CROMATOGRAFIE PE STRAT SUBTIRE PENTRU SEPARAREA UNOR PRODUSI COLORATI

CROMATOGRAFIE PE STRAT SUBTIRE PENTRU SEPARAREA UNOR PRODUSI COLORATI

1. Introducere

Progresul chimiei compusilor naturali datorat importantei deosebite a acestora si utilizarii lor intensive a dus la necesitatea dezvoltarii unei metode de separare a substantelor, in particular a metodei de absorbtie cromatografica, descoperita de Tsvet (1906).

Cromatografia este o metoda de separare a unor componenti dintr-un amestec bazandu-se pe diferenta coeficientilor de repartitie a acestor componenti intre o faza mobila si o faza stationara. Faza stationara este situata pe un suport peste care este trecuta proba cu ajutorul unei faze mobile. Componentii probei repartizati in faza stationara stau mai mult timp in contact cu suportul si sunt separati de componentii continuti in mod predominant in faza mobila. Atunci cand se folosesc coloane, componentii eluati din coloana pot fi cuantificati cu ajutorul unui detector si colectati individual pentru analize ulterioare.

Separarile cromatografice au la baza principii determinate de fenomenul de repartitie si de transport de masa. Repartitia unei substante intre doua faze este fenomenul de baza pentru extractia si separarea ei cromatografica.

Cand vorbim despre cromatografie, avem in fata un camp amplu de tehnici si metode specifice, fiecare avand anumite caracteristici care determina aplicabilitatea intr-un anumit domeniu. Astfel, putem vorbi despre cromatografia de gaze, despre cromatografia de lichide, despre cromatografia ionica, despre cromatografia pe strat subtire, despre coloane cromatografice,etc.

Cromatografia de lichide (LC) este o tehnica analitica utilizabila pentru separarea ionilor sau moleculelor dizolvate intr-un solvent. Daca solutia probei este in contact cu o faza solida sau lichida, compusii dizolvati vor interactiona diferit cu celelalte faze datorita diferentelor de: adsorbtie, schimbului ionic, repartitie sau dimensiune. Aceste diferente permit separarea componentilor dintr-un amestec, diferentierea determinand timpi de tranzitie diferiti prin coloana cromatografica pentru fiecare compus dizolvat. Cromatografia de lichide simpla se face pe o coloana cu o frita la baza ce tine faza stationara in echilibru cu un solvent, fiind extensiv utilizata in scop preparativ pentru purificarea si izolarea unor compusi de importanta practica (farmaceutica, medicala, protectia mediului). S-a dezvoltat in ultimul timp si cromatografia de lichide de inalta performanta (HPLC), care se evidentiaza datorita faptului ca ajuta la realizarea unor separari mult mai rapide, rezolutiile fiind deasemenea foarte bune. Aparatul este constituit dintr-un rezervor al fazei mobile, o pompa, un injector, o coloana de separare si un detector, proba lichida fiind introdusa prin injectare in fluxul de solvent.

Cromatografia de gaze (GC) este o tehnica cromatografica ce poate fi utilizata pentru separarea compusilor organici care sunt volatili. Un cromatograf de gaze consta dintr-o faza mobila, un injector, o coloana de separare, un detector si un sistem de inregistrare. Componentii amestecului sunt separati datorita diferentei existente in repartitia lor intre gazul folosit drept faza mobila (de regula un gaz inert) si faza stationara continuta de coloana. Deoarece repartitia este dependenta de temperatura, coloana de separare este termostatata. Cele mai multe coloane contin faza stationara pe un suport solid, separarea gazelor cu greutate moleculara redusa fiind insotita de adsorbtia pe solid.

Cromatografia ionica (IC) este o forma de cromatografie lichida ce utilizeaza rasini schimatoare de ioni pentru a separa ionii din solutie datorita interactiei diferite a acestora cu rasina. Este foarte utilizata in analiza anionilor pentru care nu exista o alta metoda mai rapida, dar si pentru cationi si specii biochimice (aminoacizi, proteine).

2. Cromatografia pe strat subtire

Cromatografia pe strat subtire este o tehnica cromatografica utilizata pentru separarea unor amestecuri de solutii colorate. Aceasta tehnica presupune existenta a doua faze, prima fiind faza stationara constituita dintr-un strat subtire de material absorbant, in general silica-gel, oxid de aluminiu sau celuloza, imobilizate pe o placa inerta de sticla sau plastic. Placile cromatografice sunt realizate prin amestecarea adsorbantului, cum ar fi silica-gelul mentionat anterior, cu o cantitate mica de material de legatura inert, de exmplu sulfatul de calciu si cu apa. Acest amestec este distribuit sub forma unei paste intr-un strat subtire pe suportul nereactiv, de obicei sticla, folii subtiri de aluminiu, sau plastic, iar placa rezultata este uscata si activata prin incalzire intr-un cuptor la 110⁰ C timp de jumatate de ora. Grosimea stratului absorbant este cuprinsa in general intre 0.1-0.25 mm atunci cand placile se folosesc in scopuri analitice si in jur de 1-2 mm pentru alte operatii preparative ale cromatografiei pe strat subtire. A doua faza, cea lichida, consta in solutia care urmeaza a fi separata, care este apoi dizolvata intr-un solvent organic compatibil. Proba, fie lichida fie dizolvata intr-un solvent volatil, este depusa sub forma punctuala (spot) pe faza stationara. Prin introducerea capatului inferior al placii intr-un rezervor de solvent are loc o migrare a amestecului in plan vertical, datorata actiunii fortelor de capilaritate, separandu-se astfel solutia experimentala pe baza diferentei de polaritate a diversilor componenti ai probei in cauza. Cand solventul ajunge la celalat capat al fazei stationare, placa este scoasa si uscata. Spoturile separate sunt vizualizate fie in mod direct, atunci cand sunt colorate, fie cu ajutorul luminii ultraviolete sau prin plasarea placii in vapori de iod.

Componentii probei sunt antrenati cu viteze variabile spre capatul placii de catre solvent datorita diferentelor dintre coeficientii lor de repartitie intre faza mobila si faza stationara, astfel constituentii necunoscuti pot fi identificati prin eluarea simultana cu unele substante standard.

Cromatografia pe strat subtire poate fi automatizata utilizand un solvent in curgere fortata, lasand placa in vid pentru uscarea finala a acesteia, si realizand o inregistrare a cromatogramei finale prin spectrometrie de absorbtie in UV-Vis sau fluorescenta utilizand diferite surse de lumina.

Fluxul de solvent poate fi dirijat pentru perioade scurte de timp, placa cromatografica fiind uscata si apoi repetandu-se procesul cu un alt solvent. Spoturile sunt reconcentrate iar rezolutia atinsa creste.

Separarea compusilor este bazata pe competitia solventului si a fazei mobile in gasirea unui loc de legatura la suprafata fazei stationare. De exemplu, daca este utilizat silica-gelul ca faza stationara atunci stratul poate fi considerat polar. Avand doi compusi cu polaritati diferite in amestec, intre compusul cu polaritatea cea mai mare si strat se stabilesc interactiuni mai puternice si, astfel, acesta are o capacitate mai mare de a fi adsorbit. Similar, componentul cu polaritatea cea mai mica difuzeaza mai sus in planul vertical al placii (rezultand astfel si o valoare a factorului de retentie Rf mai mare). Daca faza mobila se schimba prin utilizarea unui solvent mai polar sau a unui amestec de solventi, toti compusii de pe placa cromatografica vor migra in partea superioara a stratului. Aceasta inseamna ca daca folosim un amestec de acetat de etil si heptan ca faza mobila, adaosul acetatului de etil va duce la valori mai mari ale Rf pentru toti compusii separati pe placa. Schimband polaritatea fazei mobile nu se va inversa si ordinea de difuzie a compusilor pe placa. Daca este dorita o inversare a ordinii compusilor, trebuie folosita o faza stationara nepolara, cum ar fi silicea functionalizata C-18.

Solventul adecvat in cazul cromatografiei pe strat subtire va fi cel a carui polaritate este diferita de cea a materialului fazei stationare. Daca se foloseste un solvent polar si spotul este aplicat pe o faza stationara polara, spotul va creste radial datorita actiunilor capilare, lucru care nu este de dorit deoarece poate avea loc o interdifuzie a spoturilor. Astfel, pentru a putea tine sub control distributia spoturilor, solventul utilizat pentru dizolvarea probei trebuie sa fie unul nepolar sau semipolar atunci cand faza stationara este polara si viceversa.

Spoturilor vizibile si bine conturate li se poate calcula un factor de retentie (Retention factor - Rf), pentru fiecare spot in parte acesta putandu-se calcula impartind distanta parcursa de component pana in acel punct la distanta totala parcursa de solvent. Aceste valori depind de tipul solventului utilizat si de tipul placii cromatografice folosite si nu sunt constante fizice, astfel ca pentru solventi diferiti sau materiale adsorbante diferite avem valori distincte.

Printre utilizarile cele mai des intalnite ale cromatografiei pe strat subtire putem mentiona: analiza puritatii unor anumite produse farmaceutice; determinarea pigmentilor unei plante; detectarea pesticidelor sau insecticidelor din produsele alimentare; analiza compozitionala a unui amestec colorat (vopseluri); monitorizarea reactiilor organice, etc.

Avantajele utilizarii cromatografiei pe strat subtire sunt multiple, cele mai importante fiind: costul scazut al analizei; timpul scurt in care se desfasoara analiza; efectuarea unor operatiuni care nu implica un grad sporit de complexitate; vizualizarea tuturor spoturilor; disparitia necesitatii de a efectua o purificare prealabila a probei; adaptabilitatea metodei in cazul majoritatii produselor farmaceutice; folosirea unor cantitati mici de solventi; necesitatea unei pregatiri prealabile minimale a personalului care va realiza analiza; posibilitatea utilizarii densiometrelor pentru a creste acuratetea spoturilor separate.

3. Aplicatii moderne ale cromatografiei pe strat subtire

Cromatografia pe strat subtire are numeroase aplicatii, cele mai intesesante dintre ele fiind in domeniul medicinii si farmacologiei. Astfel, nu numai ca se pot separa diferiti pigmenti clorofilieni cu importanta practica, dar se pot deasemenea separa si identifica compusi biologici cu o importanta deosebita pentru organismul uman. Cele mai multe cercetari in acest domeniu se concentreaza in ultima perioada pe separarea unor amestecuri de lipide in vederea analizei lor compozitionale individuale si corelarea rezultatelor obtinute cu datele din domeniul imunologiei si patologiei pentru stabilirea cauzalitatii aparitiei mai multor tipuri de boli.

Un exemplu foarte interesant mi s-a parut a fi utilizarea unei metode densitometrice a cromatografiei pe strat subtire de inalta precizie (HPLC) pentru a separa clasele majore de lipide componente ale tesutului nervos. Pentru aceasta s-a utilizat o coloana cromatografica DEAE - Sephadex pentru a separa lipidele in fractii lipidice acide si neutre. Acestea au fost apoi spotulate si separate pe placi cromatografice folosind sisteme de cate doi solventi, de exemplu: cloroform-metanol, acid acetic-acid formic, hexan-diizipropil. Concentratia lipidelor a fost determinata prin densitometrie in situ, prin compararea cu standardele absolute ale claselor de lipide obtinute tot cromatografic prin aceeasi metoda, in aceleasi conditii. Sensibilitatea metodei a fost crescuta prin utilizarea acetatului cupric care a ajutat la cresterea intensitatii spoturilor. Analiza a fost facuta utilizand 5 mg de tesut nervos umed, limitele de detectie ale acestei metode situandu-se sub 20 ng pentru fiecare clasa de lipide. Rezultatele obtinute in cazul tesutului uman sunt prezentate in tabelul urmator:

4. Etapele analizei cromatografice pe strat subtire

Realizarea separarii unui amestec de coloranti utilizand metoda cromatografiei pe strat subtire, presupune parcurgerea urmatoarelor etape:

prepararea probei;

prepararea standardelor;

prepararea fazei mobile (solventul);

realizarea marcajelor de control pe placa cromatografica;

depunerea probelor pe placa;

plasarea placii in camera de developare;

conditionarea camerei de developare;

developarea placii;

vizualizarea si interpretarea;

estimarea concentratiilor;

calcularea valorii factorului de retentie.

In cazul experimentului nostru se va realiza separarea a trei amestecuri de coloranti folosind patru tipuri de solventi, de polaritati diferite.

Pregatirea camerei de developare

Camera de developare poate fi constituita dintr-un recipient de sticla cu capac, de dimensiuni suficiente pentru a permite introducerea placilor cromatografice in intregime. O hartie de filtru trebuie taiata astfel incat sa poata fi introdusa, atingand partea inferioara, peretii, si ajungand pana la 1cm sub capatul de inchidere al recipientului. Pentru a ne asigura ca hartia este bine taiata, putem plasa o placuta cromatografica neutilizata in recipient, observand daca aceasta intra in contact cu hartia de filtru, lucru care trebuie evitat. Indepartam placuta si saturam hartia cu un solvent de developare utilizand o pipeta Pasteur. Turnam apoi in recipient o cantitate de solvent care sa nu depaseasca 0,5 cm. Punem apoi capacul recipientului pentru a pastra conditiile de saturare.

Figura 1. Variante constructive ale camerei de developare

Figura 2. Masurarea volumului de solvent

Figura 3. Pregatirea hartiei de filtru pentru camera de developare

Figura 4. Camera de developare conditionata

Pregatirea placii cromatografice

Trebuie sa avem in primul rand grija sa nu atingem suprafata acoperita a placii, de aceea placa se va manipula doar tinandu-se cu atentie de margini. Folosind un creion, se traseaza o linie pe intreaga latime a placii, la aproximativ 1 cm fata de capatul inferior al acesteia. Notam apoi locurile de depunere a probelor, incercand ca toate cele trei puncte sa fie la distante egale intre ele si fata de margini.

Figura 5. Marcarea frontului inferior de spotulare pe placa cromatografica

Plasarea probelor pe placa

Se imerseaza capatul deschis al unui tub capilar in solventul ce contine componentul care urmeaza a fi eluat. Se atinge capatul tubului printr-o miscare scurta si usoara de suprafata acoperita a placii, in locul marcat corespunzator probei respective. Dupa realizarea acestei operatii se plaseaza placuta in camera de developare saturata si se inchide din nou capacul. Substanta trebuie sa fie eluata pana frontul de solvent atinge o inaltime de pana la 0,5 cm sub capatul superior al placutei cromatografice.

Figura 6. Imersarea capilarului in proba

Figura 7. Tub capilar cu proba

Figura 8. Spotularea pe placa cromatografica

Figura 9. Introducerea placii in camera de developare

In figura 10 este prezentat un recipient dupa parcurgerea tuturor etapelor descrise anterior.

Figura 10: Camera de developare cu solvent in care a fost introdusa placa cromatografica dupa depunerea probelor

Figura 11. Inaintarea frontului de solvent pe placa

Figura 12. Migrarea spotului

Figura 13. Scoaterea placii din camera de developare

Marcarea placii cromatografice

Dupa atingerea conditiilor descrise anterior, placa se scoate din recipient, si se traseaza o linie de demarcare in dreptul locului pana la care a ajuns solventul. Dupa aceasta placa se lasa la uscat. Dupa uscare, se analizeaza placa developata cu ajutorul luminii UV la lungimea de unda de 254 nm. Se incercuiesc toate spoturile vizibile cu ajutorul creionului. Putem realiza suplimentar si o vizualizare folosind vapori de iod, pentru a detecta eventualele spoturi invizibile in lumina UV.

Figura 14. Marcarea frontului superior pana la care a inaintat solventul

Figura 15. Marcarea spoturilor

Figura 16. Analiza placutei la lumina UV pentru marcarea spoturilor suplimentare

Figura 17. Spoturi vizibile in UV

In cazul analizei noastre vom avea 4 recipiente cu cei 4 solventi diferiti in care se vor plasa placutele cromatografice inseminate cu proba, dar avand grija sa respectam corelatia dintre polaritatile placuta-solvent. De exemplu, daca stratul depus pe placa este silica-gel, adica polar, vom folosi un solvent nepolar, cum este hexanul. Pentru o placa cu strat nepolar de silice functionalizata C-18, se va folosi drept solvent metanol, etanol sau acid acetic. Intr-un solvent polar va fi favorizata migrarea compusilor polari si vice-versa.

Etapa de analiza presupune:

calcularea valorii Rf;

compararea valorilor cu cele ale compusilor cunoscuti si necunoscuti si interpretarea datelor;

compararea metodelor de vizualizare folosite;

identificarea prin comparare cu standardele a compusilor.

5. Interpretarea rezultatelor

In cadrul etapei de interpretare a rezultatelor, cea mai mare importanta o are calculul valorii factorului de retentie Rf. Aceasta valoare se obtine prin masurarea distantei dintre punctul de depunere al spotului si centrul spotului pana la care compusul a migrat si, impartirea acesteia la distanta totala parcursa de solvent. Pentru a intelege mai bine acest procedeu, edificator este exemplul din figura 18.

Figura 18. Exemplu de calcul a valorii Rf

In functie de valoarea Rf putem considera:

Rf < 0.1 - spoturile sunt prea aproape de origine, proba este nereprezentativa;

0,1 < Rf < 0,8 - domeniul optim;

Rf > 0,8 - spoturile sunt prea apropiate intre ele sau distorsionate, proba este nereprezentativa.

Prin comparare cu standardele, compusii separati pot fi identificati. In acest caz, se tine cont de urmatoarele criterii:

standardul si proba se obtin in urma folosirii aceluiasi procedeu, acelorasi materiale, in aceleasi conditii de lucru;

daca intensitatea zonei in care s-a situat spotul este cuprinsa intre 80 - 100% din valoarea standardului - identificarea este validata;

daca intensitatea este mai mica - proba nu se valideaza;

standardul si proba trebuie sa aiba valori identice ale Rf - identificarea este validata.

6. Modul de lucru

Realizarea experimentului in laborator a presupus parcurgerea tuturor pasilor descrisi in capitolul 4 si ilustrati cu ajutorul figurilor 1 - 17.

Se utilizeaza cinci camere de developare si cinci placute cromatografice pe care se va depune amestecul de coloranti ce va trebui separat. Initial vom utiliza patru solventi: eterul de petrol, acetatul de etil, aceto-nitrilul si izopropanolul, urmand sa observam care dintre ei realizeaza cea mai buna separare si care cea mai rapida. Dupa ce determinam solventii care indeplinesc criteriile anterioare, in cea de-a cincea camera vom realiza un amestec din solventii alesi si vom urmari comportarea acestuia.

In fiecare camera de developare punem solvent pana la un nivel de maxim 0,5 cm, dupa care acoperim recipientul. Pe patru placute cromatografice marcam frontul inferior de spotulare la aproximativ 2 cm fata de baza. Cu ajutorul unui tub capilar luam proba ce contine amestecul de coloranti si depunem cate un spot pe fiecare placuta pe linia marcata. Introducem placutele in camerele de developare cu solventi si urmarim timpul de elutie pentru fiecare. Cand frontul de solvent ajunge la aproximativ 2 cm fata de partea superioara a placutei, scoatem placuta, notam nivelul pana la care a ajuns solventul si o lasam apoi sa se usuce. Dupa uscare, examinam vizual spoturile, si pe cele bine conturate, care nu s-au amestecat cu altele si nu au un aspect difuz, le marcam, urmand pe baza masuratorilor sa calculam valorile factorilor de retentie, ca in exemplul din figura 18.

Realizam un amestec din acetonitril si izopropanol pe care il turnam in cea de-a cincea camera de developare. Repetam aceleasi operatii descrise anterior, realizand aceleasi observatii si calcule.

7. Rezultate experimentale

Rezultatele experimentale sunt prezentate sub forma tabelara, dupa cum urmeaza: