Centromerii, Telomerii

Centromerii.

Se poate remarca caci toti cromozomii reprezentati in figura 12.17 poseda un situs la unde suprafata lor exterioara este net rascroita (scobita). Aceasta scobitura reprezinta centromerul cromozomului (Fig. 12.18). Mai sus am aratat ca centromerii contin heterocromatina constitutiva. Centrometrii cromozomilor umani contin o secventa lunga de aproximativ 170 nucleotide (ADN satelit a) dispuse in tandem si repetate de 2 000 la 30 000 ori per centromer. ADN centromeric fixeaza proteine specifice, intre altele cele care servesc drept situs de fixare microtubulilor care separa cromozomii in timpul diviziunii mitotice.

Telomerii

Cele doua extremitati ale moleculei de ADN a fiecarui cromozom poseda un segment foarte particular de secvente repetitive numite telomeri, care formeaza un "coif" la fiecare capat al cromozomilor. La om telomerii poseda secvente TTAGGG/AATCCC repetitive de mii de ori (Fig. 12.19a). Contrar celor mai multe tipuri de secvente repetitive, care variaza mult intre specii, chiar daca ele sunt inrudite si apropiate, in cazul telomerilor de la om si de la toate vertebratele studiate pana in prezent gasim aceeasi secventa telomerica. La alte organisme cum sunt protozoarele si drojdiile, telomerii au secvente diferite dar, ca si pentru vertebrate, o catena este intotdeauna bogata in resturi de guanozina iar complementara sa in resturi de citozina. Catena bogata in G este orientata in sensul 5'-3' catre extremitatea cromozomului si depaseste cu 12 la 15 nucleotide extremitatea catenei bogata in C. Datorita existentei acestui dezechilibru catena bogata in G formeaza o scurta coada monocatenara la cele doua extremitati ale cromozomului. Aceasta dispozitie persista de la o generatie celulara la alta datorita unei enzime speciale, telomeraza, care poate adauga noi unitati repetitive la extremitatea 3' a catenei bogate in G (Fig. 12.19b).

Telomeraza, ale carei proprietati au fost bine studiate de catre Elisabeth Blackburn si colegii sai de la Universitatea din California, San Francisco, este o transcriptaza inversa care asambleaza fragmente de ADN folosind o catena (matrita) de ARN. Telomeraza este o enzima foarte neobisnuita in sensul in care ARN care serveste drept model face in realitate parte din enzima. Secventele telomerice sunt si situsuri de fixare a mai multor proteine specifice (Fig. 12.20).

Telomerii au roluri importante: ei sunt necesari replicarii complete a cromozomului; protejeaza cromozomii de nucleaze si de alte influente destabilizatoare; impiedica fuziunea dintre extremitatile cromozomilor si faciliteaza interactiile dintre extremitatile cromozomilor si anvelopa nucleara in anumite tipuri celulare. Experiente recente sugereaza alte roluri. Celulele normale nu sunt capabile sa se divida in cultura decat de un numar limitat de ori inainte de a da semne de "imbatranire" si in final de a muri. Au fost propuse diferite ipoteze pentru a explica aceasta observatie: cea mai recenta este scurtarea progresiva a telomerilor. Telomerii se scurteaza deoarece cea mai mare parte a celulelor umane par a fi lipsite de telomeraze. Contrar celulelor normale celulele canceroase nu inceteaza sa creasca in cultura; spunem ca acestea devin "nemuritoare". Unul dintre factorii care ar putea contribui la imortalizarea celulelor maligne este reactivarea telomerazei, care conserva lungimea telomerilor de-a lungul generatiilor. De fapt, cercetari recente au demonstrat ca un anumit numar de cancere la om au o activitate a telomerazei care nu poate fi evidentiata in celulele normale. Aceasta descoperire a declansat cercetarea inhibitorilor specifici ai acestei enzime sperand ca acestia ar putea opri cresterea anumitor tumori.

Experiment pentru evidentierea importantei originii de replicare (a)

La ADN eucariotelor, originile de replicare au fost pentru prima data identificate prin functiile lor in studiile de transformare la drojdii. Daca celulelor de drojdii le lipseste o gena particulara (ex, una dintre genele implicate in biosintaza leucinei), ele pot fi transformate cu plasmide care contin clonata gena lipsa (ex, gena LEU). Transformantii LEU+, care pot creste pe mediu fara leucina sunt obtinuti cu o frecventa mai mare daca plasmida contine mai multe secvente din genomul de drojdie de aproximativ 100 pb, numite secvente replicative autozomale (ARS). O ARS actioneaza ca o origine de replicare, permitand plasmidei circulare sa se replice in nucledul de drojdii.

Experiment pentru evidentierea importantei originii de replicare (b)

Centromerii. Intr-o cultura celulele transformate cu o plasmida simpla circulara care contine fragmentul LEU/ARS, numai aproximativ 5-20 % dintre progenituri contin plasmida datorita segregarii mitotice gresite a plasmidelor; ca rezultat, majoritatea plasmidelor ADN nu intra in inmugurire. Totusi, daca fragmentele de restrictie ale ADN genomic de la drojdii sunt clonate intr-o astfel de plasmida circulara, o mica fractiune dintre fragmente confera o segregare egala a plasmidelor atat in celulele mama cat si fiice dupa mitoza. Deoarece fragmentele cu acest efect au fost gasite ca facand parte din centromerii fiecarui cromozom de drojdie, ei au fost numiti secvente CEN. Astfel de experimente au condus la izolarea secventelor care folosesc segregarea mitotica pentru extinderea la mai mult de 90% a numarului progeniturilor Leu- care contin plasmida LEU. Aceste celule si majoritatea descendentilor lor cresc foarte bine pe mediu fara leucina.

Experiment pentru evidentierea importantei telomerilor (c)

Daca plasmidele circulare care contin atat secvente CEN cat si ARS sunt taiate cu o enzima de restrictie, ele devin lineare. Astfel de plasmide lineare nu se replica in drojdii decat daca ele contin secvente telomerice speciale ligate la capetele lor. Primul experiment de succes care a implicat transfectia celulelor de drojdie cu plasmide lineare a fost realizat folosind capetele unei molecule de ADN care este cunoscuta ca replicandu-se liniar in protozoarul ciliat Tetrahymena.

Cercetarile au aratat ca ADN telomeric poseda un tip de structura caracteristica care este adaugata la capetele moleculelor de ADN de catre o enzima speciala telomer terminal transferaza sau telomeraza. Au fost determinate structurile telomerilor pentru o serie de organisme, inclusiv la om; majoritatea sunt secvente oligomere repetitive cu un continut ridicat in G la nivelul catenei orientate 5'-3' catre telomer. Aceste secvente simple sunt repetitive la capetele terminale ale cromozomilor si variaza de la cateva sute de de perechi de baze la drojdii si protozoare la cateva mii la vertebrate. Capatul 3' ale catenelor bogate in G sunt extinse cu 12-16 nucleotride dincolo de capatul 5' al catenei complementare bogate in C. Aceasta regiune este legata de proteine specifice care protejeaza capetele cromozomilor lineari de atacul exonucleazelor.

Enzimele care adauga secvente telomerice sunt complexe formate atat din proteine cat si din ARN. Deoarece secventa ARN serveste drept matrita pentru adaugarea de dezoxiribonucleotide la capetele telomerilor, sursa de enzima si nu sursa primerului ADN telomeric determina secventa adagata. Astfel telomeraza este o forma specializata de revers-transcriptaza care poseda propria sa matrita ARN pentru a realiza sinteza directa a ADN.

Actiunea telomerazei este importanta pentru prevenirea scurtarii cromozomilor in timpul replicarii ADN. Soarecii "knockout" care nu pot produce ARN-ul asociat telomerazei nu exprima activitate telomerazica si telomerii lor se scurteaza considerabil cu fiecare generatie. Astfel de soareci se pot reproduce normal timp de trei generatii inainte ca absenta telomerilor sa determine fuziunea terminala a cromozomilor si pierderea acestora. Dupa patru generatii potentialul de reproducere a acestor soareci knockout intra in declin si se opreste la a sasea generatie.

Secvente "consens" la drojdii

O data ce regiunile centromerice de la drojdii care confera segregare mitotica au fost clonate, secventele lor pot fi determinate si comparate. Compararea centromerilor diferiti de la drojdii au evidentiat trei regiuni (I, II si III) care sunt necesare unui centromer sa functioneze. Regiunea II pare sa aiba o lungime constanta (78-86 baze) si contine secvente consens nedefinite dar bogate in resturi A si T. O secventa simpla de la Drosphila care provine din regiunea centromerica prezinta unelele similitudini cu regiunile I si III de la drojdii, sugerand ca mecanisme similare con troleaza segregarea la drojdii si la eucariotele superioare

Organitele care contin ADN

Desi majoritatea ADN de la eucariote se afla dispus in nucleu, anumite cantitati de ADN sunt prezente si an mitocondriile animalelor, plantelor si fungilor si in cloroplastele plantelor. Aceste orfganite sunt principalele situri de producere a ATP, in timpul fosforfilarii oxidative din mitocondrie si a fotosintezei din cloroplaste. Multe dovezi indica evolutia cloroplastelor si mitocondriilor din bacterii printr-un proces de endocitoza ancestrala, cu formare de endosimbionti. O data cu evolutia, o parte a genelor bacteriene au fost transferate nucleului. Totusi,mitocondriile si cloroplastele actuale au pastrat o molecule de ADN circular care codifica pentru proteine esentiale functionarii organitelor si pentru ARNr necesar procesului de transcriptie de la acest nivel.

Mitocondriile contin mai multe molecule de ADNmt

Mitocondriile sunt destul de marfi pentru a putea fi vizualizate la microscopul optic iar ADN mitocondrial poate fi evidentiat prin microscopie de fluorescenta. ADNmt este localizat in interiorul mirocondriei, in regiunea numita matrita. Daca judecam dupa numarul de puncte fluorescente galbene dintr-o celula de Euglena gracilis, aceasta contine cel putin 30 de molecule de ADNmt.

Daca colorantii folositi pentru a vizualiza ADN nuclear si mitocondrial, nu afecteaza cresterea celulara si diviziunea, replicarea ADNmt si diviziunea retelei mitocondriale poate fi urmarita microscopic.

Astfel de studii demonstreaza ca ADNmt se replica in timpul interfazei. In mitoza fiecare celula fiica primeste aproximativ acelasi numar de mitocondrii, dar cum nu exista mecanisme pentru impartirea exacta a mitocondriilor, unele celule contin mai mult ADNmt decat altele. Toate mitocondriile din celulele eucariote contin mai multe molecule de ADNmt . Astfel numarul total de ADNmt intr-o celula depinde de numarul de mitocondrii, de marimea ADNmt si de numarul de ADNmt per mitocondrie.

Mostenirea citoplasmatica a mitocondriilor mutante

Studiile asupra mutantilor de drojdii si a altor organisme unicelulare indica ca mitocondria exprima mostenire citoplasmatica si deci trebuie sa contina propriul sau sistem genetic. De exemplu, mutatiile "petite" de drojdii manifesta anormalitati structurale la nivelul mitocondriilor si sunt incapabile sa realizeze forforilare oxidativa. Ca rezultat, celulele mici cresc mult mai incet decat tipul salbatec si formeaza colonii mici. Incrucisarea genetica intre diferitele tulpini haploide de drojdii demonstreaza ca mutatia "petite" nu segrega cu nici o gena sau cromozom nuclear cunoscut. In ultimile studii, s-a constatat ca la majoritatea mutantilor "petite" exista deletii la nivelul ADNmt.

Mostenirea mitocondriala la drojdii este biparentala: in timpul fuziunii celulelor haploide, ambii parinti contribuie egal cu citoplasma la formarea diploidului. La mamifere si la majoritatea altor animale, totusi sperma contribuie cu putina citoplasma la zigot, virtual toate mitocondriile din embrion sunt derivate din cele ale ovulului si nu din sperma. Studiile pe soareci au demonstrat ca 99,99% din ADNmt este mostenit pe cale materna. La plantele superioare ADNmt este mostenit exclusiv intr-o maniera uniparentala de la parintele femel (oul) si nu mascul (polenul).

Intregul genom mitocondrial de la un numar mare de organisme a fost deja clonat si secventializat. ADNmt din aceste surse codifica pentru ARNr, ARNt si proteine mitocondriale esentiale. Toate proteinele codificate de citre ADNmt sunt sintetizate la nivelul ribozomilor mitocondriali: Toate polipeptidele sintetizate mitocondrial nu sunt enzime complete ci numai subunitati ale unor complexe multimere implicate in transportul electronilor si in sinteza ATP. Majoritatea proteinelor localizate in mitocondrie, cum sunt ADN si ARN polimerazele, sunt sintetizate de ribozomii citoplasmatici si sunt importate in organite.

ADN mitocondrial uman

Surprinzator, marimea moleculelor de ADNmt, numarul si natura proteinelor pe care acestea le codifica, si chiar codul genetic mitocondrial, variaza mult intre diferitele organisme.

ADNmt uman, o molecula circulara care a fost complet secventializata, estze printre cele mai mici molecule de ADNmt cunoscute deoarece contine 16 569 perechi de baze. Acesta codifica pentru doua molecule de ARNr prezenti in robozomii mitocondriali si pentru cei 22 ARNt folositi in procesul de translatie mitocondrial. ADNmt uman contine 13 secvente care incep cu codonul ATG (metionina) si terminate cu un codon STOP si sunt destul de lungi pentru a codifica o polipeptida mai mare de 50 aminoacizi; toate proteinele posibil codificate de aceste faze de lectura au fost identificate. ADNmt de la mamifere, spre deosebire ADN nuclear, este lipsit de introni si nu contine secvente necodante.

ADNmt de la nevertebrate are aproximativ aceeasi marime cu ADNmt uman, dar ADNmt de la drojdii este de aproximativ de 5 ori mai mare (78 000 pb). Moleculele de ADNmt de la drojdii si alte eucariote superioare codifica multi dintre produsii acelorasi gene ca si cele de la mamifere, ca si pentru alte gene care la mamifere sunt dispuse in nucleii celulelor de mamifere.

In contrast cu alte eucariote, care contin un singur tip de ADNmt, plantele contin mai multe tipuri de ADNmt care par sa se recombine unele cu altele. ADNmt de la plante este mult mai mare ca marime decat la alte organisme. Se poate intampla ca la o singura specie sa existe diferente foarte mari in marimea ADNmt (la pepenele verde 330 000 pb; la pepenele galben 2 500 000 pb).

Spre deosebire de animale, drojdii si fungii, ADNmt de la plante contin gene care codifica ARNr 5S, care este prezent numai in ribozomii mitocondriilor plantelor si a subunitatii alfa a ATP-azei F1. ARNr de la plante este mult mai mare decat cel de la alte eucariote. Secventializarea recenta a uneia dintre cele mai mici molecule de ADNmt de la plante au evidentiat ca marimea este datorata existentei regiunilor necodante si a secventelor duplicate.

Diferentele de marime si de capacitate codanta a ADNmt de la diferite organisme reflecteaza miscarea ADN intre mitocondrie si nucleu in timpul evolutiei. Dovezi directe ale acestei miscari vin de la obvervatia ca multe proteine codificate de ADNmt de la diferite specii sunt codificate de ADN nuclear la altele. Se pare ca este vorba de o deplasare a genelor de la mitocondrie la nucleu si invers, in timpul evolutiei.

Cel mai elocvednt exemplu este cel al genei cox II, care codifica subunitatea 2 a citocrom c oxidazei. Aceasta gena se gaseste in ADNmt de la toate organismele studiate cu exceptia unei specii de legume numita Bob (mung bean) unde gena cox II este nucleara.

Multe molecule de ARN transcripti de la plante sunt procesate (editate) prin actiunea unei enzime care catalizeaza transformarea unor resturi selectionate C in U si ocazional a U in C. Gena nucleara cox II de la mung bean corespunde mai bine transcriptilor procesati decat genei mitocondriale cox II prezenta in alte legume. Aceste date sunt dovezi clare ale deplasarii genei cox II din mitocondrie in nucleu printr-un proces care implica participarea unei molecule de ARN. Probabil, un mecanism de revertranscriptie similar celui prin care pseudogenele procesate sunt generate in genomul nuclear prin intermediul ARNm codificat nuclear.

Codul genetic mitocondrial difera de codul genetic standard

Toti transcriptii ARN mitocondriali si produsii lor de translatie raman in mitocondrie. Unele proteine ribozomale (una sau doua) depinzand de specie sunt importate din citosol.

Reflectand vechimea bacteriana a mitocondriilor, ribozomii mitocondriali se aseamana cu cei de la bacterii si difera de ribozomii citoplasmatici prin moleculele de ARN si prin compozitia in proteine. De exemplu cloramfenicolul blocheaza sinteza proteica la bacterii dar si in mitocondrii dar nu si ribozomii citoplasmatici. Cicloheximida inhiba sinteza proteica a ribozomilor citoplasmatici dar nu o afecteaza pe cea de la bacterii sau din mitocondrii. In culturile de celule de mamifere numai proteinele sintetizate in prezenta cicloheximidei sunt codificate de ADNmt si produse de ribozomii mitocondriali.

Codul genetic folosit in mitocondriile animale si ale fungilor este diferit de codul standard folosit de toate genele procariote si eucariote; de remarcat ca acest cod difera chiar si pentru mitocondrii de la specii diferite. Cum a aparut acest fenomen in cursul evolutiei este misterios. De exemplu, UGA, este in mod normal un codon STOP, dar este citit ca triptofan in mitocondriile umane si de fungi; totusi in mitocondriile plantelor UGA este inca un codon STOP. AGA si AGG, codonii nucleari standard pentru arginina codifica de asemenea pentru arginina in mitocondriile fungilor si plantelor, dar reprezinta codoni STOP pentru ADNmt de la mamifere si pentru serina la ADNmt de la Drosophila.

Mitocondriile plantelor par sa utilizeze codul genetic standard. Totusi, comparatiile secventelor in aminoacizi ale proteinelor mitocondriale de la plante cu secventa nucleotidica a ADNmt sugereaza ca CGG poate codifica fie pentru arginina (aminoacidul standard) sau triptofan. Aceasta nespecificitate aparenta a codului mitocondrial este explicata prin editarea transcriptilor ARN mitocondriali, care pot transforma resturile de citozina in uracil. Daca o secventa CGG este editata in UGG, codonul specifica triptofanul, aminoacidul standard pentru UGG, in timp ce codonii CGG ne-editati codifica pentru arginina. Astfel sistemul de translatie in mitocondriile plantelor utilizeaza codul genetic standard.

Mutatiile in ADNmt determina diferite boli genetice

Severitatea bolii cauzate de o mutatie in ADNmt depinde de natura mutatiei si de proportia de mutanti si de tip salbatec prezente intr-un tip particular de celula. In general, cand se detecteaza mutatii in ADNmt, celulele contin amestecuri de ADNmt salbatec si mutant - conditie numita heteroplasmie. De fiecare data cand se divide o celula germinala sau somatica de mamifere, tipul mutant si salbatec vor segrega aleator in celulele fiice, asa cum se intampla la drojdii. Astfel, genotipul ADNmt fluctueaza de la o generatie si de la o diviziune celulara la alta si se poate deplasa fie spre tipul salbatec dominant, fie spre tipul mutant. Daca toate enzimele pentru replicare si crestere, cum sunt ADN si ARN polimerazele, sunt importate din citoplasma, ADNmt mutant nu va prezenta vreun dezavantaj replicativ; mutantii care presupun deletii mari ale ADNmt pot chiar sa prezinte un avantaj selectiv in replicare.

Toate celulele au mitocondrii, dar mutatiile in ADNmt afecteaza numai anumite tesuturi. Cele mai afectate care necesita mult ATP produs prin fosforilare oxidativa, si tesuturile care necesita ca majoritatea sau intreg continutul de ADNmt din celula pentru a sintetiza preteine mitocondriale functionale.De exemplu, neuropatia optica ereditara Leber (degenerarea nervului optic acompaniata de orbire) este cauzata de o mutatie "missense" in ADNmt al genei care codifica subunitatea 4 a NADH-CoQ reductaza.

Unele din deletiile mari ale ADNmt cauzeaza un alt set de maladii care include oftalmopplegia externa cronica progresiva si sindromul Kearns-Sayre care sunt caracterizate prin defecte ale ochiului si in sindrom prin degenerarea sistemului nervos. O a treia conditie care determina fibre musculare "neregulate" (cu mitocondrii asamblate impropriu ) si miscari bruste necontrolate asociate, este datorata unei singure mutatii in bucla TYCG a ARNt pentru lizina. Ca rezultat al acestei mutatii, translatia mai multor proteine mitocondriale este aparent blocata.

Asa cum am discutat anterior structura cloroplastelor este similara in multe privinte cu aceea a mitocondriilor. Ca si acestea, cloroplastele contin mai multe copii de ADN si ribozomi care codifica pentru proteine ale cloroplastelor folosind codul genetic standard. Alte proteine din cloroplaste sunt fabricate in citosol si sunt incorporate in cloroplaste dupa translatie.

ADN din cloroplaste sunt molecule circulare de aproximativ 120 000-160000 pb, in functie de specie. Completa secventializare a a ADN din mai multe cloroplaste de exemplu plaman (121024 pb) si tutun (155844). Genomul cloroplastelor din plaman prezinta doua secvente repetitive inverse fiecare constand in 10058 pb care contin genele ARNr si alte cateva gene duplicate. In ciuda diferentei de marime, intreaga organizare si compozitia genelor de la plaman si de la tutun este foarte similara; Diferenta de marime provine in primul rand repetitiilor inversate in care anumite gene sunt duplicate.

Din aproximativ 120 de gene din cloroplaste, aproape 60 sunt implicate in transcriptia si translatia ARN si include genele care codifica pentru ARNr, ARNt, subunitatile ARN polimerazei si proteinele ribozomale. Aproximativ 20 de gene codifica pentru subunitatile complexelor transportoare de electroni din cloroplast si pentru complexul FoF1 ATP-azic. De asemenea sunt codificate de catre genomul cloroplastelor cele doua subunitati mari ale Ribulozo 1,5 difosfat carboxilaza, care este implicata in fixarea dioxidului de carbon in timpul fotosintezei.

Reflectand originea endosimbiotica a cloroplastelor unele regiuni ale ADN din cloroplaste sunt similare cu cele ale ADN actual de bacterii. De exemplu, ADN din cloroplaste codifica patru subunitati ale ARN polimerazei care sunt omologe cu subunitatile ARN polimerazei de la E. Coli. Un alt segment al ADN din cloroplaste codifica 8 proteine care sunt omologe cu 8 proteine ribozomale de la E. Coli; ordinea acestor gene este similara in cele doua tipuri de ADN. ADN din cloroplastele plamanului poseda cateva gene care nu sunt in ADN din cloroplastele tutunului si invers. Acest lucru indica probabil existenta unui schimb ancestral de gene intre ADN din cloroplaste si din nucleul plantelor studiate.