Etapele elaborarii tehnologiilor de biosinteza a enzimelor

Etapele elaborarii tehnologiilor de biosinteza a enzimelor

Elaborarea și industralizarea tehnologiilor de biosinteza se realizeaza parcurgand o serie de faze necesare constand in cercetari la nivel de laborator stație-pilot, stație industriala experimentala, unitate industriala de producție in cadrul acestor faze se deosebesc mai multe trepte de transpunere a biothenologiilor in producție.

Faza de laborator: procesul de baza din tehnologia de biosinteza a enzimelor este proces microbiologic, cercetarile incep prin izolarea din diferite habitate a unui mare numar de microorganisme, cunocute sau propuse pentru a elabora enzimele dorite. Tehnicile de izolare și purificare a culturilor de microorganisme cele mai frecevent utilizate sunt tehnica diluților și tehnica granulelor de sol. Deseori sunt create condiții selective de cultura a microorganismelor pe medii solide sau lichide conținand anumite principii cu ajutorul carora se pot evidenția unele caracteristici fiziologice.

Dupa etapa de izolare și realizare a culturilor pure prin tehnici directe de micromanipulare sau indirect (diluții) se trece la trierea tulpinilor luate in lucru dupa criterii calitative și cantitative conform scopului urmarit. Drept teste calitative pentru izolarea tulpinilor celor mai productive pentru α-amilaza se utilizeaza metoda amiloclastica. Pentru izolarea producatorilor de proteze metoda Frazier. Principiul acestor teste calitative consta in cultivarea microorganismelor in placi Petri pe medii solidificate cu agar-agar conținand substraturile naturale ale enzimelor dorite. Dupa dezvoltarea coloniilor izolate enzimele difuzeaza in gelul de agar-agar atacand substratul inclus in mediu.

Interpretarea rezultatelor se face dupa adaugarea unui reactiv specific substratului (amidon-lugol-cazeina, reactiv TCA, reactiv Frazier), prin apariția unei zone de hidroliza in jurul coloniei. Cu cat aceasta zona este mai extinsa cu atat micoorganismul repectiv este mai bun producator.

Faza de stație pilot

Tehnologia elaborata la nivel de laborator este verificata și optimizata in instalații de biosinteza avand capacitați mai mari. Biosinteza enzimelor se desfașoara in reactoare biologice, in culturi de suprafața sau submerse in funcție de fiziologia producatorului și urmarind economicitatea produsului.

În aceasta faza se aleg modalitațile cele mai potrivite pentru prelucrarea mediului de cultura și obținerea preparatelor enzimatice pentru a se putea continua și studia comportarea microorganismelor precum și stabilirea bilanțurilor de materiale și energetice. În acesta faza se stabilesc prețurile de cost orientative ale produsului. Pe baza rezultatelor obținute in stațiile pilot și in stațile industriale experimentale se elaboreaza tehnologia industriala de producție și proiectul.

Utilaje și biotehnologii pentru obținerea produselor de biosinteza utilizate in industria alimentara

Bioreactoarele reprezinta reactoare chimice elaborate pentru realizarea operaților specifice necesare in vederea dezvoltarii culturilor de microorganisme și sintetizarii de catre acestea a enzimelor. În consecința sunt dotate cu mai multa aparatura de reglare, masura și control care este destinata pentru compoziția și concentrația mediului de cultura, temperatura, pH, presiune, oxigen dizolvat, utilițati consumate.

O caracteristica esențiala a funcționarii bioreactoarelor consta in necesitatea asigurarii unei asepsii riguroase pe tot parcursul funcționarii precum și de aer steril.

Clasificarea bioreactoarelor

Bioreactoarele se clasifica in funcție de modul de lucru, principiul de realizare a biosintezei, starea fizica a mediului de cultura și modul de asigurarea a aerarii.

Dupa modul de funcționare se disting:

bioreactoare continue

bioreactoare discontinue

Primele pot fi de tip deschis sau inchis echipate pentru strat omogen sau eterogen.

Bioreactoarele continue prezinta avantajele reducerii volumuli construcției și a duratei procesului, a utilizarii eficiente a mediului de cultura cu creșterea randamentului de sinteza și a posibilitați automatizarii ușoare a procesului.

De asemenea se evita timpi morți pentru umplerea, golirea, curațirea, sterilizarea și racire.

În multe cazuri aplicarea este greoaie sau imposibila din cauza condiților diferite de regim, solicitate de catre microorganisme in decursul divereselor faze ale procesului de inmulțire, a adaptarii greoaie a culturilor cat și a degradarii rapide a acestora.

Bioreactoarele cu funcționare discontinua difera sub aspectul modului constructiv și al dotarii cu armaturi și echipamente anexe cat și a starii fizice a mediului de cultura. Exista bioreactoare verticale și orizontale, staționare sau rotative. Echipate cu dispozitive pentru sterilizarea mediului de cultura in exterior implica dotarea suplimentara cu coloane de barbotare sau injectoare de abur, menținatoare la cald și racitoare rapide procesul putand fi realizat și cu schimbatoare de caldura cu placi. Acestea prezinta avantajul degrevarii bioreactorului de operațiuni secundare de pregatire a mediului de cultura, marirea productivitații, reducerea oscilaților mari de consum de aburi și evitarea degradarii mediului. Pentru combaterea eficienta a spumarii se construiesc bioreactoare cu spargatoare mecanice cuplate sau nu de agitatori, cu distrugerea spumei in afara recipientului, cu injecție de antispumanți sau marirea presiunii.

Relativ la starea fizica a mediului, bioreactoarele sunt echipate pentru folosirea de medii lichide, semisolide sau solide. Cu privire la principiul de realizare a biosintezei se disting bioreactoare pentru procedee in culturi de suprafata și submerse (respectiv pentru multiplicari in profunzime).

În cazul culturilor de suprafata microorganismele se dezvolta de preferința in medii lichide pe tavi aerate, grosimea stratului de microorganisme este de pana la 2 cm iar grosimea mediului de pana la 20 cm.

Tavile pot fi dispuse pe rastele sau carucioare ce se deplaseaza in tunele ventilate cu aer steril. În astfel de condiții se obține acid citric cu culturi de Aspergillus niger sau cheag microbian iar in situația culturilor solide microorganismele se dezvolta atat pe suprafața cat și in interiorul mediului de cultura. Aceasta este de obicei granulat conținand tarața de grau sau orez. Culturile semisolide se realizeaza in agregate cu tambur și se folosesc medii care nu prezinta tendințe de aglomerare.

Sisteme de biosinteza a enzimelor

Biotransformarile cuprinzand procese de biosinteza sau biodegradare pot avea loc in condiții oxibiotice, sanoxobiotice sau fermentative. În mod impropriu termenul generic de fermentație este folosit in practica și pentru unele procese bazate pe cultivarea microorganismelor in condiții de aerobioza riguroasa (fermentație acetica bazata pe oxidarea etanolului la acid acetic sau faza de fermentație de la fabricarea antibioticelor). Se considera ca termenul de fermentație trebuie limitat la cele reacții producatoare de energie in care substantele organice actioneaza atat ca donor cat și ca acceptor de electroni.

Prin aceasta delimitare fermentațiile sunt deosebite pe de o parte de respirația anaeroba a microorganismelor iar pe de alta parte de respirația aeroba in care ultimul acceptor de electron este reprezentat de oxigenul molecular. Din aceste motive aparatele in care se realizeaza dezvoltarea microorgansimelor se numește reactoare biologice sau bioreactoare.

Procesele biotehnologice se pot clasifica dupa:

felul culturii (suprafața, submers)

tipul de reactor și operare

dupa modul de transformare al componetelor nutritive ale mediului de cultura.

În ceea ce privește conducerea procesului de obținere a enzimelor se deosebesc:

procedeul de biosinteza in culturi de suprafața semisolide și solide;

procedeul de biosinteza in culturi submerse;

În cazul culturilor de suprafața microorganismele se dezvolta pe suprafața unui suport lichid sau solid, iar in cazul culturilor solide, microorganismele se dezvolta atat in suprafata cat și in interiorul mediului de cultura de obicei granulat. Culturile semisolide se realizeaza in tamburi rotativi pe medii semisolide care nu se aglomereaza. Tamburul de forma cilindrica așezat orizontal se rotește in jurul axului lung fiind montat pe role iar in interior este prevazut cu palete care antreneaza mediul in timpul invartirii asigurand o buna aerisire.

Aparatul poate fi sterilizat cu abur și lucreaza sub presiune de aer.

Procedeele de suprafața necesita instalații numeroase, sunt costisitoare ocupa mult spațiu și sunt greu sterilizabile. Din cauza manipularii ușoare acest procedeu se utilizeaza mai mut in regim de laborator.

Procedeele submerse necesita instalații care permit o amestecare perfecta a componentelor solide, lichide și gazoase, ale mediului de biosinteza, o alimentare adecvata cu aer fiind echipate cu aparatura de masura și control.

Aceste procedeu ofera o serie de avantale fața de cultura in suprafața pintre care:

randamente ridicate in produs;

se preteaza automatizarii;

economie de spațiu și forța de munca.

Industrial cultura submersa a microorganismelor se poate organiza prin procese discontinue sau continue, acestea din urma conducand la utilizarea de aparate mai mici in care se pot obține parametri optimi de biosinteza cu investiți mai mici si economie de timp.

Bioreactoare pentru procedeul culturilor de suprafața

Pentru astfel de culturi se preteaza in special urmatoarele tipuri de bioreactoare:

Biodin: este conceput pentru sinteza α-amilazei deși de inalțime mica acesta este echipat cu sisteme eficiente de aerare, termostatare și sterilizare.

Drews: destinat pentru producerea de amiloza fungica, cheag microbian, celulaza. Este echipat cu dispozitive suplimentare de climatizare și transport și permit realizarea unor grosimi mai mari pentru mediul de cultura.

Microgerm de tip universal: de capacitate mica a fost elaborat de ICA și poate fi utilizat pentru biosinteza tuturor preparatelor enzimatice destinate produselor alimentare (industria alimentara).

Procedeul Biodin reprezinta o veche realizare inca din 1916, Biodin a realizat biosinteza α-amilazei in culturi de suprafața pe medii lichide intr-o instalație construita in Franța. Mediul natural dupa sterilizare și inoculare cu o cultura pura de Bacillus subtillis , era introdus in tavile instalației formata dintr-un tanc cilindric așezat vertical. Instalația este prevazuta cu sisteme de aerare, termostatare, sterilizare.

Procedeul cu camere de biosinteza este utilizat și la fabricarea acidului citric pe mediul din melasa.

Procedeul Drews utilizeaza medii de cultura solide ca tatațe de grau sau orez umectate in raport 1:1 cu apa potabila. Mediul se sterilizeaza cu vapori direcți iar dupa racire se inoculeaza cu o suspensie de spori și este repartizat in tavi de inox cu fund de sita in straturi groase de 2-3 cm. Tavile conținand materialul insamanțat se introduc in camere climatizate, camerele de incubare se termostateaza șa temperatura dorita introducandu-se in acelaș timp aer umidificat pentru menținerea higroscopicitați necesare. În timpul dezvoltarii microorganismelor ca urmare a proceselor intense exoterme mediul de cultura are tendința de a se supraincalzi ceea ce ar creea pericolul inactivarii enzimelor. Excesul de caldura este indepartat prin insuflare de aer sterilizat in camerele de climatizare. Dupa dezvoltarea microorganismelor și biosinteza enzimei mediul de cultura este utilizat ca atare sau este supus extracției și prelucrarii ulterioare pentru obținerea unor preparate enzimatice purificate. Acest procedeu este folosit pentru fabricarea amilazei fungice, cheagului microbian, celulazelor.

Biorecatorul FRINGS

Consta dintr-un turn umplut cu material portant (așchii de lemn, piatra ponce). Pe acest material microoraganismele formeaza o bioderma iar substratul supus biotransformarii este mișcat de sus in jos.

Bioreactoare pentru procedeul culturilor submerse

Din punct de vedere constructiv cele doua tipuri de bioreactoare difera sub aspectul modului de realizare a etanșeitații cat și cel de aerare a mediului.

Pentru produsele alimenatare se folosesc bioreactoarele echipate cu dispozitive destinate procedeelor aerobe astfel incat cele ce urmeaza se vor prezenta numai acest doua tipuri de agregate.

Bioreactoarele cu agitare ce folosesc energia fazei gazoase pentru agitarea mediului, in ceea ce privește modul de introducere a gazului de amestecare a mediului de cultura se disting bioreactoare prin barbotare și prin injecție. Daca injecția are loc cu aer poarta denumirea de aer-lift atfel denumindu-se gas-lift. Amestecarea are loc in flux continuu sau pulsatoriu pentru distribuirea fina a aerului. Bioreactoarele pot fi prevazute cu talere, umpluturi, sub forma de bile sau inele, in funcție de raportul dintre inalțimea parți cilindrice și diametru se deosebesc, bioreactoarele scunde cilindrice normale, de tip coloana sau tubulare.

Bioreactoarele ce utilizeaza energia fazei lichide pentru ametecarea și dispersia gazului in speța a aerului. Acestea sunt prevazute cu agitatoare autoaspirante sau cu pompe de recirculare. Uneori recircularea și distribuirea fina a aerului se efectueaza prin efectuare care sunt niște dispozitive care asigura și omogenizarea buna in condițiile inglobarii unei cantitați mari de oxigen in masa mediului de cultura. În ultimul caz bioreactoarele pot funcționa cu jet scufundat sau inecat. Exista și distribuitoare de aer de tip rotativ in forma de elice de avion cu deschideri pe una din laturi prin care se sufla aer.

Bioreactoarele cu dispozitive mecanice de amestecare de tipul agitatoarelor, sunt prevazute cu palete, elice sau turbina.

Alegerea depinde in mare masura de insușirile reologice ale mediului de cultura. Spre deosebire de bioreactoarele precedente care pot realiza performanțe energetice mai bune acestea permit menajarea microorganisemlor protejandu-le de solictarile mecanice ce apar la ejecție și la dispersia sub vid. Indiferent de tipul constructiv sub agitator se gasește o zona libera in care se introduce distribuitorul de aer. Acest poate fi alcatuit din simple tuburi inelare, perforate sau talere cu clopot. La proiectarea de generații noi de bioreactoare se ține cont de destinația acestor cat și de capacitatea de producție avuta in vedere.

Astfel se observa apariția de bioreactoare universale construite cu piese standardizate, modulate și in consecința la costuri mai reduse, alaturi de agregate unicate, specializate pentru anumite tehnologii la prețuri mult mai mari. În cadrul Institutului de Chimie Alimentara București sau elaborat bioreactoarele din seria Biofor caracterizate prin posibilitatea schimbarii capacitații recipientului, a tipului de agitator și a variaței turației acestuia din urma.

Dupa tipul respirator al microorganismelor utilizate in procesele biotehnologice, reactoarele biologice se impart in:

• bioreactoare pentru procedeul submers anaerob
• bioreactoare pentru procedeul submers aerob.

Bioreactoare pentru procedeul submers anaerob

Se utilizeaza in general tancuri simple gazate cu N₂ sau CO₂ pentru a impiedica patrunderea oxigenului in mediu, prevazute deseori cu dispozitive de amestecare și termostatare. Sunt mai cunoscute reactoarele pentru epurarea biologica a apelor reziduale și obținerea de biogaz. Acestea in general au capacitați mari find construite de obicei din beton.

Tot din categoria bioreactorelor pentru procese submerse anaerobe face parte fermentatorul pentru obținerea etanolului.

Fermentatoarele sunt recipienți rezistenți la presiune cu posibilitați de inchidere etansa. Sunt prevazute cu dispozitive de reglare a presiunii CO₂ care ia naștere in proces.

Bioreactoare pentru procedeul submers aerob

Sunt asemanatoare cu cele pentru procesele anaerobe dar sunt prevazute cu dispozitive de aerare. Dar se construiesc incepand de la volume de 0,5L pana la 200m³ . Sunt sterilizabile iar in timpul procesului de biosinteza se lucreaza cu o ușoara suprapresiune pentru menținerea condiților de asepsie. Amestecare componetelor de reacție solide-lichide-gazoase se realizeaza prin agitare utilizand diferite sisteme de construcție.

1. Bioreactorele cu vibromixer: sunt utilizate pentru cultura submersa a microorganismelor ale caror celule sunt foarte sensibile la amestecarea cu turbina.
2. Bioreactoare cu colona cu bule: este format dintr-o coloana prevazuta la partea inferioara cu o sita prin care se injecteaza aer. Se poate utiliza și unele materiale de umplutura. Aceste bioreactoare se folosesc mai ales atunci cand substratul are o densitate mare sau este foarte vascos.
3. Biorectorul Air-Lift: este format dintr-un cilindru exteriror prevazute la interior cu un alt cilindru cu pereți subțiri, avand rolul de corp de conducere a curentului. Aerul este introdus pe la partea inferioara strabatand spațiul interior al corpului de conducere, antreneaza lichidul care ajuns la partea superioara curge radial prin spațiul inelar exterior.
4. Bioreactor standard: este echipat cu agitatoare turbina cu palete plane. Dupa tipul de construcție al sistemului de amestecare, al alimentarii cu aer și al diferitelor echipamente se deosebesc tipuri speciale de bioreactoare ca: reactoare cu circulație și site de emulsionare, reactoare cu aspirație automata și reactoare cu pompa.
5. Biorectorul cu jet inecat: consta dintr-un recipent cilindric și un sistem de pompare. Acest bioreactor se caracterizeaza printr-un transfer de masa eficient, productivitate ridicata și cheltuieli de investiție și exploatare reduse. Dupa tipul de operare se deosebesc sisteme omogene și heterogene. Primele au o compoziție uniforma celelalte au celule sau substrate. Sistemele heterogene pot fi monofazice sau multifazice. Trebuie facuta diferența intre sistemele inchise și deschise. Sistemele inchise sunt acelea in care celulele microbiene sunt reținute in totalitate in sistem, fie printr-o membrana semipermeabila prin aderența sau prin recirculare continua. Sistemele deschise sunt acelea in care celulele trec continuu in efluent. În toate sistemele inchise componentele nutritive intra in sistem sau il parasesc fara ca celulele sa il paraseasca. Sistemele inchise nu pot atinge o stare staționara, in sistemele deschise celulele parasesc continuu sistemul cu aceiași rata cu care se formeaza celulele noi, putandu-se atinge astfel starea staționara.

Pe baza tipurilor de operare sistemele de cultura continua se subdivid in doua grupe principale deschise și inchise. La randul lor acestea pot fi omogene, heterogene sau mixte, cu un singur stadiu sau mai multe stadii.

Dupa modul de transformare al componetelor nutritive, componetele proceselor de biosinteza se clasifica in:

1. Procese simple in care componetele nutritive (substratul) se transforma in produse de reacție fara acumulare de intermediari in mediu (ex: dezvoltarea drojdilor prin metabolizarea hidraților de carbon simpli)
2. Procese simultane: componentele nutritive (substratul) se transforma in diferite proporții in produse de reacție fara acumularea de intermediari in mediu. Vitezele relative de acumulare ale produșilor de reacție depind de concentrația componetelor nutritive.
3. Procese consecutive: componetele nutritive (substratul) se transforma in intermediari inainte de transformarea in produși de reacție (ex: oxidarea glucozei la acid cetogluconic, cu Acetobacter suboxydans, glucoza se transforma in totalitate in acid gluconic, care se oxideaza ulterior. Componentele nutritive se transforma in produși de reacție intr-o secvența determinanta (ex: mediul de biosinteza conține hexoze și pentoze). E. coli utilizeaza hexozele in totalitate și ulterior pentozele. Majoritatea proceselor de biosinteza sunt insa mult mai complicate printre altele și datorita complexitați medilor utilizate.

O clasificare mai generala este cea elaborata in nume propriu de Gaden:

1. procese de biosinteza in care formarea produselor depinde direct de utilizarea substratului (ex: biosinteza alcoolului etilic)
2. procese de biosinteza in care formarea produselor depinde indirect de utilizarea substratului (ex: biosinteza acidului citric)
3. procesele de biosinteza in care formarea produselor este aparent independeta de utilizarea substratului ( ex: biosinteza penicilinei).

Implicațile ingineriei genetice in biotehnologiile de obținere a preparatelor enzimatice microbiene

Ingineria genetica a patruns in biotehnologie soluționand problemele dificile legate de producerea de antibiotice, acizi organici, aminoacizi, carburanți, produse chimico-farmaceutice și alimentare.

Extinderea biotehnologiei in industrie a fost favorizata de costurile reduse ale majoritații materie prime provenite din produse secundare de origine vegetala cu utilizari minore (tarate, paie, șroturi). La acesta se adauga capacitatea culturilor de microorganisme de multiplicare in ritm rapid și cu o eficiența ridicata de biocataliza a enzimelor. În consecința preparatele enzimatice microbiene se produc la costuri mult mai mici decat cele de proveniența vegetala sau animala.

Procedee de ameliorare a bioproducatorilor microbieni

Bioproducatori microbieni pot fi ameliorați prin mutageneza, heterocarioza, transformari genetice, fuziuni de protoplaști.

Mutageneza consta din izolarea de microorganisme cu insușiri dorite și multiplicarea lor in vederea obținerii de bioproducatori ameliorați. Acesta se efectueaza fie prin selecția de mutante avantajoase care apar spontan intr-o populație microbiana sau prin suprimarea mecanismelor de reglare inducand mutații cu ajutorul unor tratamente fizice sau chimice.

Heterocarioza: reprezinta un fenomen parasexual de ameliorare a unor bioproducatori microbieni (miceliul unor fungi filamentoși putand conține doua tipuri de nuclee care nu fuzioneaza, fiecare provenind de la un parinte.

Pe acesta cale s-a obținut Penicillium chrysogenum care produce canțitati mari de penicilina. Transformarile genetice consta in transferul unei cantitați limitate de ADN liber extras prin metode adecvate dintr-o celula donatoare și transmis intr-o alta celula receptoare. Pe acesta cale s-a reușit creșterea producției de α-amilaza prin sinteza extracelulara la culturi de Bacillus subtilis cu transfer de gene.

Prin fuziuni de protoplaști sau utilizand celule intacte apare posibila transferarea de gene (metode aplicate pentru drojdii și fungi filamentoși). Astfel prin acesta fuziune la drojdii s-a reușit asimilarea de dextrine de catre acestea.

În acest scop sau extras și s-au purificat ADN-ul din Saccharomyces diastaticus care a fost inoculat cu receptori de Saccharomyces uvarum și Saccharomyces cerevisiae.

Cinetica procesului de biosinteza

Procesul de creștere este rezultatul sintezei specifice echilibrate pornind de la substanțele nutritive din mediu a unor compuși noi care apoi sunt asamblați pentru a forma copii fidele ale constituenților celulari. Specificitatea lui este determinata de intervenția unor mecanisme de control genetic. Pe de alta parte procesul de creștere depinde in evoluția sa de natura și concentrația substanțelor nutritive din mediu și de aprovizionarea continua a celulei cu energie necesara reacților endotermice de sinteza.

Creșterea bacterilor se realizeaza prin depunerea uni sau tridimensionala de substanța noua ceea ce determina marirea celulei bacteriene in sensul uneia dintre dimensiunile ei sau in sensul tutror celor 3 dimensiuni. Marirea volumului celular se face la bacterii numai prin sinteza de substanța organica ci și prin sporirea consecutiva accentuata a conținutului de apa.

Astfel la Proteus vulgaris unei creșteri in volum de 5 ori ii corespunde o creștere in substanța uscata de numai 2 ori. Creșterea microorganismelor nu are loc indefinit ci se intrerupe la un moment dat cand se produce diviziunea celulara.

Diferite ipoteze au incercat sa explice incentarea creșterii prin existența unor factori intrinseci sau controlați genetic prin aceea ca ar fi determinata de epuizarea substanțelor nutritive din mediu și acumularea in el a unor catabaloiți toxici. Ipoteza infirmata de observația ca in aceiași cultura coexista celule de varste diferite (tinere, adulte, pe cale de diviziune, batrane). Se admite astazi ca activitatea normala a microorganismelor este condiționata de existența unui anumit raport intre volumul celulei care consuma și suprafața ei prin care se face absorbția nutritiva și eliminarea catabolițiilor.

În cursul creșterii celulei raportul suprafața volum se modifica datorita faptului ca in timp ce suprafața crește cu o rație patratica volumul se marește cu rație cubica, ceea ce determina o diminuare realtiva a suprafeței celulare. Aportul de material nutritiv din mediu devine astfel din ce in ce mai puțin adecvat exigențelor metabolice.

În cadrul proceselor biotehnologice studiul creșterii și multiplicarii microorganismelor producatoare are o importanța practica deosebita pentru reușita și eficiența tehnologilor industriale. Spre deosebire de organismele pluricelulare, la care se modificarea celulelor duce la marirea taliei individului. La toate celelalte organisme unicelulare, ea are ca rezultat creșterea numarului de indivizi.

Multiplicarea celulelor bacteriene (procariote) se realizeaza de 2 cai: dintre care una dintre ele este diviziunea simpla directa sau binara. Este practic generala. Iar cealalta inmugurirea sau ramificarea este excepționala fiind caracteristica numai unui numar relativ, foarte mic de specii bacteriene.

Multiplicarea prin diviziune simpla tipica specilor bacteriene atunci cand celulele se afla in condiții optime de viața consta in scindarea unei celule in 2 indivizi care pot fi egali (diviziune izomorfa) sau inegali (diviziune heteromorfa).

Viteza de multiplicare a bacteriilor este excepțional de mare. Durata unei generații intervalul de timp dintre doua diviziuni succesive este tipica pentru fiecare specie dar poate varia la aceiași specie in funcție de condițiile de mediu fiind in general curpinsa in limite a 20-30 min.

Actomicetele acestea sunt bacterii gram pozitive se multiplica prin diviziune simpla, formeaza 4 tipuri de spori: odiospori; conidi; sporangispori; clamidospori.

Levurile (drojdii): se prezinta in mod obișnuit in forma unicelulara și au o organizare interna de tip eucariot. Se inmulțesc prin inmugurire și ocazional prin diviziune simpla.

Mucegaiurile (fungi filamentoși): se reproduc prin spori asexuați (zoospori, sporangiospori, conidiospori, clamidospori, odiospori) și spori sexuați (ascospori, bazidiospori, zigospori).

Dinamica multiplicarii populaților bacteriene

În condiții experimentale dinamica multiplicarii populaților bacteriene este bine cunoscuta. Procesul evolueaza intr-o serie de faze sucesive.

Faza de latența sau lag este cuprinsa intre momentul introducerii germenului in mediul de cultura și momentul introducerii celulelor, moment in care acestea incep sa se multiplice. În cursul acestei faze numarul bacteriilor ramane neschimbat, cultura nefiind vizibila macroscopic.

Aceasta faza dureaza in medie cateva ore și se observa in modul cel mai evident,atunci cand bacteriile insamațate provin din culturi, populația fiind alcatuita in principal din forme de rezistența iar celulele sunt deficiene in enzime sau produși intermediari de metabolism.

Multiplicarea unor asemenea bacterii nu devine rapida, decat in momentul in care aceste substanțe s-au acumulat prin sinteza in concentrații optime. Daca inoculul bacterian este prelevat dintr-o cultura aflata in curs de multiplicare in aceliași condiții de mediu ca și cele oferite noi culturi inițiale, multiplicare bacteriilor iși menține in continuare ritmul rapid.

Daca bacteriile provin dintr-o cultura tot in faza exponențiala dar care creșteau pe un alt mediu de cultura decat in cel care au fost transferate prin insamanțare, creșterea lor pe noul mediu nu este evidenta decat dupa o perioada de latența necesara inducției unor enzime, corespunzatoare noului substrat nutritiv.

Faza de latența apare deci ca o perioada de adaptare la condiții noi de cultura, in care bacteriile viabile iși acumuleaza in celula metaboliți esențiali și sistemele enzimatice necesare creșterii, in cazul in care aceste componente biochimice le lipseau și datorita condițiilor de viața anterioara insamanțarii.

Faza de multiplicare exponențiala sau de creștere logaritmica. Este caracterizata prin aceea ca dupa o scurta perioada (cca 2h) de accelerare a ritmului de creștere in care multiplicarea se produce cu o viteza progresiva marita, acest ritm devine constant și caracteristic pentru un organism dat in anumite condiții de cultura durata unei generații fiind minima.

În aceasta faza celulele considerate a fi de tip embrionar, au dimensiuni mai mari decat cele caracteristice speciei iar citoplasma lor nu conține material de rezerva și are o afinitate pentru coloranți bazici, datorita conținutului ei in ARN.

Diviziunile sunt destul de bine sincronizate și numarul celulelor viabile se dubleaza brusc și la intervale regulate. Dupa un timp relativ scurt tendința de multiplicare rapida scade progresiv datorita epuizarii substanțelor nutritive din mediu și acumularii in el a produselor de catabolism de concentrații cu efect inhibitor. Pe de alta parte creșterea indivizilor din populația bacteriana nu se fac sincron datorita faptului ca in aceste condiții de incetinire a ritmului de creștere se manifesta unele mici diferențe individuale in ceea ce privește timpul de diviziune celulara. Acest fenomen de incetinire și de sincronizare a creșterii populației bacteriene se produce chiar daca cultura are ca punct de plecare o singura celula, incat dupa cateva generații celulele se afla in stadii diferite ale ciclului lor de dezvoltare.

Faza staționara maxima este faza in care numarul celulelor viabile este maxim și ramane constant, o perioada de timp care dureaza de la cateva ore la cateva zile in funcție de sensibilitatea bacteriilor la condiții favorabile de mediu. Daca intrarea culturilor in faza staționara este determinata de epuizarea substanțelor nutritive in mediu celulele nu se mai multiplica iar numarul total al indivizilor populației este constant și egal cu numarul celulelor viabile. Atunci cand este vorba de o lipsa parțiala de substanțe nutritive sau acumularea unor produși toxici multiplicarea persista in mod incetinit dar este contrabalansata de o mortalitate cu ritm echivalent. În aceasta faza celulele sunt considerate mature avand drept caracteristica pentru fiecare specie dimensiuni mai mici decat in faza de creștere exponențiala, citoplasma mai puțin omogena datorita apariției de incluziunii și acumularii de substanțe de rezerva, afinitate moderata, anormala pentru coloranți și prezența sporilor la speciile sporogene.

Faza de declin corespunde unei scaderi progresive a numarului de celule viabile, mergand pana la sterilizare bacteriologica a culturii. La un moment dat numarul bacteriilor viabile scade in progresie geometrica, in raport cu timpul datorita morții unui numar foarte mare de celule. Uneori celulele viabile pot persista cateva luni multiplicandu-se pe seama substanțelor nutritive, eliberate prin liza celulelor moarte. Celulele din aceasta faza, celulele batrane au prezența formelor de involuție (celule mici, sferice, deformate, gigante sau ramificate) se coloreaza foarte slab uneori doar ca umbre sau capata chiar afinitate pentru coloranți acizi, iar la speciile sporogene apar in cultura foarte mulți spori. În unele cazuri apar fenomene de autoliza ceea ce determina scaderea numarului total din mediu. Creșterea unei populații bacteriene se poate aprecia direct prin mai multe metode ca:

determinarea substanței uscate, a masei celulare

dozarea intr-o cultura a unui dintre constituenți bacterieni elementari, carbon sau azot

aprecierea cantitativa a unei enzime sau a unui produs metabolic și evaluarea numarului total de celule bacteriene cu ajutorul celulei microscopice de numarat.

Ca metode indirecte se folosește:

aprecierea gradului de turbiditate a suspensiei bacteriene intr-un mediu lichid in raport cu o scara etalon sau la fotocolimetru.

determinarea absorbției razelor UV.

Spre deosebire de bacteriile pr-zise actinomicetele cresc sub forma de colonii și in mediile lichide deoarece la aceste microorganisme singurele celule individuale sunt conidile.