Cromatografia de inalta performanta HPLC

Cromatografia de inalta performanta HPLC

Metode cromatografice

Dintre toate metodele de separare, cromatografia are o pozitie unica, putand fi aplicata tuturor problemelor din toate domeniile stiintei, avand o raspandire de-a dreptul exploziva in ultimii 40 de ani.

Cromatografia prezinta anumite trasaturi commune tuturor metodelor cromatografice care vor fi prezentate in continuare.

Istoric

Primele experimentari cromatografice au fost realizate la inceputul secolului in mod independent de catre David Day, inginer de mine geolog si de Mihail Tvet, botanist si fizician-chimist.

Urmatorul pas a fost realizat de Martin si Synge (1941) reusind separarea aminoacizilor pe o coloana umpluta cu silicagel saturat cu apa, iar ca faza mobila au utilizat cloroform si alcool n-butilic.

Consden, Gordon si Martin (1944) prin inlocuirea suportului de silicagel cu benzi de hartie pun bazele cromatografiei pe hartie.

Cromatografia pe star subtire este descrisa pentru prima data de Izmailov si Shraiber (1938) si a fost standardizata si perfectionata de catre Sthall in Europa si Kirchner in America. Astazi aceasta tehnica are o raspandire universala datorita vitezei mari de eluare si a unei bune rezolutii.

Clasificarea metodelor cromatografice

Cromatografia poate fi impartita in urmatoarele domenii generale:

Cromatografia de adsorbtie;

Cromatografia de repartitie;

Cromatografia de excludere;

Cromatografia de schimb ionic.

Acestea nu trebuie confundate cu operatiile de laborator. De exemplu repartitia poate fi facuta pe hartie (cromatografie pe hartie), intr-o coloana (repartitia pe coloana, faza inversa si cromatografia de gaze), sau in strat subtire (cromatografia in straturi subtiri). Principiul fundamental al repartitiei este acelasi in toate aceste cazuri. Diferenta consta in maniera in care este executat experimental efectul de repartitie.

In continuare trebuie sa se tina seama de tipul fazelor prezente. Toate procedeele cromatografice implica o faza mobila care trece peste o faza stationara. Asadar solutul este distribuit intre cele doua faze, motivul particular pentru modul in care are loc distributia reprezentand cheia sistemului cromatografic.

Echipamentul HPLC

Asa cum se vede in figurile alaturate, echipamentul HPLC are o ordine a configuratiei tulburatoare. In ciuda complexitatii aparente, totusi, majoritatea sistemelor HPLC sunt bazate pe un proiect care le sustine, asa cum este prezentat jos.

Detaliile pot sa difere, dar odata ce ai stapanit operatia unui sistem HPLC, sa inveti sa le folosesti pe celelalte este de obicei usor.

LC poate fi (si a fost) indeplinita folosind un tub de sticla ales cu grija cu pudra prin care unui solvent ii este permis caderea libera. Deci de ce avem nevoie de toate acele echipamente complicate de inalta performanta? Sunt foarte multe aspecte pentru a raspunde:

Viteza. O singura analiza a "clasicului" LC poate dura oricat intre 2 si 12 ore pentru a fi indeplinit. HPLC permite o analiza echivalenta care poate fi facuta intre 2 si 12 minute.

Reproductibilitate. O coloana clasica trebuie sa fie impachetata proaspat pentru fiecare analiza, crescand sansa erorilor. O singura coloana HPLC poate fi folosita pentru sute sau mii de probe.

Cantitate. Clasicul LC a fost (si inca mai este) o tehnica excelenta pentru prepararea de probe sau purificarea lor, dar necesita colectari aditionale si pasi de analiza pentru a fi folositor ca o unealta pentru analiza cantitativa. HPLC foloseste detectori on-line care dau informatii cantitative in timpul separarii.

Sensibilitatea. Clasicul LC folosea coloane relativ mari si volume corespunzatoare mari de solventi de faza mobila. Diluarea rezultata limita sensibilitatea tehnicii. HPLC foloseste coloane miniaturizate pentru a pastra diluarea probei la minim.

Puncul de inceput este coloana. Scazand media impachetarii marimii particulei coloanei minimalizeaza largirea benzii. O scadere corespunzatoare in marimea coloanei minimalizeaza consumul de solvent si diluarea probei.

Rezervoarele solventului HPLC

Rezervorul care contine faza mobila este des nu mai mult de o sticla. De obicei, sticla de reactiv care contine solventul HPLC poate fi folosita ca rezervor. Solventul este transportat din rezervor la pompa prin mijloace de tuburi de teflon - numite "linia de intrare" in pompa. Unele sisteme HPLC ca Agilent 1100 aratate in stanga au compartimente speciale pentru a tine una sau mai multe rezervoare de faze mobile.

Rezervoarele din aceste sisteme pot avea adaugari de caracteristici care permit ca faza mobila sa fie degazata si izolata de la contactul cu aerul.

Necesitatile unui rezervor de solvent sunt simple:

Rezervorul si atasamentele la pompa ar trebui sa fie facute din materiale care nu vor contamina faza mobila: teflon, sticla, sau otel inoxidabil.

Recipientul ar trebui sa aiba un fel de capac pentru a preveni contaminarea fazei mobile de catre materia sub forma de particula. Unele sisteme LC prevad asta ca parte din proiectul rezervorului. Daca folosesti o sticla de solvent ca rezervor, varful sticlei poate fi infasurat in folie de aluminiu pentru a pastra praful afara sau capacul sticlei poate fi gaurit pentru a permite inserarea liniei de intrare prin capac.

Nu inchide sticla prea strans sau inlaturarea fazei mobile de la pompa va creea un gol. Aceasta previne faza mobila de la scurgerea pe pompa, creand o "incuietoare de vapori" in pompa.

Exemple de lanturi de rezervoare de faza mobila din sticlaria de laborator standard cum ar fi pahare gradate sau bidoane acoperite cu folie de aluminiu prin recipiente mai mari ca sticle medii, cani cu solvent, sau baloane de sticla, pentru sticlarie facuta la comanda care include provizii incorporate pentru agitare si degazare.

Capacitatea de agitare nu este in mod absolut necesara, dar poate ajuta la pastrarea omogenitatii fazei mobile ca solvent este pierduta la evaporare. Degazarea - indepartarea aerului dizolvat din faza mobila - nu este intotdeauna necesara, dar este, in general, recomandata pentru operatii sigure.

Este important ca materia sub forma de particule sa fie tinuta in afara fazei mobile pentru ca particulele pot cauza stricaciuni pompei si injectorului, de asemeni si dopului coloanei. Fazele mobile sunt deseori filtrate inainte sa le introducem in rezervor. In plus, o frita de 10 microni sau filtrele de intrare trebuie sa fie conectate la sfarsitul liniei de intrare care este scufundata in rezervor. Aceasta frita de intrare serveste in mai multe scopuri. In afara asigurarii unei extra protectii impotriva intrarii particulelor in pompa, filtrele de intrare servesc la pastrarea liniei de intrare la fundul rezervorului.

Rigiditatea liniei de intrare tinde sa permita tevariei de teflon sa se strecoare afara din rezervor, prevenind folosirea tuturor fazelor mobile numai daca un filtru de intrare este folosit pentru a ingreuna capatul tevariei. Pentru acest motiv, filtrele de intrare sunt des numite "scufundatoare".

Frita scufundatoare nu este un inlocuitor pentru filtrarea fazei mobile. Marimea porilor tipica folosita intr-o frita scufundatoare este de ordinul 5 - 10 microni; fritele cu marimi mai mici a porilor sunt foarte posibile sa se astupe. In general, faza mobila ar trebui sa fie filtrata printr-o frita de 0.3 - 0.5 microni dupa ce solventul si tamponul sunt amestecate pentru a indeparta materia sub forma de particula. Frita scufundatoare protejeaza impotriva particulelor de prf mai mari ocazionale intalnite dupa ce faza mobila a fost filtrata.

In ciuda marimii relativ mari a porului, frita scufundatoare poate de asemeni sa se astupe peste timp. Aceasta este in special posibil sa se intample cu tampoane apoase ca rezultat la cresterea bacteriala. Este o idee buna sa verificam periodic frita de intrare pentru a fi siguri ca faza mobila pluteste in liberate. "Testul sifon" este o cale buna pentru a indeplini aceasta:

Fii sigur ca sistemul de pompare este de prima calitate ( adica sa nu aiba aer pe linia de intrare).

Deconecteaza linia de intrare unde ea intra in pompa.

Aseaza linia de intrare deconectata deasupra unui pahar gradat sau a altui vas de colectare.

Ridca rezervorul solventului aproximativ 50 cm si obserba ce se intampla. Daca faza mobila sifoneaza libera, atunci frita de intrare este probabil buna. Daca faza mobila picura incet, atunci ori linia este rasucita, ori frita de intrare este partial tamponata.

Este adesea necesar sa indepartam aerul dizolvat din faza mobila inainte ca faza mobila sa fie introdusa in pompa. Aceasta procedura este numita dagazarea fazei mobile. Motivul degazarii fazei mobile este acela ca aerul dizolvat tinde sa fie eliberat in interiorul sistemului HPLC. Aceasta face ca operatiile multor pompe HPLC sa fie nesigure, conducand la fluctuatii in calitatea plutirii. Bulele pot fi de asemeni prinse in celula de scurgere a detectorului, cauzand probleme cu acest modul.

Obtinerea separarii

In aceasta parte, vom vorbi despre o forma a HPLC numita "cromatografie de faza inversata". Aceasta este tipul de saparare HPLC cel mai comun folosita.

Metodele HPLC de faza inversata folosesc un tip special de coloana si o faza mobila compusa dintr-o amestecare de apa (sau un tampon apos) si un solvent organic cum ar fi acetonitril sau metanol. Mai exista si alte tehnici LC cum ar fi: cromatografie de pereche de ioni, cromatografie de faza normala, cromatografie de schimb de ioni, si cromatografie ce face excludere de marimi.

Sa incepem prin examinarea fazei stationare (impachetarea coloanei) folosita pentru separarile de faza inversate. Aceasta impachetare a coloanei consta in particule foarte mici care sunt inghesuite impreuna foarte strans in coloana. Daca materialul pentru impachetarea coloanei este marit astfel incat sa putem sa vedem efectiv particulele individuale, ele sunt de obicei sferice si arata ca niste mingi de tenis foarte mici. Cu ochiul liber, totusi, impachetarea coloanei arata mai mult sau mai putin ca pudra pentru copii; particulele individuale sunt mult prea mici pentru a fi vazute clar.

Sa ne imaginam ca putem sa taiem in doua o particula de faza stationara (ca si cum am taia un mar) si sa privim la sectiunea de traversare rezultata. Am putea sa vedem atunci ceva ca in diagrama din stanga.

Partile solide negre reprezinta materialul din care este facuta particula, in timp ce partile albe reprezinta gauri sau pori care traverseaza particula in zig-zag in toate directiile. Cea mai mare parte din particula este compusa din silicat - o sticla - ca si materialele care dau structura de baza. Suprafata silicatului (amandoua partile din exterior si din pori) este acoperita cu un strat de molecule organice; aceste molecule sunt legate chimic la suprafata silicatului astfel incat sa formeze o imbracaminte stransa, rezistenta chimic. Acest strat organic se mai numeste si "faza legata".

Acum sa marim o parte dintr-un perete de por mai departe, asa cum este aratat in dreapta. Putem sa vedem mai clar structura suprafatei acestui strat organic de legatura ("faza legata"). Stratul organic este compus din fire sau lanturi alchilice atasate la suprafata silicatului. Moleculele de proba se lipesc de aceste lanturi alchilice si sunt deci, retinute in particula impachetata, deci cauzand retragerea probei. Asa cum moleculele de proba sunt trecute prin coloana de faza mobila plutitoare, ele intra si ies prin pori. Compusii care se "lipesc" de faza legata vor fi incetiniti si vor parasi coloana mai tarziu decat componentele care nu se lipesc. Compusii de proba diferite (analitice) se vor lega de faza stationara mai mult sau mai putin strans, depinzand de natura chimica a compusului. Retinerea probei depinde de interactiunea dintre analitic cu faza mobila pe de o parte si cu faza stationara (impachetarea coloanei) pe cealalta parte. In general, compusii care sunt mai similari cu faza mobila vor interactiona cu ea mai puternic si de aceea vor fi spalati din coloana repede. Compusii care seamana mai mult cu faza legata vor tinde sa stea pe particula impachetata si deci spalati din coloana mai greu.

Pentru cromatografia de faza inversa, impachetarile sunt grupate in concordanta cu chimia lanturilor de faza legata. Impachetarea obisnuita include urmatoarele:

C18, numit si octadecil sau ODS;

C8, numit si octil

Trimetilsilil, numit si TMS sau FENILMETIL

Mai sunt si alte impachetari de coloana care sunt folosite pentru LC-urile de faza inversa mai putin (ciano, difenil, etc.).

In timp ce este important sa numim tipul impachetarii coloanei cum este descris mai sus, aceasta nu este o descriere suficienta pentru a ne asigura ca o coloana va funtiona la proba. Datorita diferentelor in chimia manufacturii, o coloana C18 de la Waters nu este la fel ca o coloana C18 de la Agilent sau de la Supelco sau de la oricare alt furnizor. In multe cazuri, un furnizor va avea multiple (diferite) coloane care se incadreaza la descrierea generala. De exemplu, Waters vinde coloane C18 numite Microbondpak, Novapak, si Symmetry, si nu sunt la fel. Agilent vinde coloane C8 sau C18 sub nume diferite ca Zorbax, Zorbax Rx, Zorbax Stablebond, sau Zorbax Eclipse, fiecare dintre ele fiind facute pentru folosire diferita.

Marimea particulei impachetarii coloanei este foarte importanta, si aceasta ar trebui intotdeauna specifica. Majoritatea coloanelor vin cu particule de 5-microni (mm), desi ambele particule si mici si mari sunt folosite. Lungimea coloanei si largimea ar trebui de asemeni specificate.

Am vazut ca o separare buna necesita varfuri inguste in cromatograma. Cromatograma este o schita sau inregistrare a separarii chimice produsa in HPLC. Totusi este greu sa descrii o coloana in termeni de largimea varfului deoarece varfurile de la inceput sunt mai inguste decat cele mai tarzii (presupunand conditii constante). "Numarul plat" al coloanei (N) este o cale de a evita acesta problema, deoarece numarul plat este constant in mod egal pentru toate varfurile dintr-o cromatograma particulara. Numarul plat poate fi masurat din latime si timpul de retinere aratat aici:

Valoarea lui N pentru o coloana variaza cu multi factori: lungimea coloanei, marimea particulei, rata plutirii fazei mobile, cat de bine a fost facuta coloana, si cat timp a fost folosita coloana. Coloanele uzuale de lungimi de 10- sau 15-cm impachetate cu particule de 3- sau 5-microni au valori ale lui N de aproximativ 10,000 plate cand sunt noi si cand opereaza in conditii ideale. Numerele plate ale coloanei pentru separarea probelor "reale" sunt in general intre 2,000 si 5,000.

Este important sa verificam numarul plat a unei coloane cand este primita si instalata pe sistemul LC. Fabricantul va furniza o cromatograma de test cu coloana aratand separarea unei probe particulare (de obicei un amestec de componenti) cu un set particular de conditii (rata de scurgere, faza mobila, temperatura, etc.) specificate. Ar trebui sa fii capabil sa obtii aceeasi separare raportata in cromatograma de test, si numarul plat pentru varfuri diferite ar trebui sa fie intre 10 si 20% din valorile raportate. Cromatograma de test ar trebui pastrata, pentru ca este folositoare in verificarea anumitor probleme care pot sa apara pe parcurs.

Acum ca am acoperit subiectul legat de numarul plat, sa discuta despre asimetria varfului. Varfurile LC-urilor bune ar trebui sa fie perfect simetrice, dar exista des o anumita urma, asa cum se vede in figura.

Acest varf de fapt lasa o urma mai degraba slaba. Urma varfului sau asimetria este slaba din mai multe motive; este greu sa se masoare marimea varfului, si este o simptoma a altor probleme a coloanei.

Putem masura asimetria varfului in unu sau doua moduri asa cum este aratat aici. Factorul de Urma, masurat la 5% din inaltimea varfului, este folosit in mare parte in industria farmaceutica. Factorul de Asimetrie masurat la 10% din inaltimea varfului este mai des folosit in analizele nonfarmaceutice. In cele mai multe cazuri, Factorul de Asimetrie si Factorul de Urma vor fi sumar aceiasi (desi rar exista egali). Valorile ar trebui normal sa cada intre 1.0 si 1.5 pentru o coloana noua si conditiile cromatogramei de test. Varfurile mai putin simetrice sunt des observate in conditiile actuale din probele "reale", dar orice crestere in urma varfului este o simptoma a unei probleme care ar trebui fixata.

O separere buna necesita de asemeni valori rezonabile ale retinerii. In timp ce timpul de retinere este o masurare directa a retinerii, are dezavantajul de a fi afectat de rata de scurgere a fazei mobile la fel ca si chimia de sistem (cresterea ratei de scurgere cauzeazaa o scadere proportionala a timpului de retinere). O masurare mai folositoare este factorul de capacitate, sau k'. Acesta este calculat din timpul de retinere a varfului si timpul mort al coloanei, asa cum este aratat in figura. Asta are ca avantaj faptul ca si timpul mort si timpul de retinere sunt afectati la fel de schimbarile din rata de scurgere sau dimensiunile coloanei; aceste efecte se anuleaza astfel incat factorul de capacitate nu afectat de rata de scurgere sau dimensiunile coloanei; este controlat in totalitate de temperatura si de caracteristicile chimice ale fazei mobile si fazei stationare. Timpul mort al sistemului nu este afectat de scimbarile din compozitia fazei mobile sau de chimia coloanei.

Daca o proba are doua sau mai multe varfuri, putem calcula de asemeni si o rata de retinere (a) pentru orice pereche de varfuri. Aceasta este simplu proportia factorilor de capacitate (k'-ul celui de al doilea varf impartit de k'-ul primului varf). El ne da informatii despre selectivitatea sistemului cromatogafic. Ca factorii de capacitate care in cuprind, proportia retinerii nu este afectata de rata de scurgere sau dimensiunile coloanei; este controlat in totalitate de temperatura si de cacracteristicile chimice ale fazei stationara si a fazei mobile.

Detectoarele HPLC

Detectorul masoara concentratia benzelor proba cand parasesc coloana si trec prin celula plutitoare a detectorului. Cand nici o banda nu trece prin detector, un semnal constant este inregistrat - numit Baselina cromatografului sau detectorului. Cand o banda de proba ajunge la detector, acesta raspunde diferentei din proprietatile fazei mobile cauzate de prezenta compusului probei, dand nastere la o schimbare in semnalul detectorului, vazuta ca un varf. Cum functioneaza un detector? In cele mai multe cazuri folosim un detector fotometric, numit uzual detector UV. In forma lui simpla, aceasta constand dintr-o sursa de lumina, o celula de scurgere (sau "celula de proba"), si un senzor de lumina asa cum este aratat in figura.

Cand nici o proba nu trece prin detector, lumina trece prin celula de scurgere si genereaza un semnal maxim la senzorul de lumina. Daca o banda de proba intra in detector, proba reduce cantitatea de lumina care ajunge la senzor si cauzeaza o scimbare in semnalul detectorului. Acest semnal este electronic inversat de datele sistemului care rezulta la aparitia unui varf pozitiv in cromatograma. Semnalul aratat creste in proportie cu concentratia probei in celula de scurgere. Detectorul va raspunde de asemeni si la alte schimbari in continutul celulei de scurgere. De exemplu, daca particule sau "murdarie" sunt prinse in interiorul celulei de scurgere, acestea vor intrerupe lumina care trece prin celula de scurgere si cauzeaza o schimbare in baselina. Sau o bula de aer poate fi prinsa in celula de scurgere, cauzand o schimbare foarte mare in cantitatea de lumina care trece. In acest caz, semnalul s-ar putea duce complet sub scala, dupa aceea se va intoarce la baselina originala daca bula terce prin celula.

Doua tipuri de detectoare UV sunt folosite astazi:

Cu lungime de unda variabila (uneori numite detectoare "spectrofotometrice")

Aranjare Fotodiodica (uneori numite detectoare "aranjatoare de diode").

Detectoarele cu lungime de unda variabila sunt mai putin scumpe; ele sunt tipul detectoarelor standard pentru analizele cantitative si a aranjamentelor de rutina. Detectoarele ce aranjare fotodiodica sunt mai versatile, pentru ca ele permit achizitionari simultane de informatii cromatografice si spectrale; ele sunt frecvent folosite in dezvoltarea metodei. Lungimea de unda a detectorului este o caracteristica importanta a unei separari HPLC. Ca o regula generala, lungimea de unda este setata la absorbanta maxima a analitului. Folosind lungimea de unda gresita poate rezulta in scaderea marimii varfului, sau chiar fara nici un varf!

Deoarece compusi diferiti pot sa aiba spectre de absorbanta diferite, o comparatie cantitativa directa de varfuri diferite in aceeasi cromatograma poate fi prost inteleasa. A cantitate mica a unui compus care absoarbe puternic la lungimea de unda a detectorului poate da un varf mai mare decat o cantitate mare a unui absorbant slab. Pentru o cantitate de baza, o calibrare trebuie sa fie indeplinita cu o cantitate cunoscuta a compusului exact pentru a fi analizat.

Sunt un numar de alte setari sau controale pentru detector; acestea pot fi construite chiar in detector, sau pot fi parti din datele sistemului:

Marimea tuturor varfurilor din cromatograf poate fi schimbata folosind atenuatorul sau setarile reglate. Scala de atenuare indica de obicei marimea unui varf care va aparea ca un varf de marime intreaga pe ecran. Aceasta scala este masurata in unitati de absorbanta (care sunt proportionale cu concentratia de proba); este de obicei exprimata ca "Scala Intreaga a Unitatilor de Absorbanta" (AUFS).

Figura ilustreaza efectul unei schimbari in atenuare. Cum setarea atenuarii este crescuta (AUFS este scazut), detectorul devine mai senzitiv, si toate varfurile cresc in marime. In mai multe sisteme, rangul de atenuare poate fi setat ori pe un detector ori pe un sistem de date.daca atenuarea sau rangul este setat pe sistemul de date, afecteaza de obicei numai expunerea. Nu schimba felul in care cantitatea este indeplinita pentru ca nu schimba informatia prezentata in sistemul de date. Daca atenuarea sau rangul este setat chiar la detector totusi, este posibil ca marimea varfurilor mari sa poata depasi capacitatile sistemului de date.

O alta setare a detectorului este Baseline Zero (uneori numita "Setarea Zero" ). Miscand setarea (aratata in figura) schimba in mod simplu toata cromatograma sus sau jos pe ecran. Cu setarea atenuarii, daca zero este setat la sistemul de date el afecteaza numai expunerea: cantitatea ramane neschimbata. Daca baseline zero este modificata la detector, integritatea poate fi compromisa daca baseline este setata suficient de jos pentru a trimite un semnal de voltaj negativ la sistemul de date (cele mai multe sisteme de date pot functiona numai cu semnale de voltaj pozitiv).

Alte tipuri de detectoare sunt mai putin intalnite in HPLC:

Detectoarele de Index Refractiv (RI) monitorizeaza indexul refractiei in efluentul coloanei (faza mobila parasind coloana). Fiecare lichid are un index caracteristic de refractie, si aceste index se schimba cand un solut (analitul) este dizolvat in lichid. Schimbarea in indexul de refractie indica deci elutia analitului din coloana. Pentru ca detectoarele RI sunt bazate pe o proprietate a fazei mobile, sunt universale.din cauza aceasta, ele difera de detectoarele UV care sunt specifice probei. RI este folosit cu prioritate pentru analiti care nu se absorb in UV. Este sensibil la schimbari mici in scurgerea fazei mobile sau compozitia acesteia si poate fi foarte sensibil la schimbarile mici ale temperaturi ambiante (un bun control al temperaturii este necesar pentru a face cu succes operarea pe detectoarele RI).

Detectoarele fluorescente, precum detectoarele UV sunt specifice probei: ele depind pe o caracteristica particulara a analitului. Pentru ca nu toti compusii sunt fluorescenti, detectorul fluorescent este mult mai selectiv decat detectorul UV. Acesta selectivitate este sporita pentru ca doua lungimi de unda sunt folosite: lungimea de unda de excitare si lungimea de unda de emisie. In multe cazuri, aceste lungimi de unda pot fi potrivite ca sa permita discriminari intre analiti similari chiar structural. Pentru ca detectarea fluorescenta masoara lumina emisa (mai degraba decat transmiterea luminii), poate fi mult mai sensibila decat detectarea UV (este mai usor sa masori o cantitate absoluta decat o mica diferenta dintre doua valori mai mari).

Detectoarele electrochimice, precum detectoarele fluorescente si UV, sunt specifice probei: ele se bazeaza pe oxidarea si reducerea analitului la o suprafata a electodului. Ele sunt folosite in principal pantru analiti usor oxidati/redusi cum ar fi zaharidele. Detectoarele electrochimice pot fi si mai sensibile si selective decat detectoarele fluorescente dar necesita o atentie scrupuloasa la puritatea solventului pentru succesul operatiei.

Unele "detectoare" HPLC sunt de fapt instrumete complet analitice in scopul lor. Exemple de aceste detectoare include LC-MS (spectrometrie de masa) si LC-FTIR (transformarea Fourier spectroscopie infrarosie). In multe astfel de sisteme, "detectorul" este mai complex si mai puternic decat in sistemul LC. LC-urile pot fi des considerate ca o proba a sistemului curat/de intrare pentru MS sau FTIR.

Chimia fazei stationare in HPLC

Acum sa privim mai indeaproape la variatele erori ale coloanei si posibile reparari ale acestora.

Cel mai mare mod de eroare al coloanei este o deteriorare in forma varfului asa cum este aratat in stanga. La largirea varfurilor si/sau la dezvoltarea unei urme severe sau schimbarea in forma. In acelasi timp presiunea colanei creste deseori marcabil. Aceste simptome se pot forma din cauze diferite, si este o idee buna sa verificam cromatograma de test originala in acesta situatie. Asta inseamna, sa se faca o cromatograma in aceleasi conditii si sa vedem daca aceeasi problema este prezenta. Daca se dovedeste sa fie cazul acesta (benzi cu urma saucu forma gresita in proba de test), aunci problema este ori blocarea fritei de intrare cu particule, ori crearea unui vid la intrarea in coloana.

Cea mai buna cale este sa procedam dupa cum urmeaza:

In primul rand detasati coloana din sistemul LC, intoarceti-o, si reconesctati-o la injector (inca nu o reconectati la detector). Iesirea originala a coloanei nu ar trebui sa fie intrare. In continuare pompati faza mobila prin coloana la o rata de scurgere mare (2 la 4 ml pe minut) pentru aproximativ o jumatate de ora. Acum intoarceti coloana la directia originala de scurgere, reconectati-o la injector si la detector, si intoarceti-va la conditiile originale de operare pe care le-a dat problema si vedeti daca cromatograma s-a imbunatatit si/ sau presiunea a scazut (nu reintoarceti coloana la pozitia ei originala). Deseori acesta simpla procedura de scurgere intoarsa sau jet de apa intors va spala particule din frita de intrare originala si va restabili performanta coloanei la nivelul bun original. Unii fabricatori de coloane nu recomanda sa intoarceti scurgerea la coloanele lor. Totusi, coloanele bine impachetate nu ar trebui sa sufere acesta procedura.

Daca coloana inca da varfuri slabe dupa inversarea scurgerii, urmatorul pas este sa inlocuim frita de intrare originala a coloanei. Detasati coloana din sistem, si foarte atenti indepartati garnitura de intrare, aratand frita la capatul de sus al coloanei ( un mm sau mai mult) sau daca o gaura este aparenta (suprafata imbracamintii coloanei nu este perfect neteda), ne referim la aceasta ca vid. In general coloana ar trebui sa fie data jos daca exista un vid, desi unele laboratoare prefera sa repare vidurile cu garnituri de noi impachetari. Daca nici un vid nu este aparent, inlocuiti frita originala cu una noua, si reatasati garnitura de sfarsit a coloanei. Fiti atenti sa strangeti garnitura precis ca recomandat: strangeti la la puterea mainii. Acum reinstalati coloana pe sistemul LC si vedeti daca rezulta in cromatograma vreo imbunatatire. Daca problema originala persista, dati coloana jos si instalati una noua.

O alta problema comuna coloanelor este observata ca o scadere graduala in timpul de retinere a probei si corespunzand in pierderea numarului plat. Des aceasta este datorata acumularii de compusi puternic retinuti pe imbracamintea coloanei. Aceste impuitati sunt prezente in probe care provin din surse de plante sau animale, probe de mediu, sau alte surse.cea mai buna cale sa evitam acesta problema este prin curatarea probei cum trebuie inaintea injectarii si sa folosim coloane de garda. O data ce problema s-a dezvoltat, poate des fi rezolvata prin spalarea coloanei cu o serie de solventi care pot indeparta aceste materiale absorbite.

O alta cauza a esecului coloanei este pierderea fazei legate datorata atacului chimic al fazei mobile - sau ocazional al probei. Aceasta problema nu poate fi reparata o data ce s-a produs, asa ca preventia este unica solutie. Folosirea precoloaneisi evitarea ph-ului mare sau ph-ului mic al fazei mobile si proba sunt cele mai bune moduri de rezolvare.

Folosirea cromatogramei pentru obtinerea rezultatelor

Aceasta sectiune incepe cu cromatograma pe care o obtinem dupa ce am folosit o proba. La acest moment avem unul sau mai multe varfuri care ne spune ceva despre cati compusi sunt prezenti in proba.

In exempulul afisat, vedem trei varfuri, fiecare corespunzator unui compus diferit. Deci, exista cel putin trei compusi prezenti in aceasta proba. Dar ceea ce vrem de obicei sa aflam este ce compusi sunt prezenti in proba si cat din fiecare compus este prezent. Tehnica "analizei calitative" inseamna gasirea identitatii diferitilor compusi in proba. "Analiza cantitativa" se refera la masurarea concentratiei sau cantitatii fiecarui compus in proba.

De obicei vrem sa facem analize cantitative pe proba, dar asta inseamna de asemeni si identificarea compusilor a caror concentratie o masuram. In LC folosim timpul de retinere pentru a stabili identitatea varfului si marimea benzii (inaltimea varfului sau aria acestuia) ca sa masuram concentratia.

Analize calitative pe HPLC

Din fericire, de obicei stim la ce compusi sa ne asteptam intr-o anumita proba.

De exemplu, daca analizam tablete de aspirina, presupunem ca aspirina va fi prezenta in fiecare tableta. Sau daca incercam sa masuram puritatea unor compusi "X" determinand concentratia lor in proba presupunem ca acel compus este prezent. Cand vrem sa masuram concentratia unui compus sau compusi dintr-o proba prin mijloace de HPLC, intai determinam timpul de retinere a compusului pur ca proba. Daca vrem sa masuram compusul A, injectam A pur in sistemul nostru LC, folosind aceleasi conditii pe care le-am folosit sa masuram A in probe diferite. In acest caz am putea obtine cromatograma urmatoare:

Vedem ca acel compus A are un timp de retinere de 4.25 minute. Acum daca vrem sa aflam daca unele amestecuri sau probe contin acest compus, injectam proba si obtinem cromatograma din figura. In acest caz vedem ca primul varf are de asemeni un timp de retinere de 4.25 minute, si de aceea presupunem ca varful #1 in proba este compusul A. am putea dori de asemeni sa masuram compusul B si C in proba, asa ca ii injectam si pe ei: prin potrivirea timpurilor variate de retinere, vedem ca varful #2 in proba noastra este compusul B (timpul de retinere de 4.64 minute) si varful #3 este compusul C (timpul de retinere de 5.1 minute).

Daca timpul nostru de retinere nu se potriveste indeaproape pentru compusul pur si pentru proba atunci probabil am facut o greseala - compusul nu este prezent in proba.

Cand folosim probe diferite continand compusii A, B si C ca mai sus, descoperim in general ca marimea a unor varfuri diferite se schimba de la determinare la determinare. Aceasta inseamna ca sunt cantitati diferite de A, B si C prezente. Totusi cat timp A, B si C sunt continute de proba, timpul lor de retinere nu ar trebui sa se schimbe. Asta inseamna, ca timpul de retinere al unui compus nu este in mod normal afectat de marimea varfului sau cantitatea unui compus prezent in proba. Daca compusul A (timpul de retinere este egal cu 4.25 minute) este absent dintr-o proba data, atunci nici un varf nu va fi gasit la 4.25 minute - putem atunci decide ca A are concentratia zero in proba.

In alte cazuri, putem gasi mai multe varfuri in cromatograma in afara de acelea provenite din compusii pe care ii anlaizam. Asta inseamna ca sunt si alti compusi in proba, compusi la care nu ne asteptam sa fie prezenti. Prezenta unor benzi neasteptate in cromatograma ar trebui aratata persoanei pentru care analiza LC este facuta - uneori aceasta afecteaza folosirea care va fi facuta pe analiza probei.

Deseori descoperim ca timpii de retinere pentru compusi diferiti raman constanti de la zi la zi. Asta inseamna, compusul A da acelasi timp de retinere (4.25 minute) la fiecare determinare LC. In alte cazuri putem vedea mici variatii in timpul de retinere de o zi la alta: Aceasta poate fi un lucru normal, si de obicei este cand schimbarile in timpul de retinere sunt numai de cateva sute de minute - si cand retinerea se schimba in aceeasi directie pentru toate benzile. Pentru schimbari mai mari in timpul de retinere, asa cum este aratat in figura, compusii puri ar trebui reinjectati pentru a confirma ca benzile probei sunt aceleasi pentru compusii pe care ii analizam. In orice caz, compusiii puri ar trebui injectati cel putin o data pe zi pentru a confirma benzile probei. Niciodata nu te baza pe injectarea de ieri a unui compus pur pentru a identifica varful probei de azi. De asemeni tine minte ca schimbarile in timpul de retinere pot fi o simptoma a unei probleme cu procedura de analiza. Aceasta este in special adevarata cand numai o singura banda arata o schimbare in timpul de retinere, in timp ce alte benzi nu se schimba dupa cum se vede aici.

Aici varful #1 (compusul A) arata schimbari in timpul de retinere de 4.1 minute in determinarea a doua. Aceasta ar putea fi rezultatul a unor compusi care se intrepatrund care suprapun partial varful #1, care ar putea cauza erori mari in valoarea raportata a compusului A. in acest caz compusul pur A ar trebui injectat pentru a confirma timpul lui de retinere. Daca descoperim ca ceva nu este in regula cu acesta determinare concentratia compuslui A in aceasta proba nu ar trebui raportata.

Este de asemeni posibil sa vedeam schimbari in forma varfului din cromatograma. Aici varful #2 a dezvoltat o urma si nu mai este un varf simetric. Aceasta sugereaza ca unii compusi intrepatrunsi suprapun partial varful #2 in cromatograma, si din nou, concentratia compusului B in proba nu ar trebui rapotata.

BIBLIOGRAFIE

www.google.ro

https://www.cnaa.acad.md/thesis/7775/

https://ro.wikipedia.org/wiki/Special:C%C4%83utare?search=cromatografie&go=Salt