Biosinteza penicilinei

Biosinteza penicilinei

Structura de baza a tuturor tipurilor de peniciline este acidul 6-aminopenicilanic, ce consta dintr-un inel tiazolidinic si un inel b-lactamic. La acidul 6-aminopenicilanic, in pozitia 6, este atasata o catena variabila. Microorganismul producator este o tulpina de Penicillium chrysogenum, inalt producatoare, selectionata prin mutageneza.

Faza initiala ("de fermentatie") este cea in care se asigura cultivarea si cresterea in conditii optime a microorganismului producator. Cultivarea se face in tancuri de mare capacitate, prevazute cu dispozitive de aerare cu aer steril, de agitare si de reglare a temperaturii. Sinteza optima a antibioticelor b-lactamice produse de fungi este in mare masura dependenta de sursele de C disponibile.

Mediul de cultivare contine lactoza (ca sursa de C), faina de rapita (ca sursa de azot), saruri minerale (sulfat de sodiu, sulfat de amoniu, carbonat de calciu, monofosfat de potasiu etc.). La nevoie se adauga, in conditii de sterilitate, o substanta tensioactiva, care stimuleaza dezvoltarea miceliului fungic prin dispersarea culturii si marirea gradului de aerare si un agent antispumant, care opreste formarea spumei datorita agitarii, aerarii si agentului tensioactiv.

Fiecare microorganism producator, ca si fiecare antibiotic, au caracteristici proprii si, in consecinta, tehnica producerii industriale este adaptata acestor particularitati.

Compusii hidrofili ai cefalosporinelor sunt sintetizati de fungi, bacterii Gram pozitive si Gram negative, iar penicilinele hidrofobe sunt produse numai de fungii filamentosi.

Fazele sintezei au fost identificate prin utilizarea atomilor marcati (C¹⁴ si C¹², H³ si N¹⁵). Primele doua trepte ale biosintezei penicilinei si cefalosporinei sunt comune. Penicilinele si cefalosporinele naturale sunt formate din aceiasi aminoacizi: acidul L-a-aminoadipic, L-cisteina, L-valina

Acidul L-a-aminoadipic este un aminoacid neproteic si este sintetizat pe calea aminoadipatului specifica fungilor, care duce la formarea L-lizinei (A. Brakhage, 1998).

In prima reactie, cei 3 aminoacizi precursori sunt condensati pe cale neribosomala in tripeptidul d (L-a-aminoadipil)-L-cisteinil-D-valina (ACV). Condensarea neribosomala a tripeptidului limiteaza calea sintezei. Toate reactiile necesare formarii tripeptidului sunt catalizate de o singura enzima multifunctionala, denumita ACV-sintetaza. Originea acidului a-aminoadipic este diferita la fungi si la actinobacterii. La fungi, produsul este un intermediar al caii lizinei, iar la actinobacterii, acidul a-aminoadipic este produsul de catabolism al lizinei.

In treapta a II-a, inchiderea inelului oxidativ al tripeptidului linear duce la formarea unei structuri inelare biciclice - acidul aminopenicilanic, adica inelul b-lactamic cu 4 atomi, fuzionat cu inelul tiazolidinic format din 5 atomi. Nucleul comun biciclic este comun pentru toate penicilinele. Reactia este catalizata de izopenicilin-N-sintaza. Rezulta izopenicilina N, a carei activitate de antibiotic este slaba.

In treapta a III-a a biosintezei, lantul lateral al acidului L-a-aminoadipic al izopenicilinei N este schimbat cu un grup acil hidrofob. Schimbul este catalizat acil CoA-izopenicilin N-acil-transferaza.

Tripeptidul ACV se formeaza pe calea mecanismului sintezei neribosomale a matritei cu S, din aminoacizii precursori. Sistemul multienzimatic al ACV-sintetazei este alcatuit din monomeri cu mase moleculare de circa 420 kDa si manifesta activitati catalitice diverse: 1)recunoasterea specifica a celor 3 aminoacizi si activarea lor; 2)formarea puntii peptidice; 3)izomerizarea L-valinei la forma D si eliberarea peptidului.

Ca si in biosinteza ribosomala a peptidelor, functia -COOH a aminoacidului este activata prin formarea unei anhidride cu a-fosfatul din ATP si eliberarea pirofosfatului (P-Pi). Dupa activarea unui aminoacid, aminoacil-adenilatul este clivat sub actiunea unei enzime thiol. Se formeaza o legatura tioesterica intre enzima thiol si aminoacid, cu eliberarea AMP. Aminoacizii tioesterificati joaca acelasi rol ca si aminoacizii legati de ARNt in biosinteza peptidelor ribosomale. Ei sunt intermediari cu energie inalta, care devin tintele atacului nucleofilic al gruparii NH₂ al unui al II-lea aminoacid. Astfel se formeaza puntea peptidica. Ca si in sinteza ribosomala, peptidul nascent creste de la capatul NH₂, spre capatul COOH, iar peptidele intermediare ramin legate de enzima, ca tioesteri. Specificitatea de substrat este mai putin stricta decat in sinteza proteinelor.

Microorganismul producator sintetizeaza, in mod obisnuit, mai multe tipuri de penicilina, cu aceiasi structura de baza, dar care difera dupa natura catenei laterale atasata nucleului biciclic prin intermediul unei functii amidice. Daca procesul de biosinteza se desfasoara fara adaugarea catenei laterale, sunt produse penicilinele naturale (penicilina G sau benzil-penicilina). Dintre penicilinele naturale, numai penicilina G (benzil-penicilina) este utilizabila in clinica. Pentru penicilina G, molecula precursoare a catenei laterale este acidul fenil-acetic (C₆H₅CH₂) sau unul dintre derivatii sai (fenilacetatul de Na sau fenilacetamida). Acidul fenil-acetic rezulta si prin transformarea fenil-etilenaminei din extractul de porumb, in acidul fenilacetic (fig 141).

Fig. 141. Structura moleculara a penicilinei G. Dupa clivajul enzimatic se formeaza acidul 6-aminopenicilanic si acidul peniciloic.

Biosinteza industriala a penicilinei cu P. chrysogenum s-a realizat utilizind lactoza ca sursa de C, deoarece furnizeaza cel mai inalt titru al penicilinei. Glucoza in exces determina reducerea ampla a titrului penicilinei.

Deoarece separarea penicilinelor prin purificare este un proces dificil, in mediul de crestere se adauga molecule precursoare ale catenei laterale, care asigura sinteza unui anumit tip de penicilina, inhiband sinteza celorlalte tipuri. Cea mai utila penicilina, cea cu activitate fata de bacteriile Gram negative, este rezultatul unui proces de biosinteza, combinat cu o cale chimica, prin adaugarea precursorilor specifici in timpul fermentatiei. Se obtin astfel peniciline de semisinteza (ampicilina, amoxicilina, meticilina). In acest caz, benzil-penicilina produsa in mod natural de miceliul fungic, este clivata chimic sau enzimatic si rezulta acidul 6-aminopenicilenic, supus modificarii chimice prin adaugarea unei catene laterale.

Penicilinele de semisinteza au avantajul unui spectru mai larg de activitate si al administrarii orale.

Compozitia mediului de cultura este diferita de la un producator la altul. Sursa de carbon a mediului este glucoza si lactoza, iar sursa de aminoacizi si de factori de crestere este hidrolizatul de porumb (corn steep), un ingredient major al mediului. Glucoza poate fi folosita ca unica sursa de carbon, dar are dezavantajul metabolizarii rapide si al efectului de represie prin catabolit. De aceea trebuie sa aiba o concentratie mai mica si se adauga treptat. Sunt mai favorabile metodele de cultivare continua. In culturile discontinui se folosesc ambele surse de carbon.

Lactoza se metabolizeaza lent si nu produce fenomenul represiei prin catabolit. Uleiul de floarea soarelui are rol de sursa de carbon, dar este in primul rand agentul antispumant. CaCO₃ se adauga pentru stabilitatea pH. Mediul contine microelemente si obligatoriu, un precursor care sa furnizeze precursorii catenei laterale a antibioticului, orientand sinteza spre un anumit tip de penicilina.

Prin adaugarea moleculelor precursoare adecvate, sinteza poate fi orientata in sensul producerii sintezei penicilinei specifice. Acidul fenilacetic (C₆H₅-CH₂COOH) este precursorul sintezei penicilinei G. Pentru sinteza penicilinei V, ca precursor se foloseste acidul fenoxiacetic (C₆H₅-O-CH₂-COOH).

Penicilinele sunt sintetizate intr-un proces de cultivare submersa, in fermentatoare de 40 000 - 200 000 litri. Este un proces strict aerob si necesita aerare energica. Penicilina este un metabolit secundar tipic.

Faza "fermentativa" dureaza circa 120 de ore la 25^o si cuprinde trei etape: a)etapa initiala, in care are loc cresterea microorganismului producator, pe seama metabolizarii glucozei. Producerea de antibiotic este nesemnificativa; b)etapa de maturatie, dupa epuizarea sursei de carbon, cu sinteza masiva de antibiotic;

c) etapa de declin sau de imbatranire, in cursul careia producerea de antibiotic este nula si survine chiar scaderea cantitatii sale prin degradare.

Procesul productiei de antibiotic, strict aerob este urmarit prin controlul modificarilor biochimice (pH, concentratia lactozei si a NH₃), caracteristicile microbiologice (aspectul si gradul de dezvoltare a miceliului) si a concentratiei de antibiotic in mediul de cultura. Procesul este submers, necesita o aerare eficienta si este oprit in momentul in care intreaga cantitate de lactoza din mediu a fost metabolizata. In absenta sursei de carbon, cresterea miceliului inceteaza si survine autoliza. NH₃ alcalinizeaza mediul si la pH alcalin, penicilina este instabila.

Penicilina se elibereaza in mediu. Sub 1% ramane asociata cu miceliul fungic. Miceliul se indeparteaza prin filtrare.

Tulpina de Penicillium notatum utilizata initial pentru biosinteza penicilinei, a produs 6 mg/litru. {n 1941, in SUA au inceput studiile pentru ameliorarea randamentului de productie al tulpinii de P. notatum si pentru identificarea unor noi tulpini producatoare de penicilina. S-a identificat astfel o noua specie, P. chrysogenum, cu un randament de productie mult mai bun, de 60 mg/litru.

Studiile de selectie s-au facut prin mutageneza cu raze x si uv, cu azotiperita. S-au urmarit doua aspecte: obtinerea unor tulpini lipsite de pigmentul galben - chrisogenina - care ingreuneaza operatiile de purificare a antibioticului; obtinerea tulpinilor inalt producatoare de penicilina, peste 20 g/litru. Cele mai multe tulpini obtinute in programele de dezvoltare sunt mutante reglatoare. Obtinerea lor se bazeaza pe conceptul ca mecanismele de control ale sintezei antibioticelor pot fi depasite prin procese mutationale. Productia industriala a penicilinelor si cefalosporinelor se realizeaza cu mutante inalt producatoare de Penicillium si respectiv Cephalosporium acremonium. Cefamicinele sunt produse de specii de Streptomyces.

S-au obtinut mutante de Penicillium si Cephalosporium care cresc in profunzime, in conditii de aerare, cu randament de productie de 4500 UI/ml benzil-penicilina, ceea ce echivaleaza cu 30 g/l, in bioreactoare cu volume de 250-400 m³ (Diaconu, Nechifor, 1988).

De obicei, mutantele sunt genetic instabile si necesita masuri de mentinere a potentialului de biosinteza si de conservare. Cele mai adecvate metode de conservare sunt pastrarea celulelor vii in azot lichid (-196^o) sau liofilizarea sporilor.

Reglarea biosintezei penicilinei. Sinteza penicilinei este supusa mecanismului reglarii feed-back al sintezei metabolitilor primari. Desi penicilina este un metabolit secundar, sinteza sa este influentata de metabolitii primari, deoarece acestia sunt precursorii metabolitilor secundari. Astfel, mecanismele reglatoare ale sintezei metabolitilor primari influenteaza producerea antibioticului.

Unul dintre cei trei aminoacizi care participa la sinteza nucleului comun al penicilinei este L-valina. Biosinteza valinei este reglata printr-un mecanism feed-back: valina exercita o actiune inhibitorie a activitatii primei enzime a lantului de biosinteza. Daca prima enzima este inactivata, biosinteza valinei este inhibata si astfel este inhibata biosinteza penicilinei. Daca in mediu se adauga lizina, biosinteza penicilinei scade foarte mult. La fungi, lizina se sintetizeaza pe calea acidului a-aminoadipic. Lizina exercita o inhibitie feed-back a activitatii primei enzime a lantului de biosinteza, enzima implicata in sinteza acidului a-aminoadipic.

Extractia antibioticului. Lichidul obtinut la sfarsitul primei faze este vascos, cu miros puternic si contine substante toxice, compusi piretogeni si numeroase impuritati, care depasesc de sute de ori cantitatea de antibiotic. Extractia antibioticului din mediu se face cu solventi organici (pentru penicilina, cu acetat de amil sau acetat de butil la pH = 2,5). Cele insolubile (tetraciclina) se separa si se solubilizeaza in solventi speciali sau separarea unora (streptomicina, neomicina) se face cu ajutorul rasinilor schimbatoare de ioni.

Antibioticul separat din supernatantul de crestere este supus unui proces de purificare, sterilizare, spalare, cristalizare si uscare in vid. Daca dupa controalele finale, chimice, microbiologice si toxicologice (pentru absenta toxicitatii si a substantelor piretogene) indeplineste conditiile de utilizare, antibioticul este standardizat in raport cu o unitate de activitate stabilita prin conventie internationala si este trecut in faza ultima, cea de conditionare (repartizare in fiole, flacoane etc.) sub forma de pulberi cristaline (prin sublimarea in vid a solutiilor) sau incorporat in diferite substante. Penicilina se prezinta ca o pulbere alba, microcristalina, hidrosolubila si netoxica pentru om, chiar in doze mult mai mari decat cele active fata de microorganisme.

S-au produs peste l00 de peniciline de biosinteza. Pentru obtinerea celor mai utile peniciline se foloseste procedeul combinat, fermentativ si chimic, prin care rezulta peniciline semisintetice.

Cefalosporinele (nocardicina, acidul clavulanic si tienamicina) sunt antibiotice b-lactamice care contin inelul dihidrotiazina, in loc de tiazolidina. Au fost descoperite ca fiind produse de Cephalosporium acremonium, dar sunt sintetizate si de alti fungi, ca si de unele procariote. C. acremonium produce 4 tipuri morfologice de celule, care reprezinta stadii ale ciclului de crestere: hife, artrospori, conidii, gemule. Diferentierea morfologica a lui C. acremonium pare a fi legata de sinteza cefalosporinei C. Rata maxima a sintezei cefalosporinei C coincide cu conversia fragmentelor hifale la artrospori.

Sinteza cefalosporinei C este influentata de metionina. Adaugarea metioninei in mediul de fermentatie mareste semnificativ productia de antibiotic. Metionina are rol de donor de S pentru sinteza antibioticului si este un inductor al anumitor enzime implicate in sinteza (d-(L-a-aminoadipil-L-cisteinil-D-valin sintetaza, izopenicilin N sintetaza = ciclaza), dar are si o functie reglatoare si stimuleaza formarea artrosporilor.

Sinteza cefalosporinei C de catre C. acremonium pare a fi insotita de cresterea cantitatii de acid linoleic.

Acidul clavulanic are o importanta clinica deosebita, pentru ca desi nu este un antibiotic foarte eficient, se administreaza in asociatie cu b-lactamicele, deoarece este cel mai bun inhibitor al sintezei b-lactamazelor.

Semisinteza. Utilizarea penicilinei G (de biosinteza) prezinta cateva dezavantaje importante: este sensibila la penicilinaze, enzimele care o inactiveaza prin actiune asupra ciclului b-lactamic; este instabila in mediul acid al stomacului si de aceea se administreaza numai prin injectare; se elimina foarte repede din circulatie, prin rinichi. Pentru a mentine o concentratie activa, se injecteaza la intervale scurte; este activa numai asupra bacteriilor Gram pozitive.

Obtinerea antibioticelor de semisinteza se bazeaza principiul utilizarii moleculei native, de la care se obtin diferite derivate mai active, prin metode de sinteza. Moleculele rezultate sunt asemanatoare celor naturale, cu valoare terapeutica superioara sau fara valoare. Numai benzil-penicilina, penicilina V si acidul clavulanic sunt molecule naturale. Celelalte peniciline, toate cefalosporinele si cefamicinele sunt derivate ale moleculelor obtinute prin biosinteza.

Atomii moleculei de penicilina sunt reactivi si permit un spectru larg de modificari. Practic, fiecare atom din structura penicilinei si cefalosporinei naturale, cu exceptia celui de N din ciclul b-lactamic, a constituit sediul unei modificari chimice (Diaconu, Nechifor, 1988). Multe antibiotice sunt rezultatul unei singure modificari, iar altele rezulta dupa doua sau chiar mai multe transformari succesive.

Cele mai importante modificari chimice ale moleculei native sunt:

dezacilarea penicilinelor si cefalosporinelor naturale in scopul obtinerii acidului 6-aminopenicilenic (A6AP), respectiv acidului 7 aminocefalosporinic (A7AC);

acilarea gruparii 6(7) NH₂ din A6AP, respectiv A7AC si obtinerea penicilinelor si cefalosporinelor semisintetice;

transformarea penicilinei in cefalosporine prin extensia ciclului;

modificarea pozitiei 3-acetoxi din cefalosporinei;

esterificarea grupei 3-carboxil a penicilinei.

Cele mai importante antibiotice de semisinteza sunt ampicilina, oxacilina, meticilina. Jumatate din molecula se obtine prin biosinteza, iar cealalta jumatate prin sinteza chimica. Penicilinele de semisinteza sunt diferite de cele de biosinteza, prin catenele laterale. Fungii din g. Penicillium nu sintetizeaza acidul 6-aminopenicilanic. Penicilinele de semisinteza se obtin din penicilina G, supusa actiunii unei enzime - penicilin-acilaza, extrasa din E. coli. Enzima scindeaza catena laterala (radicalul benzil) si elibereaza acidul 6-aminopenicilanic. Ulterior, pe calea sintezei chimice, gruparea aminica este acilata cu diferiti radicali si rezulta diferite peniciline de semisinteza.

Sinteza chimica. Cercetarile privind posibilitatea sintezei chimice a antibioticelor b-lactamice au fost stimulate in special de dificultatea metodelor de separare-purificare. Cresterea randamentului de biosinteza, odata cu utilizarea tulpinilor inalt productive (de 100 de ori mai productive decat tulpina de origine izolata de Fleming), a facut ca metoda sintezei chimice sa ramana numai de interes stiintific. Sinteza chimica are ca scop obtinerea unor molecule analoge celor naturale, cu activitate antimicrobiana superioara, mai ieftine, fara efecte secundare asupra macroorganismului. Pe cale sintetica s-au obtinut peniciline, cefalosporine peneme, carbapeneme si monobactame.

Metodele de ameliorare a productiei de antibiotice

Productia de antibiotice se gaseste in impas, datorita fenomenelor de rezistenta multipla, intalnite frecvent la bacterii. Din aceasta cauza se preconizeaza obtinerea unor antibiotice noi prin tehnica fuziunii de protoplasti bacterieni sau fungici. Cele doua tulpini celulare (bacteriene, respectiv fungice) supuse procedeului fuziunii, trebuie sa faca sinteza a doua antibiotice diferite, din aceiasi familie. Prin cuplarea artificiala a celor doua cai de biosinteza poate sa rezulte un nou antibiotic (un antibiotic hibrid).

Fuziunea protoplastilor se poate utiliza in scopul cresterii randamentului productiei de antibiotice. Se procedeaza la fuziunea protoplastilor unei tulpini bacteriene inalt producatoare, care creste incet sau este pretentioasa la conditiile de crestere, cu o linie bacteriana care face sinteza antibioticelor cu o rata inferioara, dar se dezvolta repede si nu are exigente nutritive deosebite. Prin fuziune rezulta organisme care cumuleaza proprietati noi, convenabile atat in ceea ce priveste productia de antibiotice, cat si exigentele nutritive.

O alta modalitate de crestere a ratei de sinteza a antibioticelor este amplificarea genica. Genele codificatoare ale sintezei antibioticelor sunt cromosomale si extracromosomale (plasmidiale). Numarul plasmidelor per celula este variabil in functie de tipul de control pe care celula il exercita: un control riguros are ca efect existenta unui numar mic de plasmide in celula (1-5 copii); un control relaxat permite cresterea numarului de copii plasmidiale per celula (50-l0). In aceste conditii, daca genele cdificatoare ale sintezei antibioticului sunt plasmidiale, randamentul sintezei creste foarte mult.

Transferul genelor codificatoare ale sintezei unui antibiotic, prin tehnologia ADN recombinant, pare a nu fi realizabil, deoarece genele sunt dispersate. De aceea, s-a recurs la un artificiu: se incearca marirea productiei de antibiotic prin grefarea unor gene promotor foarte eficiente, care sa grabeasca intrarea in actiune a operonului codificator.

O alta cale pentru ameliorarea producerii de antibiotice este biosinteza mutationala sau mutasinteza. Principiul metodologic este urmatorul: sinteza unui antibiotic se desfasoara pornind de la un produs initial, prin etape intermediare, pana la sinteza produsului final. In aceasta tehnologie se folosesc microorganisme mutante, cu incapacitatea de a face sinteza unui produs, aproape de capatul lantului de sinteza. Daca in mediul de crestere se adauga compusul natural, microorganismul produce antibioticul natural. Daca in mediul de crestere se adauga un alt compus, nenatural (de sinteza chimica), celulele incorporeaza acest produs chimic nou si sinteza este orientata in functie de natura produsului care a fost furnizat. Aceasta tehnica s-a denumit biosinteza mutationala.

Pentru producerea antibioticelor noi, industria de biosinteza a utilizat doua cai majore:

prin procedee de mutageneza s-a urmarit selectia unor tulpini inalt producatoare. Pe aceasta cale, randamentul biosintezei de antibiotice s-a ameliorat permanent. Procedeul este foarte laborios, deoarece mutageneza este o metoda oarba, ce presupune testarea a mii si mii de tulpini celulare, dupa iradiere cu raze UV, X sau dupa tratamentul cu substante chimice mutagene (azotiperita). Aceasta metoda este tipica pentru producerea penicilinei, cu tulpini mutante de P. chrysogenum. Randamentul tulpinilor actuale, obtinute prin mutageneza cu radiatii gama (Co^6o) este de mii de ori superior fata de al tulpinii originale;

producerea de antibiotice cu un oarecare grad de modificare chimica, prin procedeul semisintezei. Metoda consta in grefarea unui radical chimic, pe o molecula de antibiotic, produsa pe o cale naturala.