DIAGNOSTICUL GESTATIEI PRIN METODE DE LABORATOR

DIAGNOSTICUL GESTATIEI PRIN METODE DE LABORATOR

1.     Metode fizice

2.     Metode chimice

3.     Metode histologice

4.     Metode biologice

5.     Metode imunologice

Metodele fizice

1. Radiografia si radioscopia

      folosite la animalele de talie mica si mijlocie

      permit stabilirea gestatiei destul de tardiv, dupa inceperea osificarii scheletului fetal

Avantaje: precizeaza nr. de produsi, asezarea si dispunerea lor in uter, permite diagnosticarea anumitor malformatii si monstruozitati fetale

Riscuri: aproape nule (organogeneza este incheiata)

2. Electrocardiografia

      inregistrarea grafica a activitatii cardiace a mamei (secusele mari) peste care se suprapun secusele mici (activitatea cardiaca a fatului)

      folosita la animalele mici, permite diagnosticarea viabilitatii fatului

3. Metoda Sokolovskaia

- folosita la vaca, fidelitate: 80%

Principiul metodei: cresterea densitatii mucusului cervical la vacile gestante, evidentiata cu ajutorul unei solutii de sulfat de cupru

Mod de lucru: intr-un recipient se pune sol. Cu(SO4)2, apoi se pune o picatura de mucus cervico-vaginal si se urmareste 5-6 secunde.

Reactie pozitiva: mucusul cade la fundul paharului

4. Cristalizarea mucusului cervical la vaca

- metoda de diagnostic a starii de negestatie, fidelitate slaba

Mod de lucru: se realizeaza un frotiu din mucusul cervical si se examineaza la microscop

Interpretare: in faza de proestru si estru - mucusul cervical cristalizeaza sub forma unei frunze de feriga - se exclude gestatia

5. Metode ce utillizeaza ultrasunetele

Ultrasunetele - sunete de frecventa inalta, care se propaga liniar

v     la suprafata de separare intre doua medii cu densitate diferita genereaza un ecou, iar unda isi modifica frecventa

v     se propaga foarte bine in orice mediu lichid, nu se propaga in aer si medii foarte dense (os)

Principii:

v     efectul Doppler: modificarea frecventei undei ultrasonice de catre particulele in miscare (circulatie fetala, placentara, cordul fetal) la limita de separare intre doua medii cu frecvente diferite

v     efectul puls-ecou: ecoul este captat si convertit intr-un semnal acustic sau luminos.

Un aparat cu ultrasunete se compune din:

v     sonda transductor - cu doua sau mai multe cristale de cuart (primul emite si al doilea receptioneaza)

v     cordon bransat la aparat

v     aparatul propriu-zis - traduce informatia primita intr-un semnal perceptibil de noi

ECOGRAFIA - modul de vizualizare a diferitelor formatiuni

Modul TR (timp real)

v     cel mai frecvent mod dupa care functioneaza sondele si aparatele ecografice

v     imaginea ecografica este o sectiune prin organul respectiv (ecotomografie)

v     pe ecranul ecografului apar o multitudine de puncte de nuante diferite

v     in cazul sondei liniare - imaginea va fi plana

v     in cazul sondei sectoriale - imaginea va fi in trunchi de con

v     frecventa ultrasunetelor - direct proportionala cu capacitatea de rezolutie - cu cat frecventa este mai mare, cu atat imaginea este mai clara, dar penetrabilitatea este mai redusa

Metode histologice

1. Metoda Benesch-Kurasava

- folosita la iapa

Principiul: evidentierea in frotiu a celulelor epiteliale ciliate in mucusul din jurul cervixului

Mod de lucru: recoltarea mucusului cu ajutorul unui tampon de vata, realizarea frotiurilor care se coloreaza Giemsa sau hematoxilina-eozina

Reactie pozitiva: mici conglomerate de celule ciliate si lipsa leucocitelor in frotiu

2. Metoda Ciurea

- folosita pt. diagnosticul precoce al gestatiei la scroafa si oaie, fidelitate - 95%

Principiul metodei: aprecierea modificarilor histologice ale epiteliului vaginal anterior

Mod de lucru: cu o pensa speciala se recolteaza o biopsie vaginala; fragmentul de mucoasa se include in gheata, se fac sectiuni care se coloreaza, apoi se examineaza la microscop

La scroafa:

      in estru - epiteliul - 20-25 straturi de celule alungite, cu citoplasma clara si nuclei voluminosi; str. superf. - nuclei picnotici+inceput de cheratinizare

      in metestru - 4-5 straturi, celule vacuolizate si descuamate - aspect ce se mentine pe toata perioada diestrului

      in gestatie - 2-3 straturi dispuse pe membrana bazala

La oaie:

v     la negestante: epiteliul vaginal - 10-12 straturi celule, cu aspect diferit:

         straturile profunde: regulate, cubice

         straturile superficiale: polimorfe, aspect poligonal/cubic

v     la gestante: epiteliul vaginal - 3-4 straturi de celule cubice, dupa ziua 40 de gestatie

Metode chimice

      metoda de evidentiere calitativa a hormonilor estrogeni, printr-o reactie de fluorescenta a estrogenilor in prezenta acidului sulfuric

      folosita la iepe intre lunile 4-9 de gestatie, fidelitate 98%

      la iapa - secretia urinara de estrogeni este apreciabila incepand cu 75-90 zile de gestatie

Reactia Cuboni:

- 15 ml urina + 3 ml HCl conc. - amestecul se mentine la o baie-marina 10 min. - apoi se raceste si se filtreaza - filtratul se pune in balon de decantare + 18 ml benzol - se omogenizeaza cateva minute - urina se elimina prin decantare, iar la extractul benzolic se adauga 10 ml H2SO4 conc. - se amesteca si se decanteaza din nou - H2SO4 se recupereaza intr-o eprubeta - se mentine 10 min. La 80C in baie marina - se raceste

Reactie pozitiva: se observa o fluorescenta verde cand se examineaza proba in lumina indirecta sau U.V.

Metodele biologice

Principiul: evidentierea modificarilor specifice induse de gonadotropina serica asupra aparatului genital la animalele de laborator

Gonadotropina serica: hormon glicoproteic secretat de trofoblastul fetal, care invadeaza cupulele endometriale, catre ziua 36 de gestatie, atinge un maxim intre 55-75 zile de gestatie, apoi descreste treptat, pentru a dispare la 120 zile

1. Metoda Ascheim-Zondeck

Animale de experienta: soricele impubere de 3-4 sapt.

Reactia pozitiva: -uter turgescent, marit in volum

-ovare congestionate, cu numerosi foliculi maturi,

-hemoragici, sau transformati in C.G.

-vaginul si vulva tumefiate

Fidelitate: 96%, intre zilele 50-100 de gestatie

2. Metoda Friedman-Schneider

Animale de laborator: iepuroaice impubere

Reactia pozitiva:- numerosi foliculi hemoragici sau C.G. pe ovar

- hipertrofie uterina

3. Reactia Brouha-Hinglais Simmonet

Animale de experienta: soareci masculi impuberi

Reactia pozitiva: hipertrofia veziculelor seminale si a testiculelor

4. Metoda Zavadovschi-Nesmeianova

Animale de experienta: cocosii impuberi

Reactia pozitiva: -hipertrofia crestei

-cresterea in volum de 3-4 ori a testiculelor

5. Metoda Galli- Mainini

Animale de experienta: broscoi

Reactie pozitiva: evidentierea spermatozoizilor in urina prin examinare la microscop

6. Metoda Allen- Doisy

Animale de experienta: soricele impubere/castrate

- se bazeaza pe actiunea biologica a horrmonilor estrogeni asupra tractusului genital anterior

Reactie pozitiva: aparitia celulelor mari, cornificate, anucleate (Scholen)- in locul celor mici, rotunde si nucleate in frotiul realizat din fluidul vaginal

Metodele imunologice

1. Inhibarea reactiei de aglutinare dintre eritrocitele de oaie si un ser antiPMSG daca aceste eritrocite sunt puse in prealabil in contact cu serul provenit de la iapa de testat, cand aceasta este gestanta

2. Imunelectroforeza in gel de geloza

Material necesar:

- ser antiPMSG concentrat si specific - se introduce intr-un godeu central intr-o placa Petri

- seruri de la iepele de testat introduse in godeurile periferice

Mod de lucru:

- supunerea placii Petri unui camp electroforetic

- se realizeaza migrarea specifica a proteinelor in functie de masa lor moleculara

R+ - aparitia unor linii de precipitare intre godeul central si cel periferic corespunzator iepei gestante

Intensitatea liniilor de precipitare - direct proportionala cu cantitatea de PMSG din serul respectiv

3. Determinarea factorului de gestatie timpurie

- complex proteic dependent de gestatie, produs de ovar si oviduct care impiedica rejectia embrionului de catre mama

- se identifica la 24h dupa monta la oaie si la 4h la scroafa

Principiul metodei: activitatea imunosupresiva a factorului de gestatie timpurie asupra testului de inhibare a hemaglutinarii

4. RIA

- este necesara obtinerea de Ac antiP (prin injectarea repetata de P la iepuri)

a. Ac antiP + Ag (P din ser, lapte, grasimea din lapte) Ac-Ag + Ac antiP (exces)

b. Ac antiP + Ag (P marcat cu tritiu) Ac-Ag (P) + Ag (P marcat cu tritiu exces)

- nr. dezintegrarilor radioactive/minut (cantitatea de Ac antiP ramasi liberi in prima etapa si care s-au cuplat cu P marcat cu tritiu in a doua etapa) este receptionat de un spectrometru de scintilatie si raportat la o curba etalon - precizarea cantitatii de P (ng/ml)

IAPA

v     nivelul bazal al P: 0,5 ng/ml

v     in faza luteala - P > 5-6 ng/ml

v     in gestatie - P > 2 ng/ml

v     prelevarea probelor: intre zilele 18-23 dupa monta

VACA

v     nivelul bazal al P: 0,5ng/ml

v     in gestatie - P > 2 ng/ml

v     prelevarea pb. (sange, lapte) - la 23-24 zile dupa monta

SCROAFA

v     in gestatie - P: 9 ng/ml

v     recoltarea probelor - la 17-24 zile dupa monta

OAIA

o       valoarea bazala a P: 0,2-0,3 ng/ml

o       in faza luteala : 2 ng/ml

o       dupa ziua 50 de gestatie: 7-8 ng/ml

6. ELISA

-          acelasi principiu ca RIA

-          Ag sunt marcate cu o enzima in locul radioizotopilor (tritiu)

Enzime: peroxidaza din hrean + toluidina (colorant albastru)

fenilalanina + colorant portocaliu

fosfataza alcalina + fosfat nitro-fenil (colorant galben-citrin)

Ag + enzima - determina degradarea unui substrat - apare o reactie de culoare care se determina la un spectofotometru

Nivelul hormonilor se determina in functie de intensitatea culorii si a unor curbe etalon.