DIAGNOSTICUL DE LABORATOR PRODUS DE ENTEROBACTERIACEAE:

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR PRODUS DE ENTEROBACTERIACEAE:

SALMONELLA, SHIGELLA, YERSINIA

* COPROCULTURA

* DIAGNOSTICUL DE LABORATOR IN FEBRELE ENTERICE (FEBRA TIFOIDA SI PARATIFOIDA).

Algoritm de laborator. Interpretare.

1. GENUL SALMONELLA

• Definitie: cuprinde bacterii Gram (-), mobile, care fermenteaza glucoza cu producere de gaz, produc lizin- decarboxilaza, produc H2S (cu unele exceptii), folosesc citratul ca unica sursa de carbon (cresc pe mediu Simmons cu citrat).

NU produc: indol, ureaza, fenilalanindeaminaza.

• Implicatii patologice:

La om au fost descrise 3 forme clinice de salmoneloze:

1. Salmoneloze sistemice sau febrele enterice (febra tifoida si paratifoida):

* Salmonella typhi, Salmonella paratyphi A si B

entitati clinice bine definite, distincte de celelalte salmoneloze,

evolutie clinica caracteristica,

urmate de imunitate durabila,

2. Salmoneloze enterice:

* Salmonella spp (implica toate salmonelele),

- reprezinta forma comuna,

fac parte din Sindromul diareic bacterian, cu preponderenta la copilul sub 3 ani,

in conditii de aparare imuna locala si generala deficitara, in cazul unor bacteriemii cu punct de plecare digestiv, pot aparea localizari secundare diverse: meningeale, pulmonare, osoase.

Determina toxiinfectii alimentare (TIA), de tip infectios.

3. Septicemii salmonelozice:

• Salmonella choleraesuis (grup CO)
• sunt complicatii ale formelor enterice,

apar la organisme puternic imunodeprimate: copii, varstnici, boli cronice, maligne,

rata mare de mortalitate: 10- 20%.

PATOGENEZA ENTERITELOR SALMONELOZICE:

Aceste microorganisme au ca efect tipic, acumulari lichidiene cu pierderi electrolitice.

In Sindromul diareic infectios este implicate si endotoxina.

Spre deosebire de celelalte boli diareice care presupun multiplicarea microbiana in intestine, Salmonella determina afectiuni prin numarul mare de microorganisme ingerate. Determina o agresiune directa asupra mucoasei intestinale, cu invadare si trecere in submucoasa. Rezulta un fenomen inflamator, cu retrorezobtie deficitara: exces de Na in lumenul intestinal, motilitate exagerata, diaree.

Exista si tulpini de Salmonella care produc enterotoxina, asemanatoare cu cea holerica. Acest lucru determina blocarea mecanismelor energetice, cu activarea adenilat- ciclazei si inhibarea retrorezorbtiei.

In general, mecanismul in boala diareica este unul inflamator, nu toxic.

5 * Enterocolita, TIA de tip infectios, se manifesta dupa ingestia a aprox 10 salmonele vii (doza infectanta).

Salmonella determina afectiuni enterale numai peste un anumit prag al numarului lor. Mecanismul activator al bolii este reprezentat de aliment.

* Simptomatologie:

debut la 24- 48 ore de la ingerarea alimentului contaminat,

diaree apoasa, cefalee, greata, varsaturi, febra.

PATOGENIA FEBRELOR ENTERICE   

Salmonella typhi, Salmonella paratyphi A, B, C: determina febrele enterice,

Salmonella typhi, produce o forma mai severa de boala: febra tifoida,

Salmonella paratyphi A, B, C: produc febra paratifoida A, B, C.

Exista cel putin 3 cicluri patogenice:

1. Ciclul 1:

bacteriile trec prin mucoasa digestiva, sunt ingerate de macrofage, in care supravietuiesc si se multiplica,

macrofagele cu bacterii ajung la ganglionii limfatici mezenterici,

2. Ciclul 2:

in ganglionii mezenterici are loc prima multiplicare,

dureaza ~ 1 saptamana,

este echivalenta cu perioada de incubatie.

La sfarsitul primei saptamani, are loc prima mare bacteriemie,

Coincide cu perioada de debut clinic tipic:

Agentul etiologic circula in sange, se elimina partial si inconstant pe cale renala,

Are loc insamantarea secundara, pe cale sanguina, in ficat, plaman, maduva osoasa,

Se elimina pe cale biliara,

Are loc a doua insamantare a intestinelor: placi tifice (hipertrofia inflamatorie a placilor Payer),

Cutanat se manifesta prin aparitia petelor lenticulare cutanate,

La sfarsitul celei de a doua saptamani de boala, apare diareea,

Stare generala foarte grava: febra mare, confuzie, delir:

• apogeul clinic al bolii (a doua saptamana de febrilitate si boala),

3. Ciclul 3:

in a treia saptamana bacteriemia se reduce,

eliminarea intestinala este mare,

eliminarea focarelor intestinale si colecistita tifica,

colecistita tifica se poate criniciza, bolnavul devine purtator cronic,

intreruperea starii de portaj se face doar chirurgical.

• Mecanism de actiune: imposibilitatea fagocitelor de a marunti salmonelele. Ele inglobeaza germenul, nu-l poate inactiva pentru a-l oferi macrofagului, care-l preia viu.
• Apare un nodul tific care se constituie oriunde exista macrophage.
• Tot ce se elibereaza din fagocite si macrophage constituie fondul circulant al germenilor, pana la aparitia anticorpilor, cand bacteriemia se reduce.
• Diagnosticul se face diferentiat pe fiecare saptamana de boala:

Saptamana 1:

contacti in stare de incubare,

diagnostic bacteriologic direct;

hemocultura (75% dintre pacienti sunt pozitivi),

medulocultura (poate fi pozitiva si cand hemocultura este negativa),

* urocultura (sanse relativ mici de izolare, sporadic pozitiva)

- diagnostic serologic inutil,

Saptamana 2:

bolnav febril,

diagnostic bacteriologic direct,

* hemocultura (50% p-ozitivitate),

* coprocultura,

* medulocultura,

- diagnostic serologic: adesea neconcludent, dar reprezinta primul ser de referinta pentru urmatorul examen serologic, care se face pe probe duble de ser,

Saptamana 3:

convalescent,

diagnostic bacteriologic direct:

* coprocultura: este intens pozitiva,

* hemocultura ofera rezultate pozitive doar in 25% dintre cazuri,

- diagnostic serologic: semnificativ pe probe perechi de ser,

- Analiza Serica Calitativa/ ASC (+); seroreactia Vi (+),

Saptamana 4,:

fost bolnav, suspect purtator:

diagnostic bacteriologic direct,

* coprocultura poate sa ramana (+), elimina sporadic,

- examen serologic util:

- ASC (-), dar seroreactia Vi (+),

*** Medulocultura se face cand se banuieaste febra tifoida si nu se poate izola germenul,

*** Bilicultura se practica NU la pacient CU FORMA ACUTA DE BOALA (pericol de perforatie intestinala), ci la purtator.

se face prin tubaj duodenal, sub control RX,

*** Urocultura calitativa (indiferent de Nr.UFC/ ml, se identifica si se raporteaza).

!!! In cazul afectiunilor digestive (boala diareica, sindrom diareic infectios):

diagnosticul de laborator este bacteriologic direct,

!!! In cazul afectiunilor sistemice / Febra tifoida, paratifoida:

diagnosticul este bacteriologic direct si indirect, imunologic.

1. DIAGNOSTICUL DE LABORATOR MICROBIOLOGIC IN INFECTIILE CU LOCALIZARE DIGESTIVA.

• DIAGNOSTICUL BACTERIOLOGIC DIRECT

1. RECOLTARE si TRANSPORT:

* Tipuri de prelevate:

Materii fecale, de la debut,

lichid de varsatura,

aliment,

mediu de conservare si transport: Carry Blair

2. EXAMEN MACROSCOPIC (scaune frecvente, moi, apoase, cu mucus, culoare si miros caracteristic)
3. EXAMEN MICROSCOPIC (preparat proaspat, frotiuri AM, Gram)
4. CULTIVARE in vederea IZOLARII (colonii izolate, dispersie corecta)

medii de cultura pentru imbogatire: selenit acid de sodium, mediu Rappaport,

• timp de incubare in etapa de imbogatire: 18- 20 ore,
• raport 1/10 intre volumul de materii fecale si volumul de mediu de imbogatire

(1 ml scaun + 9 ml mediu lichid/selenit),

medii de cultura diferentiale : geloza lactozata (AABTL), CLED (geloza lactozata cu thiosulfat de sodium/ pentru inhibarea migrarii proteusului),

medii de cultura solide selectiv diferentiale:

slab selective: MacConkey,

moderat selective: ADCL, Kektoen, SS,

inalt selective: Wilson Blair (izolare Salmonella typhi)

5 Conditii de incubare: 24- 48 ore, 37C,

6. Identificare;

* caractere microscopice: bacilli Gram (-), nesporulati, necapsulati,

* caractere culturale:

- pe mediul ADCL, Salmonella spp, se dezvolta sub forma de colonii lactozo (-), necolorate sau de culoarea mediului, transparente sau usor opace, rotunde, cu suprafata bombata, lucioasa, tip S, cu sau fara H2S,

- pe mediul Wilson Blair, Salmonella typhi realizeaza colonii negre, rugoase, cu luciu metalic si halou negru, brun, colonii tip R.

Salmonella spp pe mediul XLD/ ADCL

Salmonella typhi pe mediul Wilson Blair

Salmonella typhimurium pe mediul Hektoen

* Caractere biochimice:

Tabel I: Identificare biochimica pe baza proprietatilor exoenzimatice ale

genului Salmonella

Tabel II: Reactii biochimice caracteristice grupului Salmonella

Legenda : - reactie negativa,

+ reactie pozitiva,

(+) reactie tardiv pozitiva,

d diferite reactii

3. TSI- Salmonella enteritidis : G+, gaz+, Lactoza/ zaharoza - , H2S+

* Identificare pe baza caracterelor antigenice :

Schema Kauffmann - White

la Salmonella se disting 3 tipuri de antigene:

a) Ag somatice O delimiteaza grupari antigenice,

b) Ag flagelare H (faza 1 si faza 2),

c) Ag de suprafata Vi.

* Serurile O si H se folosesc pentru aglutinarea pe lama si aglutinarea in tuburi,

* Nu se foloseste cultura de pe mediile selective pentru determinari antigenice; se aglutineaza cultura izolata pe geloza lactozata sau TSI (medii neinhibitorii),

* aglutinarea pe lama:

- ser polivalent I anti- Salmonella (componente monovalente: AO, BO, DO, EO, LO) si ser polivalent II (CO, FO, GO, HO),

- titrul serului aglutinant se prepara conform indicatiilor producatorului, in ser fiziologic fenolat 2,

- se depune pe o lama degresata o picatura de ser aglutinant in care se omogenizeaza o ansa de cultura bacteriana/ suspensia antigenica,

- in 1-2 minute, la temperatura camerei, apare aglutinare cu grunji vizibili,

- suspensia antigenica se poate inactiva cu alcool 90; astfel se indeparteaza riscul contaminarii personalului, se asigura denaturarea antigenelor flagelare si se indeparteaza riscul unor aglutinari incrucisate,

* aglutinarea in tuburi:

- aglutinarea O in tuburi apare tardiv, se face cu seruri monovalente,

* Serotipul se stabileste pa baza Ag H:

tehnica aglutinarii pe lama si in tuburi.

Salmonella typhi:

Ag Vi implicat in patogenie (inhiba fagocitoza),

- faciliteaza tipizarea tulpinilor de Salmonella typhi cu bacteriofag (LIZOTIPIA),

- Ag Vi este suportul de fixare al bacteriofagilor (receptor pentru fag),

- cand este prezent Ag Vi, mascheaza Ag O de suprafata si tulpina este neaglutinabila cu ser anti- O,

- in situatia cand Ag Vi este in cantitate mica, expune si Ag O: atunci poate aglutina si cu ser anti- Vi si cu ser anti-O,

- Structura Antigenului typhi: O9,12, H1d, H2-,Vi

- tulpina izolata de la bolnav; O- neaglutinabil, Vi- aglutinabil,

- tulpina izolata de la purtator: O- aglutinabil, Vi- aglutinabil.

- tulpini cu Ag Vi degradat: nu pot fi incadrate in tipar bacteriofagic (nu permite lizotiparea),

- tulpina de Salmonella typhi poate prezenta 3 circumstante:

a) Ag O(+), Ag Vi (+),

b) Ag O (-), Ag Vi (+):

- se apeleaza obligatoriu si la aglutinarea H,

- daca este pozitiva se efectueaza in continuare tipizarea bacteriofagica (lizotipia),

c) Ag O (+), Ag Vi (-):

- se indadreaza in Salmonella typhi prin Ag Hd, dar nu poate fi tipizata bacteriofagic.

DIAGNOSTIC DE LABORATOR IN FEBRELE ENTERICE;

a) Diagnostic bacteriologic direct:

* Prelevate: in functie de evolutia bolii:

hemoculturi repetate si maduva osoasa in prima si a doua saptamana de boala,

urocultura: din a 2- a saptamana de boala,

coproculturi repetate in a 2-a si a 3-a saptamana de boala,

* La purtatori cronici:

- bila (prin tubal duodenal),

- coprocultura.

b) Diagnostic bacteriologic indirect, imunologic:

1. Reactia Widal inlocuita cu Reactia Serica Calitativa/ ASC,

2. Seroreactia Vi.

1. a. Reactia Widal:

evidentiaza prezenta Ac anti- O si anti- H,

utilizeaza suspensie de Salmonella vie,

3 mari inconveniente:

• nu diferentiaza titrul aglutininelor anti- H de aglutininele anti- O,
• risc mare de contaminare (Ag vii),
• nu poate fi standardizata.

1. b. Reactia ASC:

- reactie calitativa si, in acelasi timp, cantitativa,

evidentiaza separat titrul aglutininelor anti-O si anti- H,

se efectueaza cu antigene separate Ag O si Ag H, standardizate si inactivate.

* TEHNICA:

dilutii ser de bolnav 1/ 10 si 1/ 100, peste care se adauga Ag O,

serie separata de dilutii de ser, la care se adauga Ag H,

la prima citire (2 ore la 52sC si 30 min la temperatura camerei) se apreciaza nivelul de anticorpi anti- H,

dupa 24 ore incubare la 52sC si 30 min la temp camerei, se face citirea finala: se apreciaza anticorpii anti- O,

* INTERPRETARE: reactia ASC pune in evidenta anticorpii in dinamica, in serul bolnavilor cu febra tifoida si paratifoida. Anticorpii incep sa apara din a 2-a saptamana si cresc in timp.

* la persoane nevaccinate, care nu au facut boala :

- titrul Ac anti- O = 1/ 40,

* persoane vaccinate:

- Ac O: 1/80,

- Ac H: 1/ 250,

* bolnavi (variabil, in raport cu saptamana de boala ): peste 3 saptamani de boala:

- Ac O: 1/500,

- Ac H: 1/ 1000.

* In seroreactia Vi apar titruri mari de anticorpi anti- Vi, la purtatorii de Salmonella typhi,

- Titrul de diagnostic: ≥ 1/ 40.

* DIAGNOSTIC DE CERTITUDINE:

- 2 probe de ser la interval de minim 1 saptamana,

Daca titrul a crescut de 2 ori, ASC este semnificativa pentru diagtnostic (chiar daca nu s-a izolat agentul etiologic)

COPROCULTURA IN DIZENTERIA BACILARA

Ca patogen intestinal, Shigella are drept tinta epiteliul intestinal de la nivelul ileonului si colonului. Multiplicarea initiala in interiorul celulei epiteliale este urmata de diseminarea celulara secundara ce nu depaseste lamina proprie.

Shigelele se gasesc in tractul intestinal uman si produc dizenteria bacilara: boala caracterizata prin scaune frecvente, muco- purulente, sanguinolente.

Se cunosc 4 grupe de Shigella:

Shigella dysenteriae,

Shigella flexneri,

Shigella boydii,

Shigella sonnei S, R.

Mecanisme de patogenitate:

Invazivitatea: aspectele de patogenitate induse de Shigella ca si cele de Echerichia coli interoinvaziv (EIEC), se datoreaza capacitatii acestor microorganisme de a invada epiteliul, de a se multiplica intracelular si de a se raspandi de la celula la celula. Controlul genetic al invazivitatii este multifactorial, necesitand participarea ambilor determinanti: plasmidic si cromosomal.

Toxigenitate:

Enterotoxina sau toxina Shiga actioneaza ca citotoxina pe culturi celulare HeLa si Vero. I se atribuie rol neurotoxic care explica fenomenele neurologice din dizenteria determinata de Shigella dysenteriae tip 1.

Toxina are specificitate pentru structuri de suprafata ale celulei, de care leaga ireversibil. Dupa internalizare prin endocitoza, se fixeaza pe ribosomii 60 S, unde inhiba elongarea lanturilor polipeptidice. Se blocheaza astfel sinteza proteica celulara ce are ca efect moartea celulei, respectiv necroza epiteliala.

Prin mecanism similar se produc leziuni asupra endoteliului vascular din sindromul hemolitic- uremic (E. coli enterohemoragic EHEC)

Lipopolizaharidele (LPS): sunt antigene somatice de Shigella si nu par sa aibe rol direct in sindromul diareic.

DIAGNOSTIC BACTERIOLOGIC DIRECT:

Inocularea prelevatelor.

Probele recoltate in conditiile anterior prezentate se insamanteaza obligatoriu pe mediul ADCL, variante ale mediului Leifson sau Hektoen, SS, folosindu-se o placa pentru fiecare proba. In cazul in care exista suspiciunea de infectii cu Shigella disenteriae 1 (Shigella Shigae) este necesara utilizarea unui mediu mai putin inhibant, de ex., MacConkey.

Ca inocul se vor folosi cu predilectie mucozitatile cu sange, iar in lipsa acestora, se va face o suspensie de materii fecale in ser fiziologic tamponat, in proportie de 1/ 5, din care se depun 2 3 picaturi la 1 cm distanta de marginile placii. Dispersia se face cu ansa, pentru obtinerea de colonii izolate.

Inainte de insamantare se controleaza mediile: sa fie proaspat turnate (maxim 48 ore), martorii de sterilitate pentru lotul turnat sa fie corespunzatori, placile fara lichid de condens, cu suprafata neteda, fara semne de uscare accentuata.

La fiecare sarja de mediu nou preparat se va efectua un control de calitate al mediului, prin inocularea unui martor de tulpina de Shigella flexneri si Shigella sonnei S, in bulion si a unei suspensii de materii fecale contaminate cu tulpinile martor.

Incubarea placilor se va face la 37sC, timp de 20 48 ore.

Examinarea culturilor: consta in aprecierea cantitativa si recunosterea coloniilor lactozo- negative, care, dupa aspectul cultural, sunt suspecte de Shigella, avand caracteristicile similare celor din placile martor .

In cazul unor culturi in care se gasesc foarte numeroase colonii lactozo- pozitive si in care cele lactozo- negative sunt mascate, nedetectabile, se recomanda contactul culturii cu vapori de amoniac, timp de 20- 30 secunde. In acest fel, mediul acid se neutralizeaza si coloniile lactozo- negative care par initial virate (in galben sau rosu, dupa indicator), datorita unui numar mare de colonii lactozo- pozitive, isi vor recapata aspectul caracteristic, fiind usor de recunoscut.

Identificare preliminara, pe baza caracterelor exoenzimatice:

Coloniile suspecte se repica in mod obligatoriu, pe urmatoarele medii:

geloza MacConkey sau AABTL cu thiosulfat,

medii politrope: TSI, MIU, MILF, cu banda pentru indol.

Repicarea coloniilor pentru inoculare pe medii politrope, trebuie facuta cu atentie, datorita absentei capacitatii selective a acestor medii; aceeasi colonie va furniza culturile pe placi, in sector, si pe mediile politrope. Mediile insamantate se incubeaza 20 ore, la 37sC.

Pentru asigurarea unui diagnostic prezumptiv rapid, in conditii de spital si in situatia in care pe mediul de inoculare directa, ADCL, s- a dezvoltat o cultura abundenta si aproape monomorfa, suspecta de Shigella, se poate practica si aglutinare directa cu seruri specifice, cu conditia confirmarii definitive, a 2- a zi, si prin teste biochimice.

A doua zi se examineaza culturile dezvoltate pe mediile politrope TSI, MIU, MILF, precum si cultura din sectoarele efectuate pe MacConkey sau AABTL/ CLED. In cazul in care culturile pe mediile politrope prezinta caracteristicile biochimice caracteristice genului Shigella, se retin pentru identificare serologica, prin aglutinare cu seruri anti- Shigella.

1, 2 TSI: Shigella flexneri sonnei: Glucoza (+), Lactoza/ Zaharoza (-), gaz (-), H2S(-).

5. Identificarea serologica

Identificarea prin aglutinare cu seruri anti- Shigella, se efectueaza, de preferinta, cu culturile dezvoltate pe mediul TSI.

In cazul in care se obtin reactii pozitive la aglutinarea pe lama, cu serul polivalent, se trece la o identificare de serotip, folosind in acest scop, serurile antidizenterice adsorbite de tip si de grup, conform tehnicilor mentionate in instructiunile producatorului.

Daca cultura dezvoltata pe mediile politrope prezinta caracterele biochimice de Shigella, dar se comporta negativ la aglutinarea cu seruri anti- Shigella, se procedeaza la reexaminarea aglutinabilitatii dupa termoinactivare (o ora la 100sC), pentru inlaturarea unor eventuale antigene de suprafata, termolabile.

Tabel III: Aspecte culturale ale genului Shigella, pe diferite medii de cultura

selectiv- diferentiale

Tabel IV: Comportarea pe medii politrope a genului Shigella

Figura 3 : Schema de diagnostic bacteriologic pentru diareea acuta cu   

germeni din Genul Shigella