ÎNSAMÂNTARILE ARTIFICIALE ÎN ZOOTEHNIE - RECOLTAREA MATERIALULUI SEMINAL DE LA TAURI SI BIVOLI CU VAGINUL ARTIFICIAL

Recoltarea materialului seminal de la tauri si bivoli cu vaginul artificial

Recoltarea materialului seminal de la tauri si bivoli cu vaginul artificial se face în mod curent în centrele de însamântari artificiale. Aceasta metoda se poate aplica însa si pe teren, în diferite unitati, când se face examenul clinic al taurilor si bivolilor autorizati pentru monta sau când se examineaza aptitudinile de reproducatori ale taurasilor în testare.

Principiul metodei consta în realizarea artificiala a celor trei conditii (temperatura. presiune si lubrefiere) existente în vaginul natural al femelei în calduri, conditii necesare pentru declansarea reflexului sexual de ejaculare.

Materiale necesare: vaginul artificial, materiale anexe pentru pregatirea si folosirea lui. Vaginul artificial este format din mai multe parti: - tubul vaginal are forma cilindrica si este fabricat din cauciuc sau cauciuc pânzat, având o consistenta rigida si lungimea de 50 cm, iar diametru de 6.5 cm. Pe peretele tubului se afla un orificiu cu montura metalica, pe unde se va introduce apa calda. Acest orificiu este prevazut cu un dop metalic cu ghivent, care este astfel confectionat încât permite introducerea si evacuarea aerului;- camasa vaginala are forma cilindrica si este confectionata din cauciuc subtire; are lungimea de 78 cm si latimea de 7 cm ( la un capat sau chiar la ambele are un mic burelet); - inelele fixatoare sunt confectionate din cauciuc cu grosimea de 0,4 cm, latimea de 0,14 cm si diametru de 7,4 cm; se folosesc pentru fixarea camasii vaginale la tubul vaginal; - paharul colector este de forma cilindrica si confectionat din sticla, cu lungimea de 7 cm si diametru de 3,5 cm. Paharul colector este astfel construit, încât, la un capat (cu care se ataseaza la vaginul artificial) reprezinta un mic recipient de forma conica, în care se va recolta sperma, iar la celalalt capat un orificiu prevazut cu dop de cauciuc (prin acest orificiu se introduce apa calda. care înconjoara recipientul pentru materialul seminal). Aproximativ la jumatatea lungimii sale, paharul colector prezinta un burelet de sticla, care ajuta la fixarea sa în lumenul vaginului artificial. Pentru a feri materialul seminal de impuritati (praf, germeni etc.) din momentul detasarii paharului colector de la vaginul artificial si pâna la diluare, paharul colector este prevazut cu un capac de sticla. Se mentioneaza ca exista si alte modele de pahare colectoare pentru productia spermatica de la tauri, fara pereti dubli si cu posibilitati de volumetrie; - dispozitivul de fixare a paharului colector este confectionat din cauciuc si format dintr-un inel (grosimea 0,3 cm, latimea 2 cm, lungimea 8 cm), ce se unesc la celalalt capat, prevazut cu un orificiu prin care va trece dopul paharului colector.

Materialele anexe pentru pregatirea vaginului artificial sunt: para de cauciuc pentru insuflarea aerului; termometru de baie; un borcan cu vaselina neutra si o bagheta de sticla pentru lubrefierea vaginului; mensura emailata de 500 ml; o pâlnie mica de sticla pentru introducerea apei calde; suport metalic pentru fixarea orizontala a vaginului artificial în momentul introducerii apei calde; perii cilindrice cu mâner de sârma; alcool etilic 96 si o solutie de bicarbonat de sodiu 3% (pentru spalarea vaginului artificial).

Alte materiale necesare pentru recoltarea materialului seminal: apa calda, sapun, fön sau prosop; la centrele de însamântari artificiale exista o sala pentru pregatirea taurilor înainte de recoltare prevazuta cu dus cu apa calda; stand pentru recoltare, care poate avea diferite forme si este construit din teava de fier sau din lemn de esenta tare, fie în sala de recoltare, fie în aer liber; la tauri se pot folosi si diferite modele de manechine, un covor mare de cauciuc, confectionat astfel încât sa împiedice alunecarea taurului în momentul saltului si al ejacularii.

Tehnica de lucru. Pentru recoltarea materialului seminal de la tauri cu vaginul artificial, este necesara efectuarea urmatoarelor operatiuni: pregatirea vaginului artificial, pregatirea taurului, recoltarea propriu-zisa, dezinfectarea materialelor folosite si a salii de recoltare.

1. Pregatirea vaginului artificial necesita o atentie deosebita, deoarece numai un vagin corect pregatit poate sa realizeze conditiile existente în vaginul natural. Fixarea camasii vaginale la tubul vaginal - pentru aceasta se introduce camasa vaginala în interiorul tubului vaginal, astfel încât sa depaseasca cele doua capete ale tubului în mod egal. Se pune tubul vaginal în pozitie verticala, iar operatorul, cu degetele mare si aratator de la ambele mâini, ruleaza în interior capatul liber al camasii vaginale, pâna la nivelul dechiderii tubului vaginal. Se formeaza astfel un burelet, care apoi este resfrânt peste capatul tubului vaginal. Se deruleaza acest burelet, încât capatul liber al camasii vaginale sa treaca peste peretele exterior al tubului vaginal; în continuare se procedeaza la fel si la celalalt capat. Daca fixarea camasii vaginale s-a facut corect, în interiorul tubului se observa câteva falduri (cute) longitudinale. Daca fixarea s-a facut incorect, atunci fie ca apar falduri în spirala, fie camasa vaginala este prea întinsa (nu se va putea realiza presiunea necesara asupra penisului), fie ca este prea putin întinsa (se va realiza o presiune prea mare asupra penisului). Aceste fixari incorecte ale camasii vaginale împiedica recoltarea normala a productiei de material seminal si daca se repeta pot duce la aparitia si instalarea de reflexe negative. de inhibitie. Dupa fixarea corecta a camasii vaginale, se trece la fixarea propriu-zisa, adica la introducerea celor doua inele de cauciuc, câte unul la fiecare capat al tubului vaginal. Aceste inele fixeaza, la extremitati, capetele rasfrânte ale camasii vaginale, pentru ca ea sa nu fie deplasata în timpul introducerii penisului si al miscarilor caracteristice copulatiei. Dezinfectarea vaginului artificial se face prin autoclavare, timp de 15 minute, la presiunea de o atmosfera. În conditii obisnuite de teren dezinfectarea vaginului artificial se poate face si cu un tampon de vata îmbibat în alcool etilic de 96 , cu care se sterge interiorul camasii vaginale. Trebuie însa ca urmele de alcool (care sunt nocive pentru spermatozoizi) sa fie îndepartate cu o solutie sterila de bicarbonat de sodiu 3%. Introducerea apei calde se face prin orificiul din peretele tubului vaginal; apa trebuie sa aiba temperatura de 45-50 C. Initial se introduce apa calda pentru încalzirea vaginului, apoi aceasta apa se arunca, se introduce din nou apa calda (aproximativ 250 ml) si se însurubeaza dopul metalic al orificiului. Cantitatea de apa nu trebuie sa fie prea mare, deoarece marginile camasii de cauciuc se pot desface, în timpul recoltarii, de pe tubul vaginal (mai ales la taurii cu salt energic), sau paharul colector poate fi aruncat din lumenul vaginului. Fixarea paharului colector - initial se introduce prin orificiul paharului colector apa calda (cu temperatura de 38 C) si se astupa orificiul cu un dop de cauciuc. Apoi se fixeaza paharul colector la unul dintre capetele vaginului. cu ajutorul dispozitivului de cauciuc. Lubrefierea camasii vaginale se face la capatul opus paharului colector. respectiv la capatul prin care taurul va introduce penisul. Cu ajutorul unei baghete de sticla sterile. se unge cu vaselina neutra interiorul camasii vaginale. pe aproximativ o treime din lungimea tubului vaginal. Vaselina neutra trebuie se creeze numai un mediu alunecos. fara sa fie în cantitate prea mare (deoarece atunci se va scurge pe peretii camasii si va impurifica materialul seminal). Introducerea aerului se face prin dopul metalic al orificiului prin care s-a introdus apa calda. Acest dop este prevazut lateral cu un robinet, care deschide si închide comunicarea cu spatiul virtual dintre tubul vaginal si camasa vaginala. Introducerea aerului se face cu o para de cauciuc, al carei tub de cauciuc se racordeaza la dopul metalic. Se deschide robinetul lateral al dopului si se insufla aer pâna ce camasa vaginala se umfla, încât lumenul vaginului se micsoreaza evident, iar marginile camasii vaginale devin usor bombate. Se închide apoi robinetul lateral si se scoate tubul de cauciuc de pe dopul metalic. Daca eventual s-a introdus prea mult aer, surplusul se evacueaza prin deschiderea corespunzatoare a robinetului lateral. Prin introducerea apei calde si a aerului, se creeaza o anumita presiune în interiorul lumenului vaginului artificial. Experienta practica arata ca exista variatii individuale uneori marcante, sub aspectul preferintelor legate de temperatura si presiunea vaginului artificial, aspecte individuale care trebuie bine cunoscute si respectate de tehnicianul operator care recolteaza productia de material seminal. Luarea temperaturii este ultima operatiune pregatitoare a vaginului artificial în vederea recoltarii materialului seminal. Temperatura se ia cu ajutorul unui termometru care se fixeaza între doua falduri formate de peretele interior al camasii vaginale. În momentul recoltarii, aceasta temperatura trebuie sa fie de 39 - 42 C; daca nu se realizeaza aceasta temperatura, se goleste apa si se introduce alta, cu temperatura mai ridicata. Exista si modele de vagine artificiale cu termometru fixat în peretele tubului vaginal (de exemplu modelul Hauptner).

2. Pregatirea taurului pentru recoltare. Operatiunea consta în plimbarea taurului, urmata de toaleta regiunii preputiale. Plimbarea se face timp de 10-15 minute în aer liber.

Exista mai multe procedee pentru plimbarea taurilor de reproductie utilizati la însamântari artificiale, cel mai simplu procedeu este plimbarea individuala, cu baston si inel nazal, iar cel mai recomandabil este cu diferite modele de carusele. S-a constatat un efect favorabil al plimbarii asupra unor parametri ai productiei spermatice.

Înainte de recoltare, într-o încapere aparte, regiunea furoului se spala bine cu apa calduta si sapun; uscarea se face cu aer cald de la un fön sau cu un prosop curat.

Pentru obtinerea unui material seminal cât mai steril, se recomanda ca, înainte de recoltare, cavitatea furoului sa fie spalata cu o solutie de antibiotice (penicilina si streptomicina). Odata pe luna se face tratamentul profilactic cu un unguent cu antibiotice si chimioterapice pentru evitarea unor infectii.

Este necesara respectarea practica a unui regim rational de recoltare, care sa asigure mentinerea potentialului de reproductie si exteriorizarea lui, prin valori corespunzatoare ale parametrilor spermogramei. În acelasi timp, recoltarea cu frecventa justificata biologic si tehnologic, asigura sub aspect zooeconomic o cantitate ridicata a productiei de material seminal, cu cresterea corespunzatoare a presiunii selectiei prin masculi.

3. Recoltarea propriu-zisa. Se introduce si se fixeaza în stand taurul manechin. Se aduce în sala de recoltare taurul donator, care este condus în apropierea trenului posterior al taurului manechin. Taurul manechin si taurul donator sunt adusi de îngrijitor cu bastonul de protectie fixat la inelul nazal.

Operatorul îmbracat cu echipament de protectie, tine în mâna dreapta vaginul artificial la nivelul crupei taurului manechin. Vaginul este înclinat sub un unghi de aproximativ 30 - 35 , având paharul colector în sus si deschiderea lubrefiata în jos.

Taurul donator va efectua saltul pe taurul manechin, timp în care, cu mâna stânga se va prinde penisul prin peretele furoului si se va dirija în interiorul vaginului artificial. Dupa câteva miscari specifice actului copulator, taurul va ejacula, reflex care se exteriorizeaza printr-o miscare caracteristica a crupei.

În timp ce taurul donator coboara de pe crupa taurului manechin, operatorul scoate cu grija vaginul artificial de pe penisul taurului.

Fig. 10 Pozitia si înclinareaFig. 11 Recoltarea spermei

corecta a vaginului artificialla taur.

pentru recoltarea spermei

la taur

(dupa A.T. BOGDAN si col.)

Metoda hemocitometrica de stabilire a concentratiei spermatozoizilor este (dupa cum îi spune si numele) o aplicare în seminalogie a metodei de numarare a elementelor sanguine, utilizata curent în hematologie.

Deoarece, atât în medicina umana, cât si în medicina veterinara, numararea hematiilor, a leucocitelor etc., reprezinta teste uzuale de laborator clinic, aparatura si instrumentarul necesare pentru aceasta determinare sunt mult mai usor de obtinut, iar tehnica de lucru este practic standardizata.

În aceste conditii, se recomanda în cazul spermogramelor uzuale efectuate periodic, în scop de apreciere a valorii biologice a reproducatorilor, sa se stabileasca gradul de dilutie si, mai ales în cadrul a n c h e t e l o r a n d r o l o g i c e de expertiza (terminologie si concept lansate înca din anul 1984 de catre A.T. BOGDAN, Dorina BOGDAN si C. CRISTEA), sa se efectueze determinarea hemocitometrica a concentratiei în spermatozoizi a materialului seminal (brut, diluat sau congelat).

Principiul metodei consta în numararea la microscop a spermatozoizilor din interiorul si de pe laturile unor patratele ale camerei de numarat (hemocitometrice) si, pe baza unei formule de calcul, stabilirea concentratiei în spermatozoizi a materialului seminal.

Materiale necesare: camera de numarat eritrocite (cele pentru numarat leucocite se pot utiliza numai pentru numararea spermatozoizilor în cazul m.s.c.). Aceste camere de numarat (diferite modele, ca de exemplu: Thomas, Burker – Türk, Goreaev etc.) prezinta doua retele, care se observa si cu ochiul liber sub forma semnului (+), iar la microscop se evidentiaza prin linii orizontale care sunt delimitate cu linii triple si contin câte 16 patratele mici, delimitate cu linii simple; pipete Potain pentru eritrocite, care au în bula pipetei un bastonas de omogenizare de culoare rosie; solutie de Na Cl 3 %, cu rol de diluant si de omorâre a spermatozoizilor (pentru a putea fi numarati în câmpul microscopic); lamele speciale pentru camerele de numarat sau chiar lamele histologice obisnuite; vata sau tifon.

Tehnica de lucru cuprinde urmatoarele operatiuni: pregatirea camerei de numarat; pregatirea probei de numarat si numararea propriu - zisa.

a) Pregatirea camerei de numarat. Se sterge lamela si se pune deasupra camerei de numarat, centrata pe retea si la 2 - 3 mm de marginea superioara sau inferioara a camerei. Se fixeaza camera de numarat pe platina microscopului. Se ridica la maximum condensatorul si, privind lateral, se aduce reteaua în axul optic al microscopului. Se coboara condensatorul si, cu obiectivul 10, se prinde imaginea microscopica a retelei de numarat; se vor observa patratele mari si în interiorul lor patratelele mici. Se centreaza în câmpul microscopic reteaua de patrate mari. Cu ajutorul vizei macrometrice se ridica putin coloana microscopului si prin rotirea revolverului microscopului se fixeaza în axul optic obiectivul 20. Se centreaza în câmpul microscopic un patrat mare, care contine patratele mici.

b) Pregatirea probei de numarat. Cu pipeta Potain pentru eritrocite, se aspira cu atentie sperma pâna la diviziunea 0,5; se verifica exactitatea, daca s-a aspirat mai putin se continua aspirarea, iar daca s-a aspirat mai mult, se tamponeaza vârful pipetei cu vata sau tifon. Se aspira în continuare NaCl solutie 3 % pâna la diviziunea 101. Se omogenizeaza prin miscari de lateralitate ale pipetei Potain, timp de 1 - 2 minute. Se înlatura primele 2 - 3 picaturi (care reprezinta solutia din tubul capilar al pipetei) si urmatoarea se pune cu atentie la marginea (superioara sau inferioara) a lamelei care acopera reteaua camerei de numarat; prin capilaritate, solutia cu spermatozoizi patrunde imediat între lamela si camera de numarat. Se asteapta 2 - 3 minute pentru stabilizarea probei.

c) Numararea propriu-zisa. Se regleaza imaginea microscopica a unui patrat mare al retelei camerei de numarat (prins anterior cu obiectivul 20). Se vor observa spermatozoizi în interior si pe laturile patratelelor mici, imobili. Se numara cu atentie toti spermatozoizii din interiorul fiecarui patratel, precum si cei care au capul situat pe laturile din dreapta si de jos (ale fiecarui patratel), din cele 16 patratele mici ale unui patrat mare, parcurgând toate patratelele si numarând astfel toti spermatozoizii din 5 patrate mari (deci în total 5 x 16 = 80 patratele mici), luând 3 sau 4 patrate mari în diagonala (în functie de tipul camerei de numarat) si respectiv 1 sau 2 patrate mari la întâmplare.

Interpretare. Pe baza numaratorii efectuate microscopic, se poate calcula concentratia în spermatozoizi pe 1 mm³.

Calcularea numarului de spermatozoizi pe mm ³ se face dupa formula:

în care: x₁ = numarul de spermatozoizi pe 1 mm ³; N = numarul de spermatozoizi din 80 patratele mici.

Calcularea numarului de spermatozoizi pe 1 ml sau cm³ se face dupa formula:

în care: x ₂ = numarul de spermatozoizi; x₁ si N = la fel ca în formula precedenta.

Calcularea numarului de spermatozoizi în miliarde / ml:

în care: x₃ = numarul de spermatozoizi în miliarde /ml; N = la fel ca în prima formula.

E x e m p l u: în cele 80 de patratele s-au numarat în total 100 spermatozoizi.

x₁ = N ^. 10000 = 100 ^. 10000 = 1000000 spermatozoizi / mm³

(sau 1,0 ^. 10⁶sp / mm³)

x₂ = x₁ ^. 1000 = 1000000 ^. 1000 = 1000000 spermatozoizi / ml

(sau 1,0 ^. 10⁹ sp / ml)

x₃ = N / 100 = 100 / 100 = 1,0 miliard spermatozoizi / ml

Pentru a mari precizia determinarilor hemocitometrice ale concentratiei spermatozoizilor, se recomanda efectuarea a câte doua numarari pentru fiecare ejaculat. De asemenea, atât pipetele de numarat, cât mai ales camerele hemocitometrice, trebuie sa fie foarte bine spalate, degresate si uscate dupa fiecare utilizare. O proba de rutina se poate efectua în medie în aproximativ 8 - 10 minute (inclusiv timpul pentru pregatirea camerei de numarat si apoi pentru spalarea ei). Chiar daca este laborioasa, totusi metoda hemocitometrica ramâne o metoda de referinta în cadrul spermogramelor uzuale. În acest sens mentionam ca si metoda moderna si mult mai expeditiva a determinarii fotocolorimetrice, apeleaza periodic la întocmirea unor abace, pe baza rezultatelor paralele ale citirilor hemocitometrice.

Metoda fotocolorimetrica se bazeaza în principiu pe retinerea diferita a fasciculelor de lumina de catre spermatozoizi (ca elemente opace) si masurarea acestei opacitati (care este proportionala cu concentratia în spermatozoizi) cu ajutorul unei celule fotoelectrice situata în diferite modele de aparate (de exemplu fotocolorimetrele Evans si Lange). Metoda de stabilire fotocolorimetrica a concentratiei de spermatozoizi, urmeaza aceleasi etape de pregatirea probelor, pregatirea aparatului si citirea propriu-zisa.

a) Pregatirea probelor necesita pregatirea eprubetelor, a solutiei standard si omogenizarea probei. Eprubetele trebuie sa fie foarte curate, degresate si fara zgârieturi, care deviaza fasciculul luminos. Proba martor sau etalon (numita si proba control standard), contine 7,9 ml ((masurat exact) de citrat de sodiu 2,9 % (respectiv o substanta care se afla si în diluant). Proba de masurat se obtine, în alta eprubeta, prin adaugarea peste citratul de sodiu (de asemenea, exact masurat 7,9 ml) a 0,1 ml de sperma, aspirat cu o micropipeta; nu se recomanda suflarea spermei din micropipeta în eprubeta (pentru a se evita formarea bulelor de aer, care deviaza fascicolul luminos), ci sperma este lasata sa se prelinga în eprubeta cu solutia standard, în virtutea gravitatiei (atât eprubeta cât si micropipeta sunt mentinute în pozitie verticala). În continuare, eprubeta se astupa cu un dop de cauciuc si se omogenizeaza lent, prin aproximativ 10 întoarceri (fara scuturari).

b) Pregatirea aparatului necesita periodic doua categorii de etalonare: una înainte de fiecare citire a probelor de masurat, respectiv etalonarea “zero” (cu ajutorul eprubetei de control standard) si alta etalonare mai rara (eventual semestriala, în functie de vechimea fotocelulei), care verifica exactitatea diviziunilor în raport cu determinarile paralele hemocitometrice. Exista modele de fotocolorimetre, fabricate special pentru stabilirea concentratiei în spermatozoizi a materialului seminal care au scala etalonata direct în miliarde / mm³. Se recomanda respectarea normelor de lucru specifice pentru un aparat de tip fotocolorimetru (instalarea lui într-un loc ferit de vibratii si de lumina puternica directa, înainte de începerea masuratorilor se deschide aparatul cu cel putin 10 minute pentru stabilizare, între doua determinari, comutatorul ramâne deschis).

c) Citirea propriu-zisa se face direct introducând complet eprubeta de masurat în lacasul fotocolorimetrului dupa care se scoate dopul de cauciuc al eprubetei si se acopera cu capacelul care închide lacasul probei. Se noteaza diviziunea indicata de acul galvanometrului, se scoate proba si se reintroduce proba etalon. Se recomanda efectuarea a câte doua citiri pentru fiecare ejaculat (se pot face si câte doua citiri succesive la aceeasi eprubeta) si valoarea medie se noteaza în caietul de laborator. Pe baza unui tabel, se calculeaza direct concentratia în spermatozoizi, de asemenea, tot din tabel rezulta si gradul de dilutie.

Examenul citomorfologic

Acesta permite evidentierea spermatozoizilor cu diferite forme patologice cum ar fi: anomalii primare si secundare, la nivelul capului, piesei intermediare si cozii.

În literatura de specialitate exista numeroase metode pentru colorarea frotiului din sperma. Cea mai uzuala metoda este coloratia intravitala cu eozina - nigrozina

Pentru reusita examinarii se coloreaza numai sperma proaspata (la maximum 15 min. dupa recoltare); colorarea se face în conditii stricte de izotermie (sperma, colorantii si sticlaria trebuie sa aiba temperatura de 37 C);presiunea osmotica a colorantului trebuie sa fie egala cu a spermei.

Coloratia cu eozina – nigroina mai este numita si coloratie intravitala deoarece evidentiaza în mod specific spermatozoizii vii fata de cei morti, existenti în ejaculat în momentul colorarii.

Materiale necesare: lame degresate si slefuite (cel putin trei); pipete Pasteur (cel putin trei); coloranti: eozina – solutie 5%; nigrozina - solutie apoasa 10%; material seminal (cel mult 15 min. de la recoltare). Toate aceste materiale se tin la termostat la 37 C.

Tehnica de lucru: cu o pipeta Pasteur se aspira din paharul colector si se pune o picatura de sperma pe o lama încalzita la 37 C. Cu o alta pipeta Pasteur se pun 2 – 3 picaturi de eozina – solutie 5% peste sperma si se omogenizeaza. Cu o alta pipeta Pasteur se pun 3 - 4 picaturi de nicrozina – solutie 10% peste amesteculsperma – eozina si se omogenizeaza. Se lasa 2 – 3 min. pentru colorare. Se face frotiu din amestecul de sperma cu coloranti, asemanatori cu frotiul din sînge. Se examineaza la microscop cu obiectivul de imersie.

Principiu: membrana lipoproteica a spermatozoizilor morti devine permeabila pentru eozina.

Interpretare. Pe un fond cenusiu, se observa spermatozoizi albi sau colorati în diferite nuante de rosu. Se examineaza citomorfologic spermatozoizii, numarându - se 100 - 120 spermatozoizi, se trece într – un tabel formele de spermatozoizi patologici, imaturi si morti.

Spermatozoizii morti: sânt colorati în diverse nuante de rosu, datorita patrunderii eozinei prin membrana lipoproteica a spermatozoidului mort, care are permeabilitatea de mambrana alterata.

I.        Forme patologice la capul spermatozoizilor:

- marime 1. cap mic – spermatozoizi pitici;

2. cap mare – spermatozoizi giganti;,

- forma 3. cap triunghiular cu vârf în sus (cap ascutit);

4. cap triunghiular cu vârf în jos (cap piriform);

- numar 5. cu doua capete ( bicefali)

6. fara cap (acefali);

II.      Forme patologice ale cozii:

- modoficari de forma - 1. cozi rasucite difert;

- 2. cozi retroaxiale;

- 3. fara coada;

- 4. coada scurta;

III.            Modificarea permeabilitatii membranei lipoproteice a spermatozoizilor :

- 1. permeabilitate partiala;

- 2. Permeabilitate totala (spermatozoid mort);

IV.            Pozitii ale picaturii citoplasmatice (spermatozoizi imaturi):

- 1. la baza capului;

- 2. la gâtul spematozoidului;

- 3. la piesa intermediara.

Diluarea materialului seminal pentru congelare

Tehnica diluarii spermei. Se aseamana, în general, cu cea folosita la sperma refrigerata. Se prepara doua medii de dilutie: A si B , din care mediul B contine glicerina într-un procent dublu fata de concentratia finala (a glicerinei) în sperma supusa congelarii.

Dilutia initiala se face cu o parte din diluantul A, în proportie de 1 : 1, la temperatura de 37^oC.

Dilutia intermediara se efectueaza cu restul diluantului A, dupa 20 - 30 minute de la dilutia initiala, când sperma diluata a ajuns la temperatura de 18 - 25^oC; gradul de dilutie a spermei în aceasta etapa este de 50 % (jumatate fata de dilutia finala).

Dilutia finala se face cu diluantul B, care are compozitie asemanatoare cu diluantul A, dar în plus contine glicerina. Glicerina fiind toxica pentru spermatozoizi , adaugarea diluantului B se face treptat, la interval de 5 minute. Dupa majoritatea autorilor, glicerinarea se face la temperatura de 5 ^oC. Diluantul B (cu glicerina) reprezinta 50 % din volumul final al spermei diluate. Dupa terminarea dilutiei finale (glicerinarii) se controleaza gradul de supravietuire a spermatozoizilor si daca mobilitatea acestora nu a scazut mai mult de 10 % , se întroduce sperma la echilibrare, la temperatura de 5^oC. Tehnologia conservarii spermei prin congelare presupune, atât scaderea treptata a temperaturii în functie de etapele de dilutie, cât si mentinerea spermei la temperaturi foarte scazute în timpul congelarii. Scaderea temperaturii spermei în timpul dilutiei se face mai întâi la temperatura de 18 - 25^oC (la sfârsitul dilutiei intermediare) si la temperatura de 5^oC în timpul dilutiei finale (glicerinarii). Dupa dilutia finala, sperma glicerinata se tine la temperatura de +5^oC pentru echilibrare, un timp foarte variabil (de la 2 la 18 ore), în functie de metoda de congelare, de specie, de ambalare a spermei (fiole, granule, paiete). Agentii criogeni folositi pentru congelarea spermei sunt : gheata carbonica (temperatura - 79^oC), aerul lichid (-183^oC), azot lichid (-196^oC). Azotul lichid este folosit , pe scara larga , în criobiologie.

Congelarea spermei se realizeaza în doua etape :

Congelarea initiala sau precongelarea. Se face în functie de modul de ambalare a spermei. Astfel, în cazul congelarii spermei sub forma de granule, sperma se depune direct în excavatiile blocului de gheata carbonica (-79^oC). În cazul ambalarii spermei în fiole sau paiete, acestea se introduc în vapori de azot lichid la temperatura de -120^oC unde se mentin timp de 3 - 6 minute.

Congelarea finala Se face prin inversarea spermei precongelate în azot licgid la temperatura de -196^oC. Este absolut obligatoriu ca sa se efectueze controlul spermei, atât imediat dupa congelare cât si la 24 ore pentru aprecierea mobilitatii spermatozoizilor, din probe luate de la fiecare ejaculat.

Depozitarea spermei. Se face în containere cu azot lichid, în functie de modul de ambalare. Exista trei posibilitati de ambalare a spermei: în fiole, în granule , în paiete.

Ambalarea spermei în fiole. A fost folosita înca de la începutul practicarii congelarii spermei. Prin acest procedeu se asigura o buna conservare a spermei, se poate face o buna individualizare a dozelor, prin marcarea fiolei cu numele reproducatorului, a centrului si a datei . Prezinta dezavantajul ca dozele (fiolele) se pot fisura, pot sa “explodeze” ocupa prea mult spatiu.

Ambalarea spermei în granule. Aceasta metoda a fost experimentata si propusa de NAGASE si col., în anul 1964. Granulele obtinute , într-o etapa intermediara de congelare, în niste excavatii facute cu ajutorul unei prese în blocuri de gheata carbonica sunt introduse în recipiiente, prevazute cu orificii laterale si scufundate în azot lichid. Metoda este expeditiva si asigura depoozitarea în contaînere a unui mare numar de granule. Prezinta o serie de dezavantaje, pentru care s-a renuntat , în mare parte, la aplicarea ei: - nu este posibila individualizarea granulelor; - granulele se manipuleaza greu; - înainte de folosire , granulele se dilueaza; - sperma se poate contamîna cu agenti microbieni în timpul conservarii , deoarece vine în contact direct cu agentul criogen.

Ambalarea spermei în paiete. A fost preconizata de CASSOU si JONDET, prezinta avantaje evidente fata de celelalte moduri de ambalare si anume: - permite o buna individualizare a paietelor; - se evita contaminarea spermei cu flora microbiana din azotul lichid; - permite folosirea mai economica a contaînerelor.

Ambalarea spermei în paiete presupune: existenta unui utilaj adecvat, confectionarea paietelor din materiale care sa nu contina substante toxice pentru spermatozoizi, folosirea unor pistolete de însamântare, special construite. Datorita numeroaselor avantaje pe care le prezinta, congelarea spermei în paiete este preferata celorlalte metode de ambalare a spermei congelate.

Mentionam ca, datorita avantajelor mari, pe care le prezinta conservarea spermei prin congelare, în ultimii ani au fost întreprinse numeroase cercetari privind: compozitia mediilor de dilutie, regimul de scadere a temperaturii în timpul diluarii si congelarii, modul de ambalare a spermei supuse congelarii, modul de depozitare si aparatura folosita etc. Rezultatele obtinute în urma investigatiilor facute sunt aplicâte în unitati specializate diferentiat, în functie de experienta acumulata , de baza materiala existenta etc.

Precizam ca si în acest domeniu, mecanismele specifice ale economiei de piata au dat câstig de cauza, în mod evident, formei de ambalare a materialului seminal congelat în p a i e t e.

Tehnologia inocularii materialului seminal la

vaci si bivolite

O problema cu importante implicatii în cresterea natalitatii la vaci si bivolite, ca si la celelalte femele ale animalelor de ferma, o constituie stabilirea corecta a momentului optim pentru însamantarea artificiala. În conditii specifice de stabulatie prelungita ale cresterii intensiv - industriale, experienta pozitiva a unor ferme si complexe au demonstrat utilitatea “calendarului de reproductie”, fie a modelului cu casete, fie a modelului rotativ, fie a modelului cu panouri mobile.

Alegerea vacilor în calduri se face pe baza unor metode clinice (comportamentul sexual specific, aprecierea mucusului în calduri), unor metode tehnologice (tauri bistimulatori, vasectomizati sau cu devierea plastica a penisului, calendarul reproductiei) si prin metode de laborator (testul rezistentei electrice a mucoasei vaginale, frotiul citovaginal hormonal).

Autorii acestor Lucrari practice la Zootehnie generala si speciala destinat studentilor din cadrul Universitatii Bioterra considera ca, în mod evident crescatorul - îngrijitorul de vaci este acela care poate si trebuie sa fie instruit tehnic si sa depisteze corect aparitia caldurilor, pentru a se stabili timpul optim de însamântare.

Metoda de inoculare recto-vaginala la vaci si bivolite

Avantajele si dezavantajele sunt prezentate în continuare:

Avantaje:- metoda nu necesita aparatura speciala în afara pipetei de însamantari; - în cazul inocularii materialului seminal din paieta este nevoie de un pistolet de inoculare; - metoda nu necesita stand pentru contentia femelei, însamantarea efectuandu-se în adapost; - prin manopera transrectala de vidare a rectului reperarea si fixarea cervixului, se executa si masajul trasrectal al coarnelor uterine.

Dezavantaje:- necesita o anumita pregatire tehnica pentru a fi executata corect; - prin manipulari brutale sau fara îndemanare a pipetei de însamantare se produc leziuni la nivelul cervixului sau chiar la nivelul uterului ; - deoarece nu se foloseste speculum si lampa frontala nu se mai pot depista unele afectiuni la nivelul vaginului si cervixului.

Materiale si instrumentar : pipeta cu suzeta de inoculare pentru vaci (în cazul materialului seminal ambala în fiole) sau pistolet de inoculare (în cazul materialului seminal congelat în paiete); manusi din material plastic.

Tehnica de lucru. Se goleste ampula rectala de materiile fecale si se face toaleta regiunii vulvare.

Operatorul introduce mâna dreapta în rect si fixeaza cervixul, iar cu mâna stânga pipeta de însamântare (în care a fost aspirata în prealabil doza de material seminal). Un ajutor îndeparteaza digital buzele vulvei, iar operatorul dirijeaza pipeta intravaginal sub un unghi de 30 - 45^o, de jos în sus pe o distanta de 15 - 20 cm. Daca se lucreaza cu îndemanare, se poate ca manopera ajutorului de îndepartare a buzelor vulvei sa fie facuta tot de operator. În acest caz, dupa introducerea mainii în rect, operatorul retrage putin bratul spre înapoi si apasa usor regiunea orificiului anal ceea ce va duce la întredeschiderea buzelor vulvei.

De asemenea, spalarea regiunii vulvare nu este absolut necesara, caci la introducerea intravaginala a pipetei, prin deplasarea ei usor lateral, se poate feri murdarirea pipetei în timpul golirii rectului. De altfel, operatorii experimentati renunta de multe ori la golirea rectului, deoarece si fara aceasta manopera, fixarea transrectala a cervixului se poate face destul de bine.

Introducerea pipetei de însamantare în canalul cervical este timpul cel mai important al acestei metode. În acest scop exista doua variante: o prima varianta necesita împingerea cervixului spre înainte, încat vaginul sa se prelungeasca cranial si sa dispara faldurile în care s-ar putea opri varful pipetei.

De asemenea, aceasta alungire a vaginului ajuta la dirijarea varfului pipetei, datorita formei de palnie pe care o are în acest caz fundul vaginului.

Biotehnica însamantarii vacilor în calduri, necesita stabilirea momentului optim. Deoarece în conditiile unei stabulatii îndelungate, cum este aceea din cresterea de tip industrial, manifestarile specifice perioadei de calduri sunt mai greu de observat, mai ales la începutul lor, se recomanda practic ca imediat dupa descoperirea vacilor în calduri, ele sa fie însamantate si apoi repetata însamantarea la 8 - 12 ore. Totusi, din motive zooeconomice evidente, este preferabila o singura însamântare.

Tehnica de instruire pentru inocularea materialului seminal prin metoda recto-vaginala. La reusita actiunii de însamantari artificiale contribuie în mare masura priceperea operatorului însamantator, gradul sau de pregatire cat si constiinciozitatea în munca.

Metoda de testare a fost imaginata la Centrul de însamantari artificiale din L’Aigle (Franta), de unde s-au introdus în practica doua tipuri de pistolet, unul cu sonerie si altul cu cauterizator.

Pistoletele de testare sunt confectionate din acelasi material, au aceasi forma si diametru ca si pistoletul pentru inocularea materialului seminal congelat în paiete. Cu ajutorul pistoletelor model I.M.V. L’Aigle, se testeaza :

a) manualitatea, sub aspectul finetei introducerii pistoletului, respectiv se depisteaza operatorii care efectueaza brutal însamantarea artificiala. În acest scop, se utilizeaza “pistoletul cu sonerie”; instrumentul este prevazut cu un ac calibrat, în varful pistonului. La o compresiune ce depaseste toleranta admisa (de 150 g / cm²), acul face sa reculeze pistonul de însamantare, se realizeaza contactul cu o lama plasata înapoia pistonului care declansaza o sonerie;

b) topografia depunerii materialului seminal (respectiv locul de depunere: cervical, uterin, în cornul uterin drept, în cornul uterin stang). În aceste scopuri se utilizeaza pistoletul cauterizator care este prevazut cu o rezistenta electrica cu spirala (de circa 1 cm), conectata la o baterie portabila de 6 volti.

Operatorul care face testarea, simuleaza operatiunea de însamantare, introducand pistoletul în tractul genital femel. Cand a ajuns cu varful pistoletului la locul de electie pentru inoculare, apasa pistonul, acesta stabileste contactul electric (verificat prin citirea pe ampermetrul bateriei a valorii de 2 - 3 amperi), rezistenta se încalzeste pana la incandescenta si produce o usoara cauterizare a mucoasei uterine.