BIODEGRADAREA SI BIODETERIORAREA MICROBIANA

BIODEGRADAREA SI BIODETERIORAREA MICROBIANA

In sensul larg, conceptul de biodegradare se refera la modificarea proprietatii unor materiale, determinata de activitatea biologica a microorganismelor. Biodegradarea se exercita, in special asupra materialelor organice, dar nu exclude pe cele anorganice. Biodegradabilitatea reprezinta capacitatea unui compus de a fi modificat sructural de catre un agent biologic.

Biodegradarea este un proces cu efecte pozitive, atat in natura, cat si in economia societatii umane. Pe plan global, ele au o contributie majora la circulatia elementelor biogene in natura, iar pe plan local impiedica acumularea materialelor reziduale, a diferitilor contaminanti ai mediului etc.

Biodeteriorarea reprezinta actiunea prin care microorganismele determina transformarea unui material valoros intr-unul rezidual. Este un proces cu efecte negative, care trebuie evitat sau intarziat.

Diferentele dintre cele doua procese sunt ilustrate de urmatoarele exemple: degradarea hartiei care polueaza un sol de padure de catre Chaetomium globosum reprezinta un proces de biodegradare. Prin contrast, atacul hartiei dintr-un depozit, determina pagube economice, reprezinta un proces de biodeteriorare. In mod asemanator, descompunerea titeiului deversat in apele marine este un proces util, de combatere a poluarii prin biodegradare, in timp ce procesele similare ce au loc in rezervoare sau in situ reprezinta o biodeteriorare.

Biodegradarea compusilor organici este capacitatea de descompunere aeroba, prin mineralizare pana la CO₂, H₂O si NH₃ sau anaeroba, cu produsi finali ca H₂S, CH₄, CO₂ si H₂O.

Pentru compusii anorganici, biodegradabilitatea ar corespunde degradarii acestora la compusi prezenti in ciclul lor natural, ca de exemplu, NH₃, NO₂^-, NO₃^- si, mai ales, N₂.

Modificari induse de actiunea microoganismelor

Activitatea microorganismelor expuse biodegradarii si/sau biodeteriorarii determina: 1)alterari fizice; 2) modificari chimice; 3) impurificari; 4) modificari functionale.

1)Modificarile fizice sunt foarte diverse, in functie de natura substratului atacat: caracterul friabil al hartiei atacate, decolorarea si modificarea consistentei vopselelor, caracterul friabil al lemnului, gonflarea si pierderea elasticitatii cauciucului, ruginirea si perforarea conductelor metalice, distrugerea izolatorilor cablurilor electrice.

2)Modificarile chimice sunt determinate prin procese de asimilare sau de dezasimilare. Modificarea prin procese de asimilare este tipica pentru celuloza. Glucoza rezultata este convertita la biomasa microbiana.

Modificarile produse prin procese de dezasimilare corespund unor procese de degradare.

3)Impurificarea si patarea se datoreaza dezvoltarii miceliului fungic care acopera suprafete mari si formeaza diferite substante colorate intens.

4)Modificarile functionale sunt consecinta fenomenelor de fuling. Initiat de microorganisme, fuling-ul suprafetelor submerse ale navelor este completat prin asocierea nevertebratelor (Teredo, alte moluste, polichete, etc).

Efectele negative sunt directe (degradarea lemnului, a cauciucului, a vopselelor, a unor materiale plastice, coroziunea, etc.) sau indirecte (cresterea in greutate, marirea rezistentei la deplasare).

Biodegradarea petrolului

Numeroase microorganisme au capacitatea de a utiliza hidrocarburile gazoase, lichide si solide din seria alifatica, aromatica si asfaltica, drept unica sursa de carbon si energie, descompunandu-le la molecule mai simple sau chiar la CO₂ si H₂O.

Microorganismele ataca petrolul, gazolina, kerosenul, uleiurile minerale, parafina, gazul de iluminat, gazele de sonda, cauciucul natural si sintetic, uleiurile de racire, suprafetele asfaltate, conductele subterane ("pipe-line") si cablurile electrice protejate de coroziune cu materiale impregnate in parafine etc.

Degradarea microbiana a titeiului este un proces complex, a carui evolutie depinde de compozitia petrolului si de natura comunitatilor de microorganisme caracteristice mediilor naturale.

|iteiul este un amestec complex de hidrocarburi, insumand sute de compusi individuali. Alaturi de hidrocarburi se gasesc fenoli, tioli, acizi naftenici, compusi heterociclici cu azot (piridine, piroli, indol, etc.), compusi cu S (alchiltioli, tiofen, etc).

|iteiul contine mai multe clase de hidrocarburi:

1) Fractiunea alifatica (saturata) este reprezentata de alcani, compusi saturati cu formula generala C_nH_2n+2. Hidrocarburile cu lant lung sunt atacate mai usor decat cele cu catena scurta.

2)Fractiunea aromatica este reprezentata de compusi aromatici nesaturati, cel mai simplu fiind benzenul. Compusii aromatici sunt mai greu atacati in procesul de biodegradare, cea mai grea etapa fiind cea de clivare a ciclului.

3)Fractiunea asfaltica include componente cu structura complexa, mai putin cunoscuti din punct de vedere chimic.

Se apreciaza ca anual, 3,2 milioane tone de petrol ajung pe diferite cai in oceane, fie prin eliminari lente, fie prin deversari cu caracter brusc si masiv, consecutive accidentelor navelor petroliere sau ale platformelor de foraj maritim.

Dupa deversarile masive, procesul de degradare evolueza in trei faze:

Faza intaia, cu o durata de la cateva ore la cateva zile, corespunde etalarii rapide a titeiului pe o suprafata mare a mediului marin, fiind asociata cu procese fizice (evaporare, dizolvare, emulsionare). In aceasta faza, poluantul se separa in doua structuri diferite:

1)Stratul superficial contine fractiunile cele mai usoare, care retine si concentreaza poluantii chimici, detergenti, metale grele.

2)|iteiul din coloana de apa, supus unui proces de emulsionare.

Faza a doua de degradare a hidrocarburilor are loc pe doua cai:

1)Biodegradarea este realizata in ecosistemele acvatice, in special de bacterii. Unele microorganisme planctonice (fito- sau zooplancton si chiar unele bacterii) inmagazineaza temporar hidrocarburi sub forma de picaturi, pe care le elimina netransformate in mediu.

2)Degradarea chimica (abiotica) se realizeaza in absenta luminii prin fenomene de autooxidare si prin fotooxidare, adica prin fotoliza mediata de radicalii liberi foarte reactivi.

Faza a treia, de restabilire a echilibrului ecologic, are o durata variabila in functie de intensitatea poluarii si de conditiile in care a evoluat biodegradarea.

Degradarea titeiului are loc nu numai in mediul marin, ci si in sol. Numeroase microorganisme din sol pot folosi ca sursa de C si energie, toluenul, dar si alti compusi (xilen, naftalen, hexan, clorbenzen, etc).

Deversarea de titei brut in sol produce o crestere numerica a populatiilor de bacterii, cu o reducere concomitenta a diversitatii lor.

Poluarea cu doze mari omoara vegetatia, dar todeauna, in special in conditii de aerobioza, in intervale variabile are loc degradarea si revenirea la normal.

Microorganismele care degradeaza hidrocarburile sunt eubacterii, actinomicete, cianobacterii, levuri, fungi filamentosi si alge. Ele sintetizeaza enzime care degradeaza hidrocarburile individuale. Sursa de izolare este solul sau apa poluata cu resturi petroliere.

Biodeteriorarea cauciucului

Cauciucul sub diferitele sale forme (latex, cauciuc pur, comercial sau sintetic) este atacat lent de mai multe microorganisme.

Latexul pur este un produs relativ instabil, oxidabil in prezenta O₂, mai ales la lumina.

Cauciucul perfect pur este un amestec de hidrocarburi cu formula (C₅H₈)_n.

Microorganismele degradeaza cauciucul natural, determinand pierderea in greutate (cu circa 22% in 2 ani), dar si alte modificari ca gonflarea, slabirea structurii, pierderea elasticitatii.

Cauciucul sintetic este produs prin asamblarea unor polimeri sau copolimeri de hidrocarburi nesaturate ca butadien, metilbutadien (izopren), cloropren (clorbutadien), izobutilen, stiren.

Desi difera mult de cauciucul natural, ca si cauciucul natural prezinta riscul biodeteriorarii, in special prin mentinere indelungata in medii umede. In conditii naturale, degradarea microbiana a hidrocarburilor din cauciuc este cantitativ neinsemnata in raport cu cea produsa de caldura, lumina, alcali, acizi, prin abraziune, etc. Ea devine importanta in cazul atacarii invelisului izolator din cauciuc al cablurilor electrice ingropate in sol sau imersate in apa.

Biodeteriorarea vopselelor este un proces complex ce se realizeaza atat asupra vopselelor din recipiente, cat si asupra celor etalate prin procedeele de vopsire. Biodeteriorarea vopselelor implica decolorarea, producerea de gaze, modificarea proprietatilor fizice si chimice, cu efecte negative asupra posibilitatii utilizarii lor.

Biodeteriorarea vopselelor in pelicula pe lemn sau alte substraturi implica aparitia fisurilor, a desprinderii de substrat prin formare de vezicule, a caracterului friabil sau a petelor datorate, in special hifelor si sporilor fungici.

Biodeteriorarea vopselelor are un caracter de gravitate extrema pentru operele de arta (pictura in ulei, fresca, etc).

Degradarea tesuturilor vegetale asociata cu termogeneza microbiana

Degajarea caldurii de catre microorganisme in cursul activitatii biologice este un fenomen general. Coeficientul de folosire a energiei de catre microorganisme, in cursul metabolismului rareori depaseste 40-50%, iar restul se pierde in mediu sub forma de caldura.

Acest proces este deosebit de intens in cazul microorganismelor termofile, ceea ce poate produce pagube economice, datorate autoincalzirii si chiar aprinderii cerealelor depozitate, a clailor de fan, a silozurilor sau a combustibililor (turba si carbune).

Procesul de incalzire este initat de respiratia celulelor vegetale, dupa care sursa principala de caldura devin microorganismele. Initial, cresterea temperaturii se datoreaza unor microorganisme saprobionte banale, dar la 60-80^o se creeaza conditii optime pentru microorganismele termotolerante si termofile.

Autoincalzirea la temperaturi mai mari de 80^o nu mai este determinata de activitatea microorganismelor, ci deriva din procese pur chimice de oxidare exoterma, care pot ridica temperatura ambianta la peste 200^o, producand unele gaze carburante. Dezvoltarea acestor procese in depozitele de cereale le poate transforma intr-o masa carbonizata compacta.

Fenomene de "autoincalzire" determinate de activitatea microorganismelor se produc si in depozitele de combustibil, in special in cazul turbei brichetate.

Procesele de termogeneza au loc in gunoiul de grajd, constituit din paie si dejectii, continand un numar imens de microorganisme diferite.

Coroziunea bacteriana a metalelor

Coroziunea metalelor este rezultatul unui proces complex, determinat de mecanisme multiple, interdependente: chimice, mecanice, electrice si biologice. Datorita lor, Fe, otelul, fonta si alte metale mentinute intr-un mediu umed sufera procese de coroziune, prin care un metal trece de la conditia elementara la o stare de combinatie chimica. Una dintre formele cele mai atenuate ale acestui proces chimic este patina (oxidarea naturala sau artificiala), evidenta in cazul bronzului, care se acopera cu un strat de carbonat de cupru, de culoare verzuie.

Coroziunea bacteriana este frecventa la conductele de apa potabila si reziduala, de gaze si de petrol, ca si cele ce deservesc instalatiile sanitare. Initial apar pete de rugina, adanci de 1-6 mm. Ulterior, se produc pierderi de substanta. Coroziunea se extinde determinand perforarea conductelor.

Microorganismele sunt implicate in coroziunea anaeroba, prin depolarizare catodica, producerea de metaboliti corozivi, producerea de fenomene de aerare diferentiala si concentrarea celulelor pe suprafata acestora etc.

Coroziunea bacteriana anaeroba are importanta majora pentru instalatiile de forare si exploatare a sondelor. Mecanismul coroziunii nu este unanim acceptat, dar a priori s-a acordat atentie deosebita bacteriilor sulfat-reducatoare, izolate frecvent de la adancimi de peste 1000 m, unde se pot dezvolta bine in formatiunile purtatoare de titei.

Teoria depolarizarii catodice explica fenomenele de coroziune ale fierului si otelului mentinute in solul umed sau in contact cu ape poluate cu substante organice. Coroziunea este asociata cu aparitia unui produs de culoare neagra, atasat lax de metal (grafitizare). Dupa indepartarea lui, ramane vizibil metalul lucios.

In medii umede, elementele catodice ale Fe sunt polarizate de H, in absenta O₂. Bacteriile sulfat-reducatoare (Desulfovibrio, Desulfotomaculum), care au hidrogenaze folosesc H₂ catodic. Ele actioneaza in reactia normala de depolarizare ca un substituient al O₂, oxidand H catodic.

Produsii de coroziune sunt FeS si Fe(OH)₂, dupa reactiile:

(1) 4 Fe 4 Fe²⁺ + 8 e^- (solutie anodica)

(2) 8 H₂) 8 H⁺ + 8 (OH)^-

(3) 8 H⁺ + 8 e^- 8 H (reactie catodica)

(4) H₂SO₄ + 8 H H₂S + 4 H₂O (depolarizare catodica prin oxidarea H de catre bacteriile sulfat-reducatoare

(5) Fe²⁺ + H₂S FeS (produs de coroziune)

(6) 3 Fe²⁺ + 6 (OH)^- 3 Fe(OH)₂ (produs de coroziune)

Reactia globala:

4 Fe + H₂SO₄ + 4 H₂O FeS + 3 Fe(OH)₂ + 2 (OH)^- + H₂

Depolarizarea catodica este realizata numai de bacteriile cu activitate hidrogenazica. Reactia cheie a coroziunii catodice este a patra, a reducerii sulfatului cu H. Prin acest mecanism, bacteriile intra direct intr-o serie de reactii la suprafata substratului metalic, fie pentru a initia, fie pentru a accelera o reactie potentiala.

In bazinele de pastrare a titeiului, coroziunea este mai ampla pe fata interna si la baza unde se acumuleaza substante organice necesare microorganismelor. O conducta de otel groasa de 1 cm poate fi corodata in circa patru ani.

Fenomenele de coroziune pot fi produse pe alte cai: producerea de acizi organici; producerea H₂S (foarte coroziv) de catre bacterii prin descompunerea compusilor organici ai sulfului; formarea S elementar prin reducerea sulfatului in anaerobie; producerea NH₃ din degradarea proteinelor.

Producerea aerarii diferentiale sub actiunea biomasei bacteriene si a precipitatelor de hidroxid feric. Cresterea bacteriilor aderente de suprafata metalelor are drept consecinta distributia neuniforma a concentratiei O₂. Aerobele creeaza anaerobioza, consumand O₂ si apar diferente de aerare fata de zonele in care aprovizionarea cu O₂ ramane nemodificata. Regiunile anaerobe devin anodice in raport cu cele aerobe si, in consecinta, vor deveni centre de pierdere a metalului prin coroziune.

Fenomenul a fost descris ca tipic pentru bacteria Gallionella ferruginea, care oxideaza Fe feros la Fe feric, producand precipitarea hidroxizilor ferici. Acestia pot forma pe suprafata interna a conductelor, excrescente tari numite "tuberculi", legate ferm de suprafata metalului. Ca urmare, in regiunile situate la marginea depozitului, concentratia O₂ este mai mare, in timp ce zonele de la baza protejeaza suprafata conductei de contactul cu oxigenul dizolvat in apa.

In consecinta, suprafata acoperita de tuberculi devine anodica in raport cu regiunile suprafetei interne a conductei neacoperite de depozitele de bacterii si precipitate de Fe, care sunt catodice. Zonele anodice devin sediul unor fenomene de corodare foarte intensa, care perforeaza conductele. In zona bazala, anaeroba a "tuberculilor", cresc frecvent bacterii sulfat-reducatoare, care accentueaza fenomenul coroziunii.

Coroziunea oxidativa (coroziunea "acida")

Coroziunea oxidativa are ca substrat producerea de metaboliti corozivi (acizi minerali sau organici), respectiv a unui exces de H⁺ si se realizeaza in conditii naturale, cel mai adesea prin actiunea asociata a bacteriilor Thiobacillus sp. si Th. ferooxidans.

Primele obtin energia S⁰, a tiosulfatilor si a tetrationatului, cu producerea H₂SO₄, dupa reactiile:

T. thiooxidans 2 S⁰ + 3 O₂ + 2 H₂O 2 H₂SO₄

T. thioparus Na₂S₂O₃ + 2 O₂ + H₂O Na₂SO₄ + H₂SO₄

2 Na₂S₄O₆ + 7 O₂ + 6 H₂O 2 Na₂SO₄ + 6 H₂SO₄

In culturi pure in vitro, prin aceste reactii, pH-ul scade la 0,6.

T. ferooxidans oxideaza depozitele de pirita si obtine energie din reactia:

Fe²⁺ Fe³⁺ + e^-

Fe feric rezultat oxideaza compusii sulfului la H₂SO₄, dupa reactia:

2 FeS₂ + 2 H₂O + 7 O₂ 2 FeSO₄ + 2 H₂SO₄

Aceste reactii explica acidifierea apelor de drenare din minele de carbuni si corodarea severa a instalatiilor.

Degradarea microbiana a substantelor xenobiotice

Capacitatea microorganismelor de a degrada mai mult sau mai putin usor diferitele molecule complexe existente in natura este recunoscuta fara echivoc. In acest sens pledeaza imposibilitatea acumularii in mediu, chiar a celor mai greu degradabile si reinoibile anual (celuloza, hemiceluloze, lignina etc) precum si rolul esential al microorganismelor in circulatia elementelor biogene in natura. Atunci cand s-a realizat (cazul combustibililor fosili), acumularea s-a produs numai in conditii de mediu nefavorabile pentru biodegradare.

Aceste observatii au dus la formularea principiului infailibilitatii microorganismelor, conform caruia, orice substanta este degradata de un microorganism sau de un grup de microorganisme, in conditii favorabile de mediu.

Substantele organice cu diferite grade de complexitate, utilizate in agricultura ca pesticide, precum si in industrie, medicina etc., a infirmat aceasta doctrina, evidentiind caracterul refractar la degradarea microbiana, a substantelor diferite chimic de cele obisnuite ale sistemelor biologice.

Substantele xenobiotice (straine de sistemele biologice) sunt substante chimice organice sintetice, care sunt introduse in ecosistemele naturale, fie in mod deliberat, fie accidental. Fiind, in general, rezistente la biodegradare, se pot acumula in concentratii care depasesc anumite limite de toleranta, determinand efecte negative asupra organismelor vii datorita persistentei si concentrarii lor, precum si dificultatii de a fi introduse in circuitul global al elementelor biogene.

In anii 8o, productia anuala a celor peste 5 milioane de compusi chimici era de 300 milioane t/an. Unii sunt biodegradabili, dar cei mai multi sunt "recalcitranti".

Clasificarea substantelor xenobiotice cu caracter de poluanti ai mediului inconjurator

Pe baza compozitiei chimice, substantele xenobiotice poluante sunt grupate in trei categorii majore: 1) compusii organoclorurati; 2) alchil benzen-sulfonati; 3) compusii organo-fosforici.

1) Compusii organoclorurati (sau organohalogenati, deoarece unii pot contine si atomi de fluor) reprezinta grupul cel mai numeros si au grade diferite de rezistenta la degradare. Grupul cuprinde molecule obtinute prin aditia de clor sau fluor la unele hidrocarburi alifatice, aromatice sau heterociclice.

Legatura C-Cl sau C-F este foarte stabila si necesita consum de energie pentru clivare. Ea confera stabilitate chimica si biologica, dar agraveaza efectul poluant deoarece asigura o persistenta indelungata in mediu.

Compusii organoclorurati au utilizari multiple in agricultura, medicina si in industrie.

a) Substantele insecticide sunt reprezentate de :

- DDT (4,4-diclorfenil-tricloretan);

- Lindan, izomer al hexaclorciclohexanului (HCH);

- Derivati ai ciclopentadienului (aldrin, dieldrin, heptaclor);

b) Bifenilii policlorurati (BPC) sunt amestecuri de bifenil, avand 1-10 atomi de clor/molecula. Au o mare stabilitate biologica, proportionala cu cresterea gradului de clorinare. Sunt substante uleioase, folosite ca izolatori sau cu rol de racire in sistemele electrice inchise (transformatori, condensatori), lichide hidraulice si de transfer de caldura, in ignifugare, industria lacurilor si vopselelor, a cernelurilor tipografice, ca ulei de imersie pentru microscopie etc.

Dioxinele, prezente in circa 60 de formule chimice. Reprezentantii tipici sunt 2,3,7,8-tetraclor-dibenzo-dioxina si 2,3,7,8-tetraclor-dibenzo-furanul. Sunt rezistente la degradare si au efecte toxice pentru om, chiar in concentratii foarte mici.

c) Freonii sunt hidrocarburi alifatice cu g.m. mica, respectiv alcani C₁ - C₂, in care toti sau aproape toti atomii de H sunt inlocuiti de combinatii F-Cl. Cei mai cunoscuti sunt freonii F-11 (CCl₃F), F-12 (CCl₂F₂) si foranul-114 (CF₂Cl-CF₂Cl).

Sunt gaze inerte, foarte volatile, utilizate ca solventi sau ca propulsori pentru dispozitive de spray, in cosmetica, vopsele, insecticide, precum si in sisteme de racire (frigidere, aparate de conditionare a aerului). Freonii sunt fotolizati in atmosfera, unde sunt eliminati in cantitati de cica 10⁶ tone/an si sunt incriminati in distrugerea partiala a stratului de ozon, consecinta fiind cresterea iradierii UV.

d) Polimerii sintetici, de tip polietilena, clorura de vinil, polistiren sunt foarte raspanditi datorita utilizarilor multiple. Rezistenta la degradare pare sa fie asociata cu g.m. mare. Polietilena pare sa aiba o rezistenta indefinita la biodegradare.

2) Alchil-benzen-sulfonatii (ABS) sunt componenti majori ai detergentilor anionici, datorita capacitatii lor de surfactanti. Sunt complexe organice cu molecule amfipatice, a caror activitate de suprafata are ca efect "muierea", desorbtia, emulsionarea, suspendarea si stabilizarea particulelor dislocate de pe o suprafata. Rezultatul acestor efecte este detergenta sau curatirea.

Molecula este asimetrica, cu o extremitate alchil hidrofoba (lipofila) si una sulfonat, hidrofila. Agentul tensioactiv aflat in solutia apoasa vine in contact cu o suprafata lipidica. Moleculele lui se orienteaza astfel incat gruparile hidrofobe (alchil) se adsorb la stratul lipidic, iar cele hidrofile, polare (sulfonat) se orienteaza spre apa. Se creeaza astfel un monostrat de adsorbtie care face legatura intre cele doua medii insolubile, apa si lipidele determinand efectul de "muiere".

Sunt rezistenti la degradare si produc spuma la suprafata apelor poluate.

Degradarea compusilor halogenati implica dehalogenarea reductiva anaeroba, adica [nlocuirea halogenului cu un atom de hidrogen. In toate procesele biologice cunoscute, halogenul este eliberat sub forma ionica. Dupa dehalogenare, compusii xenobiotici sunt mai putin toxici si mai usor degradabili. Dehalogenarea este treapta primara, esentiala pentru degradarea anaeroba a compusilor aromatici halogenati. Dehalogenarea reductiva anaeroba este singurul mecanism de biodegradare pentru poluanti ai mediului ca bifenilii clorurati, hexaclorobenzenul si tetracloretilena.

Efectele ecologice ale substantelor xenobiotice

Substantele xenobiotice pot polua toate mediile naturale majore: atmosfera, litosfera si hidrosfera.

Exista doua modalitati de poluare chimica (Reinicke, 1988):

1) Poluarea localizata realizata pe zone mici de efluenti industriali, accidente de transport sau de utilizare si in care poluantul poate fi eliminat la concentratii relativ mari.

2) Poluarea dispersata realizata la concentratie mica, pe suprafete mai extinse, rezultand din volatizare, practici agricole.

Efectele poluante sunt agravate de marea diversitate chimica a pesticidelor.

Unele pesticide pot fi degradate in mediu, dar altele sunt rezistente la degradarea sub actiunea microorganismelor si pot persista timp indelungat. Clarke (1980) propune gruparea lor in patru categorii: 1) nepersistente, cu un timp de injumatatire de 2 saptamani; 2) slab persistente (cu un timp de injumatatire de 0,5-1,5 luni); 3) moderat persistente (cu timpul de injumatatire de 1,5-6 luni); 4) persistente (timpul de injumatatire mai mare de 6 luni).

Conceptul de molecule recalcitrante a fost formulat de Alexander (1965) pentru a caracteriza substantele care pot persista perioade indelungate in natura, fiind refractare la degradare sau sunt mineralizate foarte lent. Initial, termenul s-a referit la polimerii din ambalaje si la agentii surfactanti de tipul alchil-benzen-sulfonat inalt ramificati, inclusi in forma unor detergenti. Particularitatea de rezistenta la degradare nu este limitata exclusiv la substantele de sinteza chimica deoarece substantele poliaromatice si unii constituienti humici au un timp de injumatatire, apreciat cu radiocarbon, lung de cateva mii de ani.

Alte materiale de origine biologica (lignine, taninuri, melanine, etc) si unele materiale paleobiochimice prezinta grade importante de "recalcitranta": piele tabacita, lemn din turbarii, spori fungici, aminoacizi legati (din sedimente), chitina din fosile, etc.

Degradarea compusilor    xenobiotici

Termenul de biodegradare este folosit cu o mare doza de ambiguitate deoarece semnifica orice transformare care are ca rezultat obtinerea unui produs cu o molecula mai mica decat cea originara. In cazul substantelor xenobiotice situatia este mai complicata deoarece "degradarea" poate duce la aparitia unor produsi noi, refractari si toxici (uneori chiar mai toxici decat produsul originar) sau cu efect oncogen. Un exemplu tipic este al DDT-ului, convertit la un produs final (DBP), inca recalcitrant si biologic activ (Wedemeyer, 1976).

Substantele xenobiotice sunt degradate prin doua mecanisme majore: mineralizarea si co-metabolismul.

Mineralizarea, mecanismul cel mai avantajos pentru protectia mediului natural este consecinta unui proces de biodegradare completa. Pentru moleculele xenobiotice halogenate, ea implica conversia scheletului de carbon al acestora la intermediari de metabolism si, in final, revenirea substantelor organice halogenate la starea minerala (Reineke, 1988).

Mineralizarea este conditionata de:

1) patrunderea substantelor straine in celule;

2) existenta unor sisteme enzimatice degradative;

3) existenta unor mecanisme de reglare susceptibile sa fie activate la nevoie.

Procesul de mineralizare permite degradarea pesticidelor, de regula pe durata unui anotimp si are urmatoarele caracteristici:

1) secventele enzimatice sunt caracteristice metabolismului microorganismelor si in final convertesc substantele organice la substante anorganice;

2) o parte din carbonul substratului initial este convertit la constituienti celulari, astfel ca mineralizarea este asociata cu cresterea numarului si a biomasei celulare;

3) este asociata cel mai adesea cu detoxifierea. Daca unul din produsii intermediari este toxic, el poate exercita efecte nocive asupra mediului, dar, in general, acestia au viata scurta.

Co-metabolismul. Numerosi compusi xenobiotici, in special pesticidele organo-clorurate nu pot fi folosite de microorganisme ca unica sursa de C si energie si, ca urmare, nu pot fi indepartate din mediu. Ele pot fi insa modificate pe cale biologica, in natura, prin actiunea unor populatii mixte de microorganisme.

In cultura pura, nici un organism nu poate folosi substratul respectiv pentru crestere, dar in prezenta unei surse alternative de C si energie il poate modifica, transformandu-l chimic, incat, adeseori, poate fi utilizat in continuare de alte microorganisme.

Methilomonas methanica utilizeaza pentru crestere metanul si realizeaza concomitent, un proces de oxidare a altor co-substraturi, ca de exemplu, etanul la acid acetic, propanul la acid propanoic si acetona, butanul la acid butanoic si metilacetona, etc. Bacteria metanotrofa utilizeaza pentru crestere numai substratul C₁ caracteristic tipului sau de nutritie, dar nu poate utiliza ca unica sursa de C si energie nici cosubstraturile enumerate si nici produsii oxidarii lor.

Procesul prin care o bacterie oxideaza o substanta fara sa fie capabila sa o utilizeze ca sursa de C si energie pentru crestere a fost numit co-oxidare (Foster, 1962). Ulterior, Jensen (1963) a propus termenul de co-metabolism pentru a include si alte reactii (dehalogenari, etc) si pentru a evidentia necesitatea prezentei concomitente a unui substrat menit sa asigure cresterea.

Conceptul de co-metabolism a fost redefinit (Skryabin, 1978) pentru a caracteriza procesul de transformare a unui substrat, care nu permite cresterea unui microorganism in prezenta unui substrat de crestere sau a altui compus transformabil.

In acest context, degradarea unor compusi organici rezistenti la atacul unui microorganism devine posibila daca sistemul substrat-mediu-microorganism este suplimentat cu unul sau mai multe substraturi, utilizabile de catre microorganismul respectiv.

Procesele de co-metabolism au urmatoarele caracteristici majore:

1) au loc numai in medii naturale (apa, sol);

2) nu se poate izola niciodata un singur microorganism capabil sa utilizeze substantele xenobiotice in mod eficient ca sursa de C si energie;

3) populatia raspunzatoare de degradare nu creste ca numar sau ca biomasa dupa introducerea substratului in apa sau in sol. Explicatia este ca populatiile de microorganisme care fac co-metabolism sunt mici, degradarea compusilor xenobiotici este lenta si rata multiplicarii lor nu creste in timp, cum este cazul microorganismelor care metabolizeaza diferite substraturi pana la mineralizare;

4) produsii rezultati din co-metabolism sunt lipsiti, de cele mai multe ori, de orice functie metabolica, daca nu sunt atacati in continuare de alte enzime apartinand catabolismului. De aceea, o particularitate frecventa a co-metabolismului este acumularea in mediu a compusilor intermediari, care nu mai pot fi metabolizati.

Procesul de co-metabolism este activ pentru degradarea unor pesticide comune (DDT, 2,5 T, aldrin, heptaclor) si a multor molecule clorinate si neclorinate (Clarke, 1980).

Procesele de co-metabolism in natura. Importanta co-metabolismului in natura este demonstrata experimental si argumentata de observatii. Astfel, degradarea ligninei la CO₂ sub actiunea fungilor putregaiului alb (Phanerochaete chrysosporium si Coriolus versicolor) necesita prezenta unui substrat de crestere ca glucoza sau celuloza. Cantitatea de lignina degradata depinde de cantitatea de substrat de crestere aditional, iar cresterea fungilor pe lignina, ca unica sursa de C si energie este neinsemnata.

In sol, prezenta unei game largi de substante organice excretate de radacinile plantelor, in special in rizosfera, creeaza conditii favorabile pentru co-metabolismul substantelor refractare la degradare, in special xenobiotice. Dupa Skryabyn (1978), rolul primordial al substratului aditional, ca sursa de C asimilabil, necesar pentru a realiza co-metabolismul este de a furniza energie, cofactori sau alti metaboliti necesari pentru transformarea substratului recalcitrant.

Co-metabolismul substantelor xenobiotice in ecosistemele naturale are loc cu o rata scazuta, permitand acumularea intermediarilor nemetabolizabili, iar in unele cazuri, chiar a unor compusi mai toxici decat cei initiali (Alexander, 1981).

Este greu de apreciat in ce masura degradarea moleculelor complexe si a celor xenobiotice revine metabolismului si respectiv co-metabolismului, dar este evident ca multe dintre cele care nu permit cresterea nici unui organism individual sunt degradabile in prezenta unor populatii complexe.

In natura, substantele xenobiotice sunt degradate de circa 50 de genuri de microorganisme (bacterii si microfungi). Metabolizarea anaeroba a DDT la DDD, precum si a altor poluanti (lindan, heptaclor si posibil aldrin) este realizata de E.coli, Aerobacter aerogenes, K. pneumoniae, de unele actinomicete si levuri, dar si de organisme fitoplanctonice.

Algele Chlorella vulgaris si Chlamydomonas reinhardtii metabolizeaza lindanul, prin declorinare la pentaclor. Parationul si pentaclorfenolul sunt degradate rapid in natura sub actiunea microorganismelor. Aspergillus fumigatus, Fusarium roseum si Tricoderma degradeaza triazinele (atrazin, simazin).

Reactiile chimice sunt complexe, putin cunoscute si includ dehalogenari, dezaminari, decarboxilari, metil-oxidari, b-oxidari,hidroxilari, reactii de oxidare a azotului sau a sulfului, reducerea oxizilor de sulf, reducerea unor duble sau triple legaturi etc.

De mentionat ca nu toate reactiile produc doar modificarea limitata a moleculelor sau a intermediarilor, cu aparitia unor derivati prin nitrare, acilare, dimerizare, formarea de heterocicluri azotate etc. (Burs, 1980).

Dupa Knackmuss (1981), degradarea xenobioticelor in natura este rezultatul actiunii fortuite a enzimelor peexistente ale catabolismului produsilor naturali. Enzimele destinate actiunii unor constituienti naturali din mediu reactioneaza cu unele grupari functionale analoge structural, din compozitia moleculelor xenobiotice. De exemplu, erbicidul sintetic 2,4-D(acid 2,4-diclor-fenoxiacetic) se aseamana structural cu o serie de compusi aromatici naturali si poate fi degradat in sol de Achromobacter, Arthrobacter, Flavobacterium peregrinum, Pseudomonas, etc.

Phanerochaete chrysosporium degradeaza DDT, lindanul si alti produsi clorurati la CO₂ si H₂O sub actiunea sistemelor enzimatice extracelulare implicate in mod obisnuit in degradarea ligninei.

In concluzie, mediile naturale contaminate cu substante recalcitrante (organoclorurate sau de alta natura) pot fi mai usor detoxifiate si epurate daca li se adauga un analog structural natural biodegradabil, care stimuleaza multiplicarea microorganismelor active. Pe aceasta baza, Horvath (1972) a propus ca aplicarea erbicidelor in ecosistemele naturale sa se faca simultan cu o "imbogatire in analogi".

Bazele genetice ale degradarii compusilor organici halogenati

Degradarea substantelor xenobiotice se poate realiza, teoretic, pe doua cai majore:

1) Prin utilizarea echipamentului enzimatic al celulei, in cazul in care substratul nou are un anumit grad de analogie chimica si structurala cu anumite produse naturale. Limitarile cinetice care decurg din utilizarea unui substrat inrudit, dar nu specific sunt depasite pe mai multe cai: a)prin supraproductie de enzime; b)prin producerea de enzime cu specificitate modificata prin mutatie; c)prin inhibarea sau modificarea controlului riguros asigurat de genele reglatoare;

2) Prin activitati enzimatice noi, codificate de genele preexistente sau de gene heterologe, in urma unor rearanjari si recombinari genetice "legitime" sau "nelegitime" si in special prin aport de gene noi de origine plasmidiala.

Bazele genetice ale substantelor xenobiotice sunt putin cunoscute. Pentru putinele cazuri studiate, genele sunt cel mai adesea situate grupat, in structura unor plasmide sau transpozoni, o forma mai usor transmisibila de la un genom la altul, intra- sau intercelular. Datorita structurilor genetice transmisibile, microorganismele din mediile naturale au dobandit capacitatea de a degrada numerosi compusi halogenati, in special pe cei cu putini atomi de halogeni.

Tulpinile de microorganisme din mediile naturale (sol, apa, etc.) ar fi caracterizate printr-o accentuata flexibilitate a informatiei genetice, ceea ce le-ar asigura o adaptabilitate rapida ca raspuns la variabilitatea substratelor din medii. Ele s-ar deosebi de tulpinile bacteriene utilizate curent in studiile de genetica bacteriana (E. coli, S. typhymurium), limitate la un habitat unic (intestinul), lipsite de versatilitate catabolica si supuse unor controale foarte riguroase.

Tulpinile bacteriene saprobionte in mediile naturale, confruntate permanent cu o gama larga de nutrienti si de conditii de mediu, ar reprezenta un potential de evolutie biochimica mai rapida, in special catabolica, ceea ce le-ar permite sa degradeze compusi chimici sintetici, fara echivalent in natura.

Cauzele rezistentei la degradare. Perspectiva obtinerii si utilizarii unor pesticide noi este conditionata de calitatea de biodegradabilitate si de cunoasterea mecanismelor care determina caracterul de molecula recalcitranta.

1) Biodegradarea este conditionata de patrunderea substantei in celula, aceasta fiind determinata de marimea moleculei. Moleculele organice prea mari sau prea complexe si insolubile trebuie mai intai sa fie degradate la compusi mai mici, care pot fi internalizati si utilizati intracelular in catabolism. Degradarea initiala este rezultatul actiunii enzimelor extracelulare. Rezistenta cvasiabsoluta a polietilenei este determinata de g. m. mare si de absenta enzimelor extracelulare capabile sa o fragmenteze.

2) Structura moleculara pare sa aiba un rol esential: modificari chimice minore pot transforma un substrat biodegradabil intr-unul recalcitrant. De exemplu, erbicidul 2,4-D(acidul 2,4-diclorfenoxiacetic) este degradabil in sol in cateva zile, in timp ce 2,4,5-D(acidul 2,4,5-triclorfenoxiacetic), care difera printr-un singur atom de Cl rezista cateva luni. Polietilena (polimer sintetic - (CH₂CH₂)_n este refractara la atacul microorgansimelor, dar polietilenglicolul (CH₂CH₂O)_n este degradat.

Relatia directa dintre structura moleculara si gradul de biodegrabilitate este ilustrata de diferenta de rezistenta la degradare a celulozei si ligninei. Celulazele cliveaza in mod repetat acelasi tip de legatura chimica intre subunitati identice ale celulozei. Chiar in cazul proteinelor, legaturile peptidice succesive sunt identice, desi leaga aminoacizi diferiti.

Situatia este diferita in cazul ligninei si humusului. Ele sunt mineralizate lent, deoarece sunt alcatuite din molecule si legaturi diferite intre blocurile de constructie.

3) Absenta echipamentului enzimatic necesar pentru biodegradare. Spre deosebire de biopolimeri, care sunt degradati mai mult sau mai putin lent, substantele xenobiotice sunt frecvent refractare la biodegradare din cauza absentei enzimelor active asupra structurii lor. Compusii xenobiotici avand structuri chimice foarte variate si adeseori complexe, au aparut intr-un timp scurt si contin grupari chimice, in general nerecunoscute de enzimele microbiene. Cei care prezinta anumite grade de asemanare cu compusii naturali pot fi degradati mai mult sau mai putin lent. Degradarea compusilor xenobiotici necesita modificari structurale extensive inainte de a intra in caile centrale ale metabolismului bacterian. In consecinta, vor fi partial sau total rezistente la degradare si se vor acumula in mediu (Janke si Fritsche, 1985).

Incapacitatea poluantilor de a induce sinteza enzimelor degradative

Concentratia prea mica a poluantului (ppm, ppb) este insuficienta pentru a induce enzimele necesare degradarii. Biodegradarea compusilor sintetici are loc numai in nisele ecologice in care concentratia lor este suficient de mare pentru a exercita functia de presiune in selectie.

Rezistenta la biodegradare a unor poluanti poate fi determinata de adsorbtia lor pe diferite substraturi din sol si sedimente. Adsorbtia poate masca situsul substratului la care se leaga enzima si astfel o molecula biodegradabila devine refractara.

Caracterul recalcitrant al unei substante xenobiotice nu este totdeauna intrinsec, ci este uneori determinat de factori de mediu: a)absenta oxigenului in cazul substantelor degradabile numai in anaerobioza; b)prezenta unor factori (acizi organici, toxine, saruri) inhibitori ai multiplicarii microorganismelor active; c)efectul combinat al temperaturii scazute si al presiunii mari in adancul marilor; d)sedimentarea compusilor intr-un situs inaccesibil microorganismelor; e)concentratia scazuta a nutrientilor care limiteaza multiplicarea microorganismelor.

Consecinte ecologice ale prezentei substantelor xenobiotice in natura. Larga utilizare a pesticidelor in practica agricola a determinat un caracter global al raspandirii lor in sol, in apele interioare si marine.

Diferite modalitati de raspandire pot determina efecte nocive la distante mari de locul de aplicare. DDT-ul a fost gasit in zapezile din Antartica, la peste 6 000 km de locul cel mai apropiat de administrare.

Toxicitatea pentru microorganisme. Microorganismele au o mare capacitate de adsorbtie a pesticidelor, in special din mediile acvatice, desi se gasesc in concentratii foarte mici, favorizate de 2 factori:

a) suprafata mare de contact cu mediul inconjurator;

b) caracterul lipofil al majoritatii pesticidelor si, in special al insecticidelor. Ele au o mare afinitate pentru fosfolipidele din membranele celulare.

Multe pesticide au efecte perturbatoare asupra circuitului azotului, inhiba fotosinteza si celulozoliza, diminua randamentul productiei primare a fitoplanctonului, au efecte toxice asupra zooplanctonului.

Fenomenul de bioacumulare. Datorita solubilitatii lor reduse in apa, pesticidele au tendinta de a se localiza in interiorul celulelor vii. Ca urmare, microorganismele, fitoplanctonul si plantele macrofite, precum si fauna de toate dimensiunile pot acumula si stoca in celulele si tesuturile lor cantitati importante de pesticide, in concentratii inverse fata de solubilitatea lor in apa.

Procesul de bioacumulare ("Biomagnification") este agravat de faptul ca, dupa concentrare, acestea nu sunt nici degradate si nici excretate in cantitati semnificative, ci sunt introduse si transmise ca atare in reteaua trofica. Astfel, procesul de concentrare continua de-a lungul diferitelor verigi ale lantului trofic, teoretic cu circa 1 ordin de marime pentru fiecare nivel trofic succesiv. Afirmatia are la baza observatia ca din biomasa utilizata la un anumit nivel trofic, numai 10-15% este transferata la nivelul trofic superior, restul de 85-90% fiind disipata in cursul activitatilor metabolice prin respiratie. In consecinta, la nivelul trofic cel mai inalt (animale pradatoare), poluantul poate fi prezent in tesuturi, la concentratii care depasesc de 10⁴-10⁶ ori si in cazuri extreme de 2,5 x 10⁶ ori concentratia sa in mediul natural.

Masurarea concentratiei DDT-ului la toate verigile lantului trofic ilustreaza un principiu general al poluarii in sensul ca, cu cat un organism este mai sus in piramida trofica, cu atat poluantul este mai concentrat in tesuturile sale. Daca producatorii primari concentreaza poluantul in concentratii mai mari decat in mediu si fiecare nivel trofic succesiv il concentreaza peste nivelul existent in hrana sa, devine evident ca un erbivor poate acumula mai mult poluant decat plantele pe care le consuma, iar un carnivor de la varful piramidei trofice acumuleaza o cantitate si mai mare. In felul acesta, unele molecule recalcitrante, netoxice la concentratii existente in natura devin toxice prin acumulare in concentratii mari in tesuturi, determinand efecte negative asupra speciilor situate la sau aproape de varful lantului trofic.

Fenomenul de bioacumulare are un caracter universal in natura, deoarece la fiecare nivel trofic exista organisme "concentratoare". Restrangerea biomasei la nivelele trofice superioare este asociata cu acumularea de substante recalcitrante.

Aplicatii practice. Biodegradarea si indepartarea poluantilor recalcitranti, respectiv detoxifierea si mineralizarea lor de catre microorganisme reprezinta un factor esential in incercarea de a atenua efectele lor ecologice. Procedeele menite sa realizeze acest obiectiv sunt:

producerea unor pesticide mai usor degradabile, prin includerea in structura lor a unor grupari chimice cu echivalente naturale sau introducerea unor modificari care le transforma in substraturi nutritive pentru microorganismele din apa si din sol;

utilizarea unor teste care sa stabileasca gradul de biodegrabilitate intr-un interval rezonabil, precum si lipsa de toxicitate si inocuitatea .

Constructia unor tulpini bacteriene capabile sa degradeze substantele xenobiotice, prin metode genetice (schimbul natural de gene prin cocultivare) si prin tehnici de inginerie genica.

Pe baza acestor principii, Knackmuss (1984) a obtinut tulpini de Pseudomonas capabile sa degradeze o gama larga de clorbenzoati si clorfenoli. Prin transferul de plasmide, Ghossal (1985) a obtinut o tulpina de P. cepacia capabila sa catabolizeze erbicidul 2,4,5-T, desi nici un microorganism natural nu a realizat aceasta degradare.

Nu se stie daca in ecosistemele naturale are loc un schimb similar de gene codificatoare ale enzimelor capabile sa degradeze substante xenobiotice si nici daca transconjugantii isi exercita capacitatile degradative fata de compusii xenobiotici.