conduce curentul electric. Acest efect apare chiar pentru cantitati foarte mici de molecule ionizate . Ca disaign este asemanator cu detectorul cu ionizare in flacara. Fizic, senzorul detectorului arata similar cu cel al FID-ului, dar de fapt, opereaza dupa principii diferite Gazul purtator din coloana capilara, azotul se amesteca cu un debit riguros controlat de hidrogen introdus la baza coloanei. Aerul, sau oxigenul se introduce direct in celula de detectie [10].

Detectorul termoionic este un detector care utilizeaza pentru ionizarea substantelor analizate, caldura produsa de o rezistenta electrica inglobata intr-o capsula de ceramica in care a fost distribuita uniform o sare a unui metal alcalin, rubidiu sau cesiu. Pastila este situata deasupra jetului de gaz purtator, azot amestecat cu hidrogen. Gazul fierbinte este dispus in jurul pastilei electrice incalzite de silicat de rubidiu care este mentinuta la 180V. Pastila incalzita formeaza o plasma care are temperatura intre 600-800⁰C. Incalzirea pastilei alcaline duce la producerea de electroni prin emisie termoionica. Se obtin un numar neobisnuit de mare de ioni de la moleculele cu continut in azot si fosfor . Se formeaza un curent proportional cu numarul de ioni colectati. Acesta este preluat de un electrometru, si rezulta un curent masurat care este convertit intr-un semnal digital sub forma unei cromatograme.

Debitul de hidrogen trebuie riguros controlat deoarece raspunsul detectorului cu ionizare termoionica depinde de concentratia atomilor de hidrogen din jurul pastilei alcaline. La detectorul NPD debitul de hidrogen si aer sunt mai joase decat la FID, minimizand ionizarea normala a hidrocarbonatilor si crescand ionizarea compusilor cu azot si fosfor. Sursa termoionica eficientizeaza ionizarea compusilor organici ce contin azot si fosfor. Detectorul NPD are o mare sensibilitate pentru compusii cu azot si fosfor, astfel de circa 10^-12g/ml pentru fosfor si 10^-11g/ml pentru azot. Cresterea debitului de hidrogen a dus la cresterea raspunsului dat de detector pentru compusii care contin fosfor in molecula si la o scadere a raspunsului pentru compusii cu azot in molecula. Variatii de numai 0,05% ale debitului de hidrogen conduc la modificari ale curentului de ionizare de 1%. Din acest motiv se impune folosirea unor debite constante de hidrogen [6,10].

Descompunerea si procesul de ionizare al probei are loc la suprafata pastilei alcaline. Temperatura pastilei alcaline se regleaza electronic intr-un domeniu cat mai ingust deoarece temperatura influenteaza procesul de ionizare si ca atare sensibilitatea si zgomotul de fond. Temperatura sursei alcaline trebuie mentinuta la o valoare cat mai joasa pentru a obtine un semnal stabil si un timp de functionare cat mai mare.

Sarurile alcaline de rubidiu sunt uniform distribuite in pastila de ceramica astfel incat detectorul termoionic are un timp mai mare de functionare si o foarte buna stabilitate a liniei de baza[3,4,10].

Schema de principiu a detectorului termoionic NPD este prezentata in figura 13.

Fig.13. Schema de principiu a Detectorului termoionic NPD.

Cel mai mare dezavantaj al acestui detector este deteriorarea in timp. Reese a examinat performanta detectorului. Sarea alcalina este un silicat si Reese arata ca pierderea in raspuns a fost datorata vaporilor de apa de la combustia hidrogenului, care duce la transformarea silicatului alcalin in hidroxi silicati si silicati liberi. La operarea la temperatura normala a pastilei, hidroxidul alcalin are o presiune de vapori semnificativa si in consecinta, rubidiu sau cesiu este continuu pierdut in timpul operarii detectorului. In cele din urma toata sarea este evaporata, pastila ajungand un silicat inactiv. Aceasta este o problema inerenta pentru toti detectorii azot/fosfor si este rezultatul transformarii sarii la utilizarea continua a detectorului

Daca detectorul azot/fosfor este inchis pentru o lunga perioada de timp in mediu cu umiditate ridicata, apa se poate acumula pe pastila, de aceea este necesar ca la deschiderea sistemului, sa se mentina timp de 30 minute pastila la temperatura de 100⁰C si apoi pentru inca 30 minute la temperatura de 150⁰C

Parametrii optimi de functionare ai detectorului termoionic

In tabelul 5 sunt listate principalele elemente de operare al detectorului NPD, informatii asupra debitului de gaz utilizat, a temperaturii de functionare a detectorului precum si a caracteristicelor de functionare a pastilei ceramice de rubidiu.

Tabel 5. Parametrii caracteristici de functionare optima a detectorului termoionic

Presiunea gazelor

Functie de debitul ales, se identifica presiunea gazelor si se seteaza presiunea sursei mai mari de10psi (70KPa). Relatia dintre presiune si debit pentru gazele utilizate de detectorul termoionic, la 25⁰C si presiunea de 1 atmosfera sunt prezentate in Fig. 14

Fig.14 Relatia dintre presiune si debit pentru gazele utilizate de detectorul termoionic

Demonstrarea selectivitatii detectorului specific de azot

Raspunsul specific al NPD la azot si fosfor, impreuna cu o sensibilitate ridicata, a impus utilizarea acestui detector la analizele multor probe farmaceutice si de mediu. Determinarile se fac pana la un nivel de urme de 500pg. O alta aplicatie interesanta a NPD este analiza GC a unor medicamente de baza

Pentru demonstarea selectivitatii detectorului azot/fosfor, in sistemul cromatografic s-a injectat o proba ce contine un amestec de N,N-diisopropil-amino-alcani impreuna cu alcanii tetradecan (C₁₄) si tetracorane (C₂₄), de concentratie 1mg/ml. Din Fig.15, se observa ca doar compusii cu azot prezinta un semnal pozitiv. Spre deosebire de seria de omologi de N,N-diisopropil-amino-alcani, cei doi alcani, tetradecan (C₁₄) si tetracorane (C₂₄) prezinta picuri negative. Astfel, compusii fara azot (sau fosfor) sunt suprimati in proportie de 1 Trebuie mentionat ca extractele alcaline nu contin nici un compus cu fosfor

Fig.15. Selectivitatea detectorului specific de azot, detectarii compusilor continand azot

4. Aplicatiile gaz-cromatografiei in analiza doping. Evaluarea datelor analitice

In primul rand, gaz-cromatografia este o metoda performanta de separare a componentilor unui amestec complex de specii volatile, de exemplu compusi ai clasei stimulentelor volatile sau specii care necesita derivatizarea, de exemplu compusi apartinand claselor doping: stimulente greu volatile, narcotice, steroizi anabolici androgeni etc., pentru cresterea volatilitatii. Timpul sau volumul de retentie sunt utilizate in identificarea calitativa a speciilor mai sus mentionate. In al doilea rand, inaltimea sau aria picului permite determinarea cantitativa a speciilor.

In cele ce urmeaza vom prezenta aplicatiile practice specifice controlului doping ale gaz-cromatografiei cu detector azot-fosfor, GC- NPD.

Gaz-cromatografia cu detector azot-fosfor este utilizata pentru screening-ul substantelor dopante din clasa stimulentelor volatile

Din punct de vedere farmacologic, stimulentele sunt clasificate astfel:

Stimulente psihomotoare : amfetamina, cocaina, pemolina

Amine simpaticomimetice: efedrina si derivatii

Stimulente ale sistemului nervos central: cafeina, etamivan, crotetamida

Stimulentele sunt o clasa de medicamente care actioneaza asupra activitatii creierului[12,13,14,15,16,17]. Sportivii sunt tentati sa utilizeze stimulentele pentru efectul lor similar cu cel al adrenalinei secretate de organismul uman de a induce:

stare de agitatie exacerbata;

energie debordanta;

cresterea atentiei;

cresterea competitivitatii si agresiunii;

diminuarea starii de oboseala

Din punct de vedere farmacologic, stimulentele sunt utilizate:

in tratamentul astmului si altor probleme respiratorii;

in tratarea obezitatii pentru suprimarea apetitului;

in tratamente neurologice, in tratarea depresiilor, etc.

Intrebuintarea gresita a stimulentelor poate determina:

cresterea presiunii sangelui

ritm rapid si neregulat al batailor inimii

hipertensiune, dureri in piept

suprimarea respiratiei

stari de voma, halucinatii, delir

agresiune si anxietate

scaderea capacitatii de jedecata, intreprinderea de actiuni cu risc nejustificat

psihoze, tendinte de suicid, pierderea memoriei

crampe musculare

blocaj renal si probleme respiratorii

probleme psihologice permanente

risc cardiovascular si atac de apoplexie letal

scaderea apetitului

ostilitate si paranoia

Cum actioneaza stimulentele

O doza mare de stimulente poate avea ca rezultat ridicarea temperaturii corpului si aparitia batailor de inima neregulate. Abuzul de stimulente va face dificila revenirea la normal a organismului dupa efort.

De asemenea, acestea pot determina deshidratarea cu reducerea circulatiei sangvine. Inima va munci din greu pentru ca sangele sa parcurga intreg corpul si in acelasi timp deshidratarea va face ca acest proces sa fie si mai intens. Daca ai noroc, aceasta faza este doar temporara. Nu toata lumea este norocoasa, riscul de accident cardiovascular este mare[12,13].

In sport, performanta se obtine doar printr-un antrenament sustinut, bine directionat, substantele dopante administrate nejustificat duc doar la efecte nocive asupra sanatatii sportivului si sunt drastic sanctionate de catre forurile competente[18].

Metodele analitice utilizate pentru detectia substantelor dopante sunt bazate exclusiv pe structura chimica a acestor substante. Astfel, din punct de vedere al modului de pregatire a probelor si de analiza a compusilor, substantele mai sus mentionate se clasifica astfel[8,11]:

Compusi volatili cu azot excretati liber in urina

Compusi greu-volatili cu azot excretati conjugati ca sulfati sau glucuronati

Stimulente cu structura si proprietati chimice speciale

Analiza calitativa

Cromatografia de gaz cu detector azot-fosfor este utilizata pentru identificarea substantelor doping volatile cu azot. Aceasta tehnica analitica a cunoscut o evolutie in timp. Aplicarea acestei tehnici la substantele dopante a fost dezvoltata in 1969 de catre laboratorul de control din Koeln. Primele incercari de detectie a substantelor doping volatile au fost efectuate pe sisteme cromatografice cu coloane impachetate si detector cu ionizare in flacara. Introducerea coloanelor capilare care au o rezolutie ridicata, o putere de separare net imbunatatita fata de coloanele impachetate, precum si imbunatatirea modului de introducere a probei prin sistemul automat de injectie a probei split/plitless a dus la imbunatatirea sensibilitatii analizei[8,18,19]. De asemenea, odata cu utilizarea detectorului specific de azot/fosfor, a crescut si selectivitatea analizei efectuate. Astfel, prin utilizarea detectorului specific de azot/fosfor doar compusii care contin in molecula azot si fosfor prezinta un semnal pozitiv in cromatograma obtinuta.

Cromatograma pentru un amestec etalon obtinut prin analiza screening GC-NPD a unui amestec etalon de stimulente volatile este prezentata in figura 16[20].

Fig.16. Cromatograma GC/NPD a unui amestec etalon:(1)heptaminol,(2)amfetamina, (3)fentermina,(4)metamfetamina,(5)etilamfetamina,(6)N,N-dimetilamfetamina, (7)mefentermina,(8)catina/norefedrina,(10)efedrina/pseudoefedrina,(11)metilefedrina, (12)fenmetrazina,(13)fendimetrazina, (14)3,4-metilendioximetamfetamina, (16)pentetrazol, (17)bupropion, (18)fenproporex, (19)prolintan, (20)fencamfamina, (21)crotetamida, (22) metilfenidat, (24)DIPA 12, (25)cafeina, (26)clobenzorex, (27)metadona, (28)pentazocina, (29)bromantan, (30)fenetilina.

Pentru fiecare substanta de analizat se stabilesc parametrii cromatografici caracteristici, timpul de retentie, (t_R) prin compararea timpului de retentie al substantei de analizat cu timpul de retentie al substantei de referinta si timpul de retentie relativ, (t_RR) prin raportarea timpului de retentie al compusului la timpul de retentie al standardului intern. In gaz-cromatografie, timpul de retentie al substantei de analizat nu va diferi cu mai mult de 1% sau +/-0.2 minute fata de timpul de retentie al aceleeasi substante de referinta

Componentii cu solubilitate mai pronuntata in faza stationara, vor fi mai puternic retinuti pe coloana cromatografica si deci vor fi eluati mai incet. Componentii mai solubili in faza mobila se vor elua mai repede de pe coloana cromatografica.

In tabelul 6 sunt prezentate substantele detectate, impreuna cu timpii de retentie (t_R) si timpii de retentie relativi (t_RR) in ordinea de elutie cromatografica. Ca standard intern s-a utilizat diizopropilaminododecanul, DIPA 12 functie de care s-au calculat timpii de retentie relativi (t_RR)[20].

Pentru protectia sportivilor impotriva falselor rezultate pozitive, forurile competente, Agentia Mondiala Anti-Doping, AMAD pretind ca identificarea finala sa fie efectuata mass-spectrometric. Cea mai buna cale pentru a confirma o substanta interzisa este efectuarea analizei doping prin tehnica gaz-cromatografiei capilare cuplata cu spectrometrie de masa cu evaluarea computerizata a datelor analitice[21,22]. Acestea sunt prezentate in sectiunea GC/MS.

Tabel 6. Parametrii cromatografici caracteristici ai analizei screening GC/NPD a stimulentelor volatile.

Bibliografie

1.http://www.chromatography-online.org/

2.Liteanu,C., Gocan,S., Bold,A., Separatologie analitica, Ed. Dacia, Cluj-Napoca, 1981.

3.Danet,A., Metode instrumentale de analiza chimica, Ed. Stiintifica, Bucuresti, 1995.

4.Danet,A., Medvedovici,A., Analiza Instrumentala si Metode Analitice de Separare, Universitatea Bucuresti, Facultatea de Chimie, Bucuresti, 1993.

5.http://www.chromatography-online.org/topics.retention.html

6. Skoog,D.A., Holler,J.F., Nieman,T.A.,Principles of Instrumental Analysis, Fifth Edition, Ed. Harcourt Brace College, S.U.A., 1998.

7. Informatii generale, Agillent

8. Donike,M., Barwald,K.R., Christ,V., Opfermann,G., Sigmunt,G., Zimmermann,J., Schanzer,W., Screening procedure in doping control, Sports Mesicine in Track & Field Athletics, 1985.

9. Utilizarea detectorilor, Agillent

10.Ciucanu,I., Cromatografia de gaze cu coloane capilare, Ed. Academiei Romane, Bucuresti,1990.

Donike, M. et al, in Belloti, P., Benzi, G. and Ljungvist, A. (Editors), Int. Athletic Foundation, World Simposion on Doping in Sports, Florence, 10 - 12 May 1987, IAAF, 1987.

12. https://www.drugsinsport.towp.com/prosub.html

13. https://www.nida.nih.gov/ResearchReports.html

14.Toxicological Analysis, ed. by R. Klaus Mller, edition Molinapress Leipzig, 1995.

15.Weineck,J., Biologia Sportului. Sportul de Performata, 367-368-369, Bucuresti, 1995.

16. Stroescu,V., Bazele farmacologice ale practicii medicale, vol. I si II, Ed. Medicala, Bucuresti, 1988.

17.Cotrau,M., Proca,M., Toxicologie analitica, Ed. Medicala, 1988.

18. Vajiala,E.G., Lamor,M., Doping Antidoping, Ed. Fest, Bucuresti, 2002.

19.Vajiala,E.G., Lamor,M., Tehnologii analitice utilizate in analiza doping, Stiinta Sportului, 26, 2001.

Bican Georgeta, Vajiala Graziela, Lamor Mia, Done Carla - Screeningul si confirmarea substantelor din clasa stimulentelor. Conferinta Stiintifica Internationala "Educatie prin sport, miscare pentru sanatate", Bucuresti, 28-29 oct., 2004.

WADA Technical Document - TD2003ICDCR, Identification criteria for qualitative assays incorporating chromatography and mass-spectrometry.

Codul Mondial Antidoping, Standardul International pentru Laboratoare, versiunea 4.0, august 2004.