Transcrierea genetica

Transcrierea genetica

Principii si definitii

Transcrierea genetica reprezinta procesul de sinteza, catalizata enzimatic, a moleculelor de ARN, ca urmare a citirii informatiei codificate in molecule ADN. Procesul se desfasoara pe baza legilor de complementaritate chimica dintre cele 2 catene ale unei molecule de acid nucleic dublu catenar si conduce la formarea de legaturi fosfo-diesterice intre ribonucleotide.

Prin transcriere genetica se sintetizeaza toate tipurile de molecule ARN proprii celulelor, atat la organisme procariote, cat si la eucariote, si anume: ARN mesager (ARNm), ARN ribozomal (ARNr), ARN de transfer (ARNt), ARN heterogen nuclear (ARNhn).

Molecula ARN rezultata prin transcriere, inainte de orice alta procesare, poarta numele de transcript primar.

Procesul de transcriere a unei portiuni din ADN (denumita gena) presupune deci sinteza unei copii a informatiei genetice, copie care din punct de vedere chimic este o molecula de acid nucleic monocatenar, si anume ARN.

Transcrierea incepe in anumite zone din molecula ADN, zone numite promotori. Acestia au anumite secvente de nucleotide care ii fac usor de recunoscut de catre ARN polimeraze (enzimele ce sintetizeaza molecule de ARN). In zona promotorilor dublul helix ADN este desfacut de catre ARN polimeraze, formandu-se o asa-numita bucla de transcriere. In interiorul acesteia, ARN polimeraza sintetizeaza o molecula de ARN, copiind informatia genetica de pe una din catenele ADN pe care o foloseste ca matrita.

Primul nucleotid de pe catena ADN matrita care este citit si caruia ii corespunde un prim nucleotid in catena ARN, este numerotat conventional cu +1 si denumit startpoint (punct de pornire a transcrierii). Urmatoarele nucleotide din matrita ADN sunt numerotate +2, +3, +4 etc.

Fata de pozitia nucleotidului +1, se definesc 2 zone in matrita ADN :

- zona amonte (upstream), in care nucleotidele sunt numerotate cu semnul minus (-1, -2, -3 etc)

- zona aval (downstream), in care nucleotidele sunt numeortate cu semnul plus (+2, +3, +4 etc)

Procesul de transcriere pornit de la promotori continua pana in anumite zone din ADN, cu anumite secvente, zone denumite terminatori. In aceste zone, ADN polimeraza se desprinde de pe molecula de ADN, bucla de transcriere formata in dublul helix ADN se inchide, iar transcriptul ARN este eliberat.

O zona din ADN cuprinsa intre un promotor si un terminator poarta numele de unitate de transcriere. Din cele 2 catene ale moleculei de ADN, catena care este folosita ca matrita pentru sinteza unui transcript ARN este complementara cu aceasta si este numita catena antisens. Catena ne-matrita este denumita catena codificatoare sau catena sens.

Admitand ca o gena reprezinta o zona din ADN (sau mai exact, secventa de nucleotide de pe una din catenele ADN dintr-o anumita zona) ce codifica un polipeptid (sau o molecula de ARNr, ARNt ARNhn), o unitate de transcriere poate include :

- o singura gena, caz in care se numeste transcriere monocistronica

- sau mai multe gene, caz in care se numeste transcriere policistronica

Desi exista si destule exceptii, in general, transcrierea monocistronica este caracteristica organismelor eucariote, iar cea policistronica - procariotelor (Figura 4.16)

Figura 4.17 Reprezentarea schematizata a unui proces de transcriere monocistronica si, respectiv, policistronica.

2 Enzime

Procesul de transcriere genetica este catalizat de o clasa speciala de enzime numite ARN polimeraze.

La organismele procariote eixsta cate o singura specie moleculara de ARN polimeraza per celula, aceasta realizand sinteza tuturor tipurilor de ARN din celula.

La eucariote, majoritatea celulelor detin cate 3 specii moleculare de ARN polimeraze, fiecare dintre ele sintetizand anumite specii de ARN.

3 Transcrierea la procariote

3.1 Promotori

Promotorii reprezinta secvente din structura ADN, aflate in amonte fata de ogena, la care se ataseaza in mod situs-specific (in functie de secventa de nucleotide) ARN polimeraza.

Un promotor de la procariote prezinta 4 regiuni importante din punct de vedere functional :

- o secventa hexamerica (adica formata din 6 perechi de baze) in jurul pozitiei -35; este denumit generic hexamerul -35

- o secventa hexamerica in jurul pozitiei -10, denumita generic hexamerul -10

- o regiune spatiatoare intre cei 2 hexameri (ADN spacer)

- o regiune situata intre pozitiile -40 si -60, bogata in A si T, denumita elementul UP (Upstream = amonte)

Cei 2 hexameri si elementul UP au secventa de nucleotide inalt conservata, secventele consensus fiind 5'-TTGACA-3' pentru hexamerul -35 si, respectiv, 5'-TATAAT-3' pentru hexamerul -10 (Figura 4.18).

Cu cat secventele de nucleotide din cei 2 hexameri sunt mai apropiate de cele de mai sus, cu atat taria promotorului respectiv este mai mare, adica cu atat ARN polimeraza se va atasa mai strans si cu atat gena respectiva va fi transcrisa cu o rata mai ridicata.

Cei 2 hexameri din promotori sunt recunoscuti de subunitatea a ARN polimerazei, iar la elementul UP se ataseaza subunitatea -CTD a acestei enzime.

Figura 4.18 Structura promotorilor la procariote.

3.2 Terminatori

Transcrierea genetica continua de la promotori pana la terminatori. Acestia reprezinta regiuni din molecula ADN ce prezinta o anumita secventa de nucleotide :

- 2 copii ale unei secvente poli-GC in repetitie inversa; aceasta regiune prezinta complementaritate intracatenara si determina formarea in transcriptul ARN a unei structuri in ac-de-par (hairpin) ce impiedica avansarea ARN polimerazei

- o regiune formata din 4 - 10 adenine (ce corespunde pe transcript cu 4 - 10 resturi de uracil) care reprezinta semnalul propriu-zis de terminare a transcrierii

Desi regiunile terminator sunt identificate pe molecula ADN, terminarea transcrierii este de fapt realizata de catena ARN (Figura 4.19).

Pana in prezent au fost identificate 2 clase de terminatori la procariote :

- terminatori Rho - independenti : sunt regiuni de tip terminator in care cele 2 secvente poli-GC prezinta complementaritate intracatenara perfecta, realizand o structura in ac-de-par stabila

- terminatori Rho - dependenti : sunt regiuni terminator in care cele 2 poli-GC nu prezinta complementaritate intracatenara perfecta; in acest caz structura in ac-de-par este stabilizata de catre o proteina numita proteina Rho (de la litera greceasca Rho - r) care aluneca pe molecula ARN pana la acul-de-par si il stabilizeaza.

Figura 4.19 Structura terminatorilor la procariote.

3.3 ARN polimeraza de la procariote

Aceasta enzima este una dintre cele mai mari proteine din celula bacteriana, avand o greutatea de 480 kd, un diametru de aproximativ 100 Angstromi si fiind vizibila si la microscopul electronic. O celula de E.coli contine in medie 7000 de molecule de ARN polimeraza.

Holoenzima este formata din 4 tipuri de subunitati: , b, b' si Subunitatea este dimerizata, formul generala a enzimei fiind 2a - - ' - .

Subunitatea este codificata de gena rpoA si este dimerizata. Ea are un prim rol in asamblarea tuturor subunitatilor enzimei, proces ce se desfasoara in ordinea: Fiecare monomer de este format din 3 regiuni:

-CTD reprezinta domeniul carboxi-terminal al subunitatii si se ataseaza direct la ADN, recunoscand secventa UP din structura promotorilor.

-NTD reprezinta domeniul amino-terminal al subunitatii ; nu se ataseaza direct la ADN, ci la subunitatea

- linker polipeptidic ce are o structura flexibila si face legatura dintre cele 2 domenii terminale

Subunitatea este codificata de gena rpoB si realizeaza formarea propriu-zisa a legaturilor fosfo-diesterice intre ribonucleotide, acest proces desfasurandu-se intotdeauna in directie 5' - 3'.

Subunitatea este codificata de gena rpoC si are rol in atasarea initiala, situs-nespecifica a ARN polimerazei la molecula de ADN (Figura 4.20).

Subunitatea

Celula procariota contine mai multe specii moleculare de subunitate , fiecare recunoscand anumiti promotori si, deci, transcriind anumite gene. Astfel, in celula de E.coli, cele mai des intalnite specii moleculare de sunt:

are o g.m. de 70 kd si codificata de gena rpoD; acest recunoaste cele 2 secvente consensus TTGACA si TATAAT, fiind folosit de celula bacteriana in conditii generale de mediu. Ca urmare, marea majoritate a genelor bacteriene sunt transcrise cu ajutorul acestei subunitati

are g.m. 60 kd, este codificata de gena rpoN si este folosita de celula in conditii de privare de azot.

are g.m. de 32 kd, este codificata de gena rpoH si este folosita de celula in conditii de soc termic; cu ajutorul acestei subunitati sunt transcrise genele de soc termic.

are g.m. 24 kd, nu este cunoscuta gena codificatoare si este folosita de celula in conditii de soc termic extrem; se pare ca 24 participa la transcrierea unui set de gene ce determina o moarte celulara programata, o "sinucidere" celulara (asemanatoare proceselor de apoptoza de la celulele eucariote).

Figura 4.20 Reprezentarea schematica a atasarii ARN polimerazei procariote la promotori.

3.4 Fazele transcrierii genetice la procariote

Ca si alte procese realizate de materialul genetic, transcrierea genetica se desfasoara in 3 etape - initierea, elongarea si terminarea transcrierii.

Initierea transcrierii

Aceasta etapa incepe prin atasarea ARN polimerazei la un promotor, proces ce se desfasoara el insusi in mai multe etape:

a)    etapa de promotor inchis I - ARN polimeraza se ataseaza la hexamerul -35

b)   etapa de promotor inchis II (promotor curbat) - ARN polimeraza se ataseaza apoi si la hexamerul -10; cei 2 hexameri nu sunt insa orientati steric optim fata de situsurile de atasare la ARN polimeraza (si anume lla subunitatea s); ca urmare, pentru a se atasa la amandoi hexamerii, enzima trebuie sa distorsioneze molecula de ADN; deci, promotorul curbat prezinta o tensiune torsionala ce va fi eliberata prin deschiderea dublului helix pe o distanta de 10 - 18 pb, ajungandu-se astfel in cea de-a treia etapa, cea de

c)    etapa de promotor deschis; se formeaza astfel bucla de transcriere care depaseste situsul START (nucleotidul +1 al catenei matrita)

Se formeaza astfel un complex binar: ADN - ARN polimeraza. Initierea transcrierii continua cu atasarea primului nucleotid, care de obicei la procariote este ATP sau GTP. Complexul devine astfel din binar, ternar: ADN - ARN polimeraza - ARN. Dupa sinteza a aproximativ 8-10 ribonucleotide, subunitatea  se desprinde din complex, considerandu-se ca acest eveniment incheie etapa de initiere a transcrierii.

Elongarea transcrierii

Aceasta etapa incepe dupa desprinderea subunitatii  si este realizata de subunitatea  care formeaza legaturi fosfo-diesterice intre ribonucleotide. Catena ARN creste in directia 5' - 3'. Odata cu ARN polimeraza, si bucla de transcriere se deplaseaza pe molecula de ADN, transcriptul ramanand in hibrid cu matrita ADN doar pe o portiune de aproximativ 12 nucleotide.

Rata de polimerizare a ARN polimerazei de la E.coli este de circa 30 - 40 nucleotide per secunda. Frecventa erorilor de incorporare (a ribonucleotidelor gresit imperecheate cu cele din catena matrita ADN) de catre aceasta enzima este de 1 baza gresita per 10⁴ baze incorporate. Dupa ce ARN polimeraza a trecut de promotor, o alta enzima (cu tot cu subunitate ) se poate atasa la acesta si poate incepe o noua runda de transcriere.

Terminarea transcrierii

Terminarea transcrierii are loc in momentul in care ARN polimeraza ajunge in regiunea unui terminator. Acul-de-par format in catena transcriptului (vezi figura 4.18) blocheaza avansarea enzimei si o determina sa stationeze cateva milisecunde; acest timp este insa suficient pentru ca transcriptul sa se desprinda din hibridul cu catena ADN matrita (desprinderea este facilitata si de faptul ca legaturile dintre poli-A de pe ADN si poli-U din ARN sunt slabe). Bucla de transcriere se inchide si astfel procesul este incheiat.

Moleculele de ARN transcript pot evolua fie ca ARN measger, ARN ribozomal, ARN de transfer.

Majoritatea moleculelor de ARNm de la procariote sunt monocistronice si sunt alatuie din 3 regiuni mai importante :

- regiunea cap (leader), care contine secventa SHINE-DALGARNO (5'-AGGAGG3') ce este complementara cu un hexamer de la capul 3' al moleculelor de ARNr de 16S

- regiunea codificatoare, care incepe cu codonul start AUG si se termina cu un codon stop

- regiunea cozii

4 Transcrierea la eucariote

4.1 ARN polimerazele la eucariote

In sine, procesul de transcriere la organismele eucariote se desfasoara in mod similar cu cel de la procariote. Exista totusi o serie de diferente.

Astfel, in timp ce la procariote exista o singura specie moleculara de ARN polimeraza per celula, la eucariote exista, in majoritatea cazurilor 3 specii moleculare de asemenea enzime. Cele 3 ARN polimeraze de la eucariote sunt inrudite si structural si functional. Cu toate acestea, cele 3 enzime initiaza transcrierea de la promotori diferiti si transcriu gene diferite :

- ARN polimeraza I - transcrie in mod special gene ce codifica pentru ARN ribozomal

- ARN polimeraza II - transcrie mai ales gene ce codifica ARN mesager

- ARN polimeraza III - transcrie mai ales ARN de transfer si o serie de molecule mici de ARN, de exemplu ARN nuclear mic si nucleolar mic

Alte diferente importante apar si in ceea ce priveste factorii de transcriere. Astfel, daca la procariote initierea transcrierii necesita doar facotrul , la eucariote debutul acestui proces necesita mai multe proteine, denumite generic factori de transcriere generali.

In general, structura promotorilor pentru ARN pol I si III este mai simpla decat a promotorilor pentru ARN pol II, desi si aceste 2 enzime necesita factori de transcriere.

4.2 Promotorul la eucariote

Regiunile promotor la eucariote prezinta o zona "miez" care cuprinde un set minimal de secvente necesare initierii transcrierii de catre ARN pol II. Un asemenea "miez" de promotor este de obicei format din 40 de nucleotide ce cuprind de multe ori si situsul START (nucleotidul +1) si este format din :

- elementul BRE ce reprezinta elementul de recunoastere a factorului de transcriere TFIIB (TFIIB Recognition Element)

- cutia TATA la care se ataseaza factorul TBP (TATA Binding Protein); aceasta proteina reprezinta de fapt o subunitate a factorului de transcriere TFIID

- regiunea Inr (Initiator) la care se ataseaza factorul TFIID

- regiunea DPE (Downstream Promoter Element = elementul in aval fata de promotor) la care se ataseaza tot TFIID

Cei mai multi promotori de la eucariote includ doar 2 sau 3 din aceste regiuni (Figura 4.21).

4.3 Complexul de pre-initiere

Factorii de transcriere necesari ARN polimerazei II au fost notati TFII (Transcription Factors for RNA polymerase II).

La eucariote se formeaza mai intai un complex preoteic de pre-initiere care se ataseaza la elementul TATA. Succesiunea de evenimente este urmatoarea :

- elementul TATA este recunoscut de TFIID; aceasta proteina este un complex cu mai multe subunitati, dintre care una (TBP) se va lega la cutia TATA.

- celelalte subunitati ale complexului TFIID poarta numele de proteine TAF (TBP Associated Factors = factori asociati cu TBP)

- TBP se leaga la cutia TATA; prin legarea sa la cutia TATA, TBP distorsioneaza molecula de ADN in acea regiune determinand "recrutarea" si a altor factori de transcriere si a ARN polimerazei

- TFIIA si TFIIB se ataseaza la promotor

- TFIIF se cupleaza cu ARN polimeraza si impreuna se ataseaza la promotor

- TFIIE si TFIIH se ataseaza si ei la intreg acest complex nucleo-proteic

Ca urmare a atasarii acestor proteine, dublul helix se deschide in zona promotorului. Spre deosebire de procariote, la eucariote deschiderea dublului helix necesita energie (furnizata prin hidroliza ATP) iar procesul este mediat de activitatea de tip helicaza a factorului TFIIH

Sinteza catenei ARN poate acum sa inceapa.

Figura 4.21 Structura unui promotor la eucariote.

Figura 4.22 Factorii generali de transcriere pentru ARN polimeraza II

4.4 Factorii de elongare

In aceasta etapa, ARN polimeraza II se desprinde de marea majoritate a factorilor de initiere. Locul lor este luat de un set de factori de elongare (TFIIS, TEF). Astfel, TFIIS asigura icorporarea corecta a ribonucleotidelor si corecteaza bazele incorporate gresit (functie de "proofreading"). Factorul TEF fosforileaza anumite reziduuri de serina din structura ARN polimerazei II, fapt ce stimuleaza etapa de elongare.

Pe de alta parte, in timpul etapei de elongare, ARN polimeraza se asociaza cu o serie de proteine necesare pentru procesarea tipurilor de ARN transcript.

- enzime ce adauga la capul 5' al transcriptului un rest de guanina metilata, ceea ce ii va conferi transcriptului rezistenta la enzime de tip nucleaze si se ataseaza la structura ribozomului

- enzime ce produc poliadenilarea capatului 3': enzime de tip poli-A polimeraze adauga o coada de pana la 200 de resturi de A la capul 3' al transcriptului; atasarea unei asemenea enzime pare sa fie implicata in terminarea transcrierii

Bibliografie selectiva

Alberts B., Johnson A., Lewis J., Raff M., Roberts K., Walter P., 2002, Molecular Biology of the Cell. 4th ed., Garland Publishing House, New York.

Berg J.M., Tymoczko J.L., Stryer L., 2002, Biochemistry. , W. H. Freeman and Co., New York.

Brown T.A., 2002, Genomes. 2nd ed., BIOS Scientific Publishers, Ltd, Oxford, UK.

Campbell A.M., 1992, Chromosomal insertion sites for phages and plasmids. Journal of Bacteriology 174(23):7495-7499.

Cohen S.N., 1993, Bacterial plasmids: their extraordinary contribution to molecular genetics. Gene 135:67-76.

Cooper G.M., 2000, The Cell - A Molecular Approach. 2nd ed., Sinauer Associates, Inc., SUA.

Cornea C.P., 1998, Elemente de Inginerie Genetica, Editura ALL, Bucuresti.

Covic M., Stefanescu D., Sandovici I., 2004, Genetica medicala, Editura Polirom.

Dale J.W., 1998, Molecular Genetics of Bacteria, 3rd Edition.Anonymous Chichester, UK:John Wiley & Sons.

Del Solar G., Giraldo R., Ruiz-Echevarria M.J., Espinosa M., Diaz-Orejaz R., 1998, Replication and control of circular bacterial plasmids. Microbiol Molec Biol Rev 62(2):434-464.

Embley T.M., Hirt R.P., Williams D.M., 1994, Biodiversity at the molecular level: the domains, kingdoms and phyla of life. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 345(1311):21-33.

Espinosa M., del Solar G., Rojo F., Alonso J.C., 1995, Plasmid rolling circle replication and its control. FEMS Microbiol Lett 130:111-120.

Freifelder D., 1987, Microbial Genetics. Jones and Bartlett Publishers. Boston, USA.

Gavrila L., 2003, Genomica - Un tratat despre genom, de la virusuri la om, vol.I si vol.II, Editura Enciclopedica, Bucuresti.

Gilson E., Bachellier S., Perrin S., Perrin D., Grimont P.A.D., Grimont F., Hofnung M., 1990, Palindromic unit highly repetitive DNA sequences exhibit species specificity within Enterobateriaceae.. Researches in Microbiology 141:1103-1116.

Griffiths A.J.F., Miller J.H., Suzuki D.T., Lewontin R.C., Gelbart W.M., 1999, Introduction to Genetic Analysis. 7th ed., W. H. Freeman & Co., New York.

Hardy K.G., 1988, Plasmids: A Practical Approach. IRL Pres. Oxford, UK.

Herlea V., 1998 - Microbiologie generala, Ed. Univ., Bucuresti.

Hinnebusch H., Barbour A.G., 1992, Linear- and circular-plasmid copy numbers in Borrelia burgdorferi. J.Bact. 174(16):5251-5257.

Hinnebusch J., Tilly K., 1993, Linear plasmids and chromosomes in bacteria. Molecular Microbiology 10(5):917-922.

Hiraga S., 1992, Chromosome and plasmid partition in E.coli. Annu Rev Biochem 61:283-306.

Lewin B. , 1997, Genes. 6th ed., Oxford University Press, New York, USA.

Lodish H., Berk A., Zipursky S.L., Matsudaira P., Baltimore D., Darnell J.E., 2000, Molecular Cell Biology. 4th ed., W. H. Freeman & Co. Publishing, New York.

Manen D., Caro L., 1991, The replication of plasmid pSC101. Molecular Microbiology 5(2):233-237.

Margulis L., 1992, Biodiversity: molecular biological domains, symbiosis and kingdom origins. Biosystems 27(1):39-51.

Moller-Jensen J., Gerdes K.J.R., 2000, Plasmid and chromosome segregation in prokaryotes. Trends in Microbiology 8(7):313-320.

Nester E.W., Evans Roberts C., Nester M., 1995, Microbiology, A Human Perspective, WCB Publishers, SUA.

Pettijohn D.E., 1988, Histone-like proteins and bacterial chromosome structure. Journal of Biological Chemistry 263(26):12793-12796.

Pettijohn D.E., 1988, Histone-like proteins and bacterial chromosome structure. Journal of Biological Chemistry 263(26):12793-12796.

Prescott L.M., Harlez J.P., Klein D.A., 1996, Microbiology. Third Edition, WCB Publishers, SUA.

Raicu P., Stoian V., 1991, Genetica dezvoltarii la eucariote, Editura Academiei Romane.

Russel P.J., 1994, Fundamentals of Genetics, Harper Collins College Publishers, SUA.

Sakaguchi K., 1990, Invertrons, a class of structurally and functionally related genetic elements that includes linear DNA plasmids, transposable elements and genomes of adeno-type viruses.. Microbiological Reviews 54(1):66-74.

Stoica I., Vassu T., Sasarman E., 2002 - Biologia si taxonomia moleculara a microorganismelor. Colectia de culturi microbiene. Ed. Arvin Press.

Strachan T., Read A.P., 1999, Human Molecular Genetics 2. 2nd ed., BIOS Scientific Publishers, Ltd,Oxford, UK.

Summers D.K., 1996, The Biology of Plasmids.Anonymous Anonymous Oxford, UK:Blackwell Science Ltd.

Sykora P., 1992, Macroevolution of plamids: a model for plasmid speciation. Journal of Theoretical Biology 159:53-65.

Trun N.J., 1998, Architecture of a bacterial chromosome. ASM News 64(5):276-283.

Vassu T., Stoica I., Cstuak O., Musat F., 2001, Genetica microorganismelor si Inginerie genetica microbiana. Note de curs si Tehnici de laborator. Editura Petrion, Bucuresti.

Watson J.D., Baker T.A., Bell S.P., Gann A., Levine M., Losick R., 2004, Molecular Biology of the Gene. Fifth Edition, CSHL Press.

Weaver R.F., 1999, Molecular Biology, WCB McGraw-Hill Press.

Woese C.R., Kandler O., Wheelis M.L. , 1990, Towards a natural system of organisms: proposal for the domains Archaea, Bacteria and Eucarya., Proc Natl Acad Sci USA, 87, pp 4576-4579.

Zarnea G., Tratat de Microbiologie Generala. vol I (1983), II (1984) si V (1994), Editura Academiei Romane.