ENZIMELE RESPIRATORII

ENZIMELE RESPIRATORII

In procesul de respiratie exista un lant de reactii de oxidoreducere, catalizate de enzime specifice (biocatalizatori organici de natura proteica), indeosebi de enzimele respiratorii din grupa dehidrazelor.

Activitatea dehidrazelor

Dehidrazele sunt enzime oxidoreducatoare care catalizeaza dehidrogenarea si oxidarea substratului respirator donator de hidrogen (A) iar prin transportul de hidrogen realizeaza reducerea unui acceptor de hidrogen (B):

dehidraze

AH₂ + B ¾¾¾ A + BH₂

Rolul de transportor de hidrogen de la donator la acceptor este indeplinit de gruparile NAD, NADP care trec in forme reduse ( NADH₂, NADPH₂).

Dehidrazele se impart in doua subgrupe :

- reductaze care transporta hidrogenul pe un anumit acceptor specific;

- oxidaze care transporta hidrogenul pe diferiti intermediari pana cand este acceptat in final, de oxigenul atmosferic.

A. Reductazele

Punerea in evidenta a activitatii reductazei

Principiu Existenta reductazelor se pune in evidenta cu solutie de albastru de metilen care in stare oxidata are culoare albastra, dar prin acceptarea hidrogenului transportat de reductaze, trece intr-o forma redusa, incolora.

Materiale necesare seminte germinate de mazare, 2 eprubete, ulei, solutie 0,1% de albastru de metilen.

Modul de lucru In doua eprubete se pun cate 10 seminte germinate de mazare peste care se toarna 5 ml solutie de albastru de metilen. Intr-o eprubeta se toarna la suprafata un strat de ulei de aproximativ 1 cm, pentru a izola solutia de albastru de metilen de atmosfera inconjuratoare. Dupa cateva ore de repaus se constata ca in eprubeta in care s-a adaugat ulei, solutia se decoloreaza complet, pe cand in eprubeta fara ulei decolorarea este incompleta, iar la suprafata solutiei se pastreaza un inel de culoare albastra.

Interpretare. In eprubeta cu ulei, reductaza din semintele germinate a folosit solutia de albastru de metilen ca acceptor specific de hidrogen care trece intr-o forma redusa, incolora, numita leucobaza albastrului de metilen. In eprubeta fara ulei, decolorarea este incompleta si se pastreaza un inel de culoare albastra la suprafata, ceea ce se explica prin acceptarea de catre O₂ din atmosfera a hidrogenului cedat de solutia de albastru de metilen redusa, care trece astfel in forma initiala, oxidata, colorata in albastru.

Durata experientei 2 ore.

B. Oxidazele.

Oxidazele sunt enzime aerobe care catalizeaza reactiile de oxidoreducere cu ajutorul oxigenului din atmosfera sau cu oxigenul peroxizilor. Oxidazele transporta hidrogenul luat de la substratul donator si il trec numai pe oxigenul acceptor, rezultand apa sau apa oxigenata.

oxidaze

AH₂ + 1/2 O₂    ¾¾ A + H₂O

oxidaze

AH₂ + O₂    ¾¾ A + H₂O₂

Din punct de vedere al structurii chimice, oxidazele pot contine cationul Cu⁺⁺ (fenoloxidaze) sau cationul Fe⁺⁺ (citocromoxidaze).

Dupa mecanismul de actiune, oxidazele mai frecvente sunt:

a - fenolaze sau fenoloxidaze;

b - peroxidaze;

c- catalaza.

Punerea in evidenta a activitatii fenolazelor

Principiu. Fenolazele (fenoloxidazele) pot fi: monofenolaze care oxideaza monofenolii si polifenolaze care oxideaza polifenolii dand chinone.

Materiale necesare tubercul de cartof, cutit, razatoare, tifon, 2 eprubete, bec de gaz, solutie alcoolica 1% de rasina de guaiac.

Modul de lucru Un tubercul de cartof curatat, se da prin razatoare, se adauga 10-15 ml apa iar dupa agitare se filtreaza sau se trece printr-un tifon. Extractul obtinut se    pune in 2 eprubete dintre care una se incalzeste la fierbere. In fiecare eprubeta se pun cate 8-10 picaturi de tinctura de guaiac (1%) si se constata ca la suprafata lichidului care nu a fiert apare o culoare albastra intens.

Interpretare La extractul care nu a fiert, enzima fenolaza a catalizat oxidarea (dehidrogenarea) acidul guaiaconic (C₂₂H₂₁O₃(OH)₃) din rasina de guaiac, folosind oxigenul molecular din atmosfera, trecand in albastru de guaiac sau tetraguaiac chinona. In eprubeta supusa fierberii nu apare coloratia albastra deoarece prin fierbere au fost distruse enzimele care ar fi putut cataliza oxidarea acidului guaiaconic.

Aceasta metoda se poate aplica si la alte materiale vegetale (mere, pere, prune).

Durata experientei: 15 minute.

Identificarea tirozinazei din tuberculii de cartof

Principiu. Tirozinaza este o monofenolaza care catalizeaza oxidarea tirozinei intr-un pigment de culoare rosie (dioxifenilalanina) care se transforma treptat in melanina (o substanta cancerigena de culoare bruna-neagra).

Materiale necesare tuberculi de cartof, perforator de dopuri, doua eprubete, bec de gaz.

Modul de lucru Dintr-un tubercul de cartof se scot 3 cilindri cu ajutorul unui perforator. Primul se lasa la aer, al doilea se scufunda intr-o eprubeta cu apa (asigurand conditii de anaerobioza) iar al treilea cilindru se lasa la aer dupa ce a fost fiert timp de 3-4 minute intr-o eprubeta. Dupa un timp se constata ca numai primul cilindru de cartof se innegreste.

Interpretare. Reactia de inrosire, brunificare si innegrire a primului cilindru de cartof se datoreste activitatii tirozinazei din tesuturile vii care oxideaza tirozina (monofenol) in melanina.

Cilindrul de cartof cufundat in apa nu se brunifica din lipsa oxigenului atmosferic iar cilindrul fiert in prealabil nu se brunifica datorita distrugerii enzimei tirozinaza prin fierbere.

Durata experientei 30 minute.

Identificarea activitatii peroxidazei in tesuturile vegetale

Principiu. Peroxidaza este o enzima care oxideaza (dehidrogeneaza) diferite substraturi organice numai cu ajutorul oxigenului peroxidic rezultat din descompunerea apei oxigenate:

peroxidaza

AH₂+H₂O₂    ¾¾¾ 2H₂O+A

Materiale necesare Radacina de hrean, sticla de ceas, solutie alcoolica 1% de rasina de guaiac, solutie 3% de apa oxigenata.

Modul de lucru Se taie felii din radacina de hrean, se pun intr-un vas Petri sau sticla de ceas peste care se toarna cateva picaturi de tinctura 1% de rasina de guaiac. Nu se observa colorarea tesuturilor in albastru deoarece hreanul contine cantitati foarte reduse de fenolaze care pot cataliza oxidarea substratului vegetal cu O₂ atmosferic. Daca se adauga cateva picaturi de solutie 3% de H₂O₂ apare imediat culoarea albastra.

Interpretare. In esuturile din hrean contin o mare cantitate de peroxidaze care catalizeaza oxidarea acidului guaiaconic cu formarea tetraguaiac chinonei, folosind oxigenul peroxidic rezultat din descompunerea apei oxigenate:

H₂O₂    H₂O + O

Durata experientei 10 minute.

Determinarea activitatii catalazei prin metoda gazometrica

Principiu Catalaza este enzima care descompune apa oxigenata din tesuturi in apa si oxigen molecular.

catalaza

2 H₂O₂    ¾¾ 2 H₂O + O₂

Determinarea activitatii catalazei are la baza masurarea volumului de oxigen degajat intr-o unitate de tip.

Aparate si dispozitive dispozitiv pentru determinarea catalazei alcatuit din : vas de reactie cu doua brate, biureta gradata, tub de sticla in forma de T, palnie de sticla, stativ metalic, tuburi de cauciuc (fig. 93).

Materiale necesare material vegetal, nisip de cuart sau praf de sticla, mojar cu pistil, carbonat de calciu sau praf de creta, solutie 3% de apa oxigenata, apa distialta.

Modul de lucru Se umple dispozitivul cu apa pana la nivelul zero al biuretei. Se cantaresc doua grame de material vegetal (frunze de grau, seminte germinate, tuberculi de cartof) care se mojareaza cu 0,5 g nisip de cuart sau praf de sticla pana la obtinerea unei paste omogene ce se introduce intr-un brat al vasului de reactie. La mojararea materialului vegetal se poate adauga putin praf de creta (CaCO₃) pentru a crea un mediu slab alcalin (pH = 7-7,7) optim pentru activitatea catalazei. In acelasi brat al vasului de reactie se toarna 10 ml apa cu care se clateste mojarul. In celalalt brat al vasului de reactie se introduc 5 ml solutie 3% de apa oxigenata si prin miscari lente, se rastoarna apa oxigenata peste materialul vegetal si invers, notandu-se timp de 9 minute, la intervale de 60 de secunde nivelul la care a scazut apa din biureta datorita oxigenului degajat prin scindarea apei oxigenate de catre catalaza din materialul vegetal in vasul de reactie.

Fig. 93. Dispozitiv pentru determinarea activitatii catalazei

Interpretare. Dupa volumul de O₂ degajat se determina activitatea catalazei, exprimata in cm³ O₂. In acelasi interval de experimentare se lucreaza cu diferite materiale vegetale, aflate in stare fiziologica activa sau in stare de repaus, datele obtinute fiind integrate intr-o reprezentare grafica.

Durata experientei: 30 minute.