MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS (My T)

MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS (My T)

Se banuieste ca stramosii My T provin dintr-o bacterie ce se dezvolta pe sol si in pamant, din care s-a dezvoltat My. Bovis, specific animalelor ierbivore. My T-tipul uman a derivat din My Bovis, dupa domesticirea bovinelor de catre omul primitiv, aceasta filiatie explicand asemanarile intre diversele tipuri clasificate in complexul My T. Asemanarile intre aceste tipuri se datoreaza lipsei unei diversitati genetice, majoritatea proteinelor sintetizate fiind identice; aceasta nu inseamna ca genomul mycobacterian este inert, ci doar ca este un organism tanar, care nu a avut timpul necesar sa beneficieze de prea multe mutatii.

1. Clasificare

-ordinul: Actinomicetales

(nu formeaza spori)

-familia: Mycobacteriaceae

(mycos= ciuperca, mucegai; bacterion=bastonas)

-genul: Mycobacterium

(au peretele format din acizi grasi cu lant lung de atomi de

carbon, saturati sau monosaturati)

-specii: peste 70 specii identificate taxonomic, din care 30 specii

au fost izolate la om).

Clasificarea speciilor de Mycobacterii

-Complexul Mycobacterium tuberculosis (MyT)

MyT-hominis (R. Koch, 1881)

My-bovis (BCG),(R.Smith,1990)

My-africanum (cu patogenitate mai redusa)

My-microti (agentul patogen al unei boli similare tuberculozei la pasari, nepatogen pt om)

-My leprae (Hansen)-(lepra)

-My atipice (non-tuberculoase)

Clasificarea My atipice (Runyon,1954):

-gr. I: fotocromogene

Formeza colonii de tip S, de culoare crem la intuneric, expuse la lumina produc un pigment galben sau portocaliu,

Ex: My Kansassi, My marinum;

-gr. II: scotocromogene

Formeaza colonii de tip S, care produc la intuneric si la lumina un pigment galben-portocaliu,

Ex: My Scrofulaceum,My gordonae;

-gr. III: non-cromogene

Formeaza colonii de tip S, de culoare gri-crem, nu produc pigment nici la lumina, nici la intuneric;

Ex: My. intracelularae, My. Avium;

-gr. IV: cu crestere rapida

Formeaza colonii de tip S sau R, nepigmentate, cu crestere in culturi la 1-3 zile, la 25C,

Ex: My fortuitum

2. Structura

2.1. Peretele celular

Peretele celular la bacteriile Gram pozitive (inclusiv MyT) este gros (15-80nm) si este format din mai multe straturi de molecule de proteoglican (PG); la bacteriile Gram negative, peretele este mult mai subtire (sub 10nm) si este format dintr-un singur strat de PG, dar poseda in plus o membrana externa formata din lipopolizaharide (LPZ) care-i confera un plus de protectie si agresivitate, denumita endotoxina.

In structura peretelui celular, elementul principal este mureina, un PG care se gaseste in natura doar la MyT. La bacteriile Gram pozitive peretele celular, mai gros, este format din mai multe straturi de mureina, respectiv, este o singura molecula de PG, continua, lunga, care inconjoara de mai multe ori celula.

Mureina este un PG format din polimeri de dizaharide, legati de tetrapeptide:

-componenta glican, reprezentata de acidul muramic, un polimer format din alternanta a 2 molecule de dizaharide:

N-acetil-glucozamina (NAG) atasat de

Acidul N-acetil-muramic (NAM);

-componenta peptidica este reprezentata de tetrapeptide (lanturi scurte de aminoacizi)

acestea realizeaza legaturi incrucisate intre cele 2 molecule de glican;

intregul ansamblu este fixat de membrana celulara prin moleculele de acid teicoic, dispuse perpendicular pe membrana;

acidul teicoic este un polimer linear de poliglicerol, in care sunt incluse zaharuri si aminoacizi (tipul de aminoacizi variaza in functie de specie);

-componenta lipidica este foarte bogata (60%), cele mai importante elemente fiind:

acizii grasi cu lant lung de atomi de carbon, care sunt saturati sau mononesaturati (niciodata polinesaturati ca la celulele eukariote), cel mai reprezentativ fiind acidul micolic

care se intalneste la Mycobacterii (cu continut de 80 atomi de carbon) si la Corynebacterium (cu 36 atomi de carbon)

- este o molecula puternic hidrofoba, formand o pelicula de suprafata, influientand permeabilitatea celulei, fiind si un determinanat al virulentei

- apara My de atacul proteinelor cationice, lizozimului, ROI si al depunerilor de complement;

sulfolipidele sunt acizi grasi legati de o molecula de trehaloza sulfonata;

- sunt intercalate in structura peretelui celular si au rol in virulenta;

dimetil-trehaloza, un glicolipid denumit "cord factor", prezent in tulpinile virulente si responsabil de dispunerea bacililor sub forma de "serpentine" sau "mustati" pe mediile de cultura solide;

- este toxic pentru celulele mamiferelor si inhiba migrarea leucocitelor polinucleare (determinant al virulentei);

micozidele sunt peptido-glico-lipide dispuse la suprafata celulei

ceara ∆- reprezinta lipide conjugate cu PG, acest ansamblu reprezentand " caramizile "peretelui celular;

mai exista o serie de lipoproteine, lipopolizaharide, fosfolipide, etc, cu structura mai putin cunoscuta si functii mai putin precizate (ex. lipoarabinomannan, arabinogalactan);

Putine celule produc o astfel de diversitate de molecule lipidice, de la acizi grati simpli (palmitat, tuberculostearat), la cei cu lanturi foarte lungi (acid micolic). La My exista peste 250 enzime distincte implicate in metabolismul acizilor grasi, spre deosebire de E.coli, care are 50 enzime.In biosinteza acestor acizi grasi sunt implicate 2 sisteme enzimatice si anume FAS І si FAS II (fatty acid synthasa I si II): unele genereaza esteri scurti, precursori, derivati din acetil-CoA, altii contribuie la elongarea acizilor grasi scurti.

Biosinteza PG este un proces complex ce se desfatoara in 3 etape:

-prima etapa are loc in interiorul citoplasmei (la nivelul suprafetei interne a memebranei celulare) si consta in ansamblarea unitatilor de dizaharide si pentapeptide sub forma de monomeri; acest proces are loc cu ajutorul unei enzime (transglicozilaza, transpeptidaza, carboxipeptidaza);

-a 2-a etapa consta in transferul acestor unitati monomerice prin membrana plasmatica la suprafata celulei;

-a 3-a etapa realizeaza asamblarea unitatilor monomerice, prin polimerizare la suprafata externa a celulei, obtinandu-se molecule mari de PG, care sunt legate de PG preexistente, regenerand, astfel, permanent peretele celular; in functie de componentele induse exista 8 tipuri de PG.

Penicilinele (moleculele -lactam) opresc sinteza peretelui celular prin blocarea unor enzime (transpeptidaza, carboxi-peptidaza), oprind astfel asamblarea mureinei, motiv pentru care majoritatea bacteriilor Gram pozitive sunt sensibile la Peniciline. Bacteriile Gram negative sunt mai rezistente la Peniciline datorita unei membrane externe formata din LPZ.

Functiile peretelui celular sunt:

-protejeaza celula de diverse forte externe mentinandu-i forma,

-impiedica liza osmotica a celulei,

-este o bariera de permeabilitate selectiva, inclusiv pentru substantele nutritive, ceea ce explica partial cresterea lor foarte lenta;

-bogatia in lipide confera rezistenta la substantele hidrosolubile, proteolitice, acizi, baze, acetona, coloranti;

-asigura protectie fata de celulele fagotice si enzimele lor lizozomiale, ceea ce explica si patogenitatea lor intracelulara;

-detine situsuri de aderenta intercelulare si receptori pentru temperatura, osmolaritate, RO1, etc;

-asigura rezistenta fata de majoritatea AB, pastrand sensibilitate doar pt un numar redus de chimioterapice.

2.2.Membrana celulara

Membrana celulara a MyT este o structura foarte dinamica, cu o grosime de aproximativ 80, fiind formata din fosfolipide (40%) si proteine (60%) si nu contine steroli:

-fosfolipidele sunt formate din molecule de glicerol atasate de acizi grasi saturati sau mononesaturati, intregul ansamblu formand un mediu apos cu dublu strat bipolar;

-proteinele sunt dispuse intre cele 2 straturi de fosfolipide, avand functii structurale sau enzimatice:

unele traverseaza membrana ca niste canale de comunicare intre exteriorul si interiorul celulei,

altele sunt concentrate la suprafata externa a celulei, cu functie de receptori

-de tip "sensing proteins", care deceleaza concentratia diverselor molecule din mediul extern,

-sau de tip "binding proteins", care transmit diverse semnale din exterior spre diverse sisteme intracitoplasmatice (mesageri secunzi).

Functia principala este de bariera cu permeabilitate selectiva, regland trecerea substantelor in si dinspre celula. Ea permite trecerea apei si a moleculelor mici (sub 100 Da) si fara incarcatura electrica; nu permite trecerea pasiva a moleculelor mai mari si cu incarcatura electrica. Membrana are mecanisme speciale:

-pentru "procese"de transport si

- pentru "sisteme" de transport.

Procesele de transport necesita proteine ce mediaza trecerea solutiilor transmembranar si se numesc proteine "carier" sau "caraus" sau permeaze. Transportorul este o proteina (sau un grup de proteine) cu rol de pasaj (trecatoare) pentru moleculele mici dintr-o parte in alta a membranei. Procesele de transport opereaza dupa 3 modele, cu specificitate:

- "uniport process" in care solutia trece prin membrana unidirectional,

-"symport process" (sau cotransport) in care doua solutii sunt transportate simultan in acelati sens ti in acelasi timp,

- "antiport process" in care doua solutii sunt transportate simultan in doua sensuri diferite.

Sistemele de transport pot fi utilizate alternativ, in functie de situatie si necesitati. Mecanismul nu tine cont de gradientul de concentratie al substantelor

din celula si din mediul extern. Scopul acestui mecanism este acumularea unei substante (necesara la un moment dat) in concentratie mai mare in celula decat in mediul extern, aceasta necesitand, insa, un sistem de transport cu consum de energie.

Prokariotele nu au organite celulare specifice pentru o serie de procese metabolice, aceste procese desfasurandu-se la nivelul partii interne a dublei membrane celulare, unde exista o activitate enzimatica intensa. De exemplu, sistemul de transport de electroni, care este cuplat cu respiratia aeroba si sinteza de ATP se desfasoara in membrana celulara. De asemenea, membrana este locul unde se realizeaza fosforilarile, proces analog functiei mitocondriilor la eukariote. Membrana mai contine enzime necesare si altor procese metabolice, cum ar fi sinteza peretelui celular, formarea septului de diviziune, replicarea ADN, diverse biosinteze, etc.

Membrana plasmatica se poate invagina in citoplasma, formand vezicule, initial atasate de membrana, apoi libere in citoplasma, denumite mezozomi. Aceste pseudoorganite celulare sunt analoage mitocondriilor, ele crescand suprafata de contact pentru activitatea enzimatica. Continutul enzimatic al mezomilor poate fi dependent de regiunea membranara din care provin, putand fi specializati in diverse activitati (replicare ADN, sinteza peretelui celular etc.).

2.Citoplasma

Citoplasma bacteriana este saraca in organite celulare, lipsind mitocondriile, reticolul endoplasmic etc. functiile acestor organite fiind preluate de membrana plasmatica (suprafata interna) si de derivatele sale (mezozomi).

Ca organite celulare putem intalni:

-Ribozomi, cu continut bogat in enzime implicate in procesul de translatie si ARN-m (responsabil de sinteza de proteine),

dimensiunea lor este de 70S, cu subunitatile de 30S si 50S (spre deosebire de eukariote unde dimensiunea este de 80S, cu subunitati de 40S si 60S)

-Mezozomii, proveniti din componenta interna a membranei celulare, se prezinta sub forma unor vezicule cu continut bogat in enzime;

indeplinesc functiile mitocondriilor

-diverse incluziuni citoplasmatice cu continut fie nutritiv, fie cu rezerve energetice.

ACTIVITATEA METABOLICA

Exista un mecanism sofisticat de reglare a cailor catabolice si anabolice. Bacteriile nu produc enzime catabolice pana cand substratul acestor enzime nu este prezent; la fel functioneaza si caile anabolice. Bacteria isi poate modifica spectrul enzimatic in functie de specificul mediului, de prezenta sau absenta substratului.

Exista 3 tipuri principale de enzime:

-enzime constitutive: sunt enzime produse independent de prezenta sau absenta    substratului specific enzimei (sunt reduse ca numar);

-enzime inductibile: sunt produse ca raspuns la prezenta unui substrat particular (sunt produse la nevoie); prezenta substratului (denumit "inducer") genereaza sinteza enzimei specifice;

-enzime represibile: sunt enzime care iti diminua sau opresc propria sinteza in prezenta unor produti finali ai unor procese metabolice la care participa, produsi denumiti "end product" sau "catabolit product".

Exista un mecanism de reglare a reactiilor enzimatice, in sensul ca nu toate reactiile au aceeasi amploare:

-unii compusi sunt necesari in cantitate mare, reactiile implicate fiind de mare amploare,

-alti compusi sunt necesari in cantitati mici, reactiile fiind de mica amploare.

Exista un mecanism de feed-back ce regleaza cele 2 cai metabolice:

-reglarea prin "inducer" (substrat) si prin "end-product" opereaza pe caile de biosinteza,

-reglarea prin "catabolit product" opereaza pe cale degradativa.

De exemplu, caile implicate in sinteza de aminoacizi, aparitia lor (end-product) regleaza prin feed-back ( prin mecanism de inhibitie); in cazul sintezei de 2 aminoacizi, fiecare "end-product" poate controla propria sa biosinteza, fara sa o afecteze pe cealalta. Acest control negativ se face prin reglarea inhibarii sintezei de ARN-m, ceea ce duce la scaderea sintezei enzimei, ceea ce duce la economisirea moleculelor de ATP si de aminoacizi.

2.4.Genomul

MyT nu poseda un nucleu propriu-zis, delimitat de o membrana nucleara; in loc de nucleu exista in centrul celulei o molecula imensa de ADN liber in citoplasma. In structura genomului (a moleculei de ADN) exista 4.411.529 perechi de baze nucleotide, care formeaza aproximativ 4000 de gene (la om exista aproximativ 50.000-100.000 de gene); genele sunt asamblate linear, de-a lungul moleculei de ADN, genele impreuna cu proteinele cromatinei formand cromozomii.

ADN este un polimer linear format din 4 unitati monomerice, denumite nucleotide:

-deoxiadenozin-monofosfat,

-timidin-monofosfat,

-deoxiguanozin-monofosfat,

-deoxicitidin-monofosfat.

Nucleotidele sunt legate intre ele prin legaturi fosfat, formand un lant lung; molecula de ADN are 2 lanturi paralele de polinucleotide dispuse in spirala. Fiecare nucleotid dintr-un lant este legat de nucleotidul corespunzator din celalalt lant prin legaturi de H; aceste legaturi sunt "de tip preferential", rezulaand doar doua tipuri de perechi: adenozina-timidina (A-T) si guanozina-citidina (G-C).

Cele 4 nucleotide sunt dispuse in molecula de ADN sub forma unor "triplete" (grupe de trei nucleotide), fiecare tripleta semnificand un cuvant "cod" (codon), care desemneaza un singur aminoacid; cate o tripleta codon exista pentru fiecare din cei 20 aminoacizi (teoretic pot exista 64 de triplete codon diferite). Informatia genetica din segmentul de ADN-gena este transcris in

ARN-m sub forma unor triplete compuse din baze purinice si pirimidine, complementare si in antisens cu tripletele din ADN. Astfel fiecarre codon tripleta din ADN este "translatat" in codonul tripleta din ARN-m, fiecare tripleta semnificand un anume aminoacid. Succesiunea tripletelor in gena si in ARN-m semnifica un anume tip de proteina. ARN-m specific unei gene din ADN este procesat in "nucleu", de unde este eliberat in citoplasma, unde se fixeaza in ribozomi, de unde sintetizeaza proteine (si enzime) folosind aminoacizi adusi de ARN-t, dupa care proteina paraseste ribozomii.

Reproducerea MyT se realizeaza fara schimburi de material genetic intre celule. Molecula de ADN se ataseaza cu unul din capetele sale de fata interna a membranei celulare (posibil intr-un "anume loc"), in 2 puncte distincte, cate unul pentru fiecare polimer de ADN. Intre cele 2 puncte membrana celulara sintetizeaza initial un sept, care ulterior progreseaza, devenind un sept despartitor a celor 2 polimeri paraleli ai moleculei de ADN. Cand septul este complet, cei 2 polimeri sunt separati, la fel si celula, aparand 2 celule noi. Durata acestui proces, respectiv timpul de generatie, este de 15 minute-24 ore (chiar zile).

Dormanta este un raspuns fiziologic al MyT, determinat genetic, fata de modificarile conditiilor din mediul extern si in special fata de scaderea concentratiei de oxigen (O ); pt o bacterie aeroba, O este un factor important pentru metabolism (si mai ales pentru multiplicarea ei).

Conditii de anaerobioza se reaasesc in leziunile TB (granulomul TB), MyT modificandu-si metabolismul, intrand in faza de quiescenta (latenta, dormanta), pe termen lung (nedefinit), dar ramanand in stare viabila. Mecanismul prin care se modifica tipul de metabolism nu este suficient de cunoscut; se pare ca exista in genom un "factor sigma F" care regleaza specificitatea transcriptionala a unei ARN-polimeraze si care genereaza starea de latenta bacteriana.

In stare de latenta MyT devine rezistenta la actiunea diversilor factori (enzime, factori imunologici, antibiotice), ceea ce ii permite supravietuirea in leziunile TB o perioada lunga de timp (chiar toata viata). Aceasta infectie latenta, asimptomatica, reprezinta un important rezervor epidemiologic al TB. Revenirea conditiilor de aerobioza determina MyT sa-si reia activitatea metabolica oxidativa, inclusiv multiplicarea.

Mutatia este o modificare ocazionala si stabila a secventei de nucleotide primare in molecula de ADN, ce apare ocazional cu o frecventa de 10 generatii. Aceste mutatii vizeaza diverse aspecte metabolice, unele putand fi nesemnificative, altele putand duce la moartea celulei. Aparitia unei mutatii principale poate genera aparitia unor mutatii accesorii, adaptative, compensatorii, care sa permita supravietuirea celulei.

De exemplu,gena Kat G codifica sinteza enzimei catalaza-peroxidaza, care asigura protectia MyT fata de radicalii de O₂ ai macrofagului si neutrofilului. Aparitia unei mutatii la acest nivel altereaza productia de catalaza, facand MyT vulnerabila la ROI; in acelati timp se altereaza si metabolismul INH (nu se mai produc metaboliti activi), aparand astfel rezistenta la INH.