MICROSCOPUL SI UTILIZAREA LUI

MICROSCOPUL SI UTILIZAREA LUI

1. PARTILE COMPONENTE ALE MICROSCOPULUI
2. TEHNICA DE LUCRU- OBTINEREA IMAGINII

Transformatorul se conecteaza la reteaua de 220V si apoi se stabileste legatura intre sursa de lumina (becul) a microscopului si priza proprie a transformatorului.

Prin rotirea revolverului se aduce obiectivul de 10x in axul optic al microscopului.

Se stabileste distanta interoculara in functie de distanta interpupilara a examinatorului.

Privind prin oculare, se controleaza iluminarea campului microscopic. Intensitatea luminii se corecteaza prin ridicarea sau coborarea condensatorului, in functie de puterea de marire a obiectivului.

Se aseaza lama portobiect cu lamela in sus pe fata superioara a platinei, fixand-o cu ajutorul valetilor. Se centreaza apoi preparatul in axul optic al microscopului.

Privind lateral, cu ajutorul vizei macrometrice se coboara tubul pana la o distanta mai mica decat distanta focala a obiectivului cu care examinam preparatul (distanta focala pentru obiectivul de 10x este de 16mm).

Punerea la punct a imaginii: privind prin oculare se ridica incet tubul cu ajutorul vizei macrometrice pana apare imaginea clara in campul microscopic. Apoi se corecteaza claritatea imaginii cu ajutorul vizei micrometrice.

Daca nu apare nici o imagine inseamna ca:

obiectivul nu se afla in axul optic

preparatul nu se afla in campul microscopic

s-a ridicat prea repede tubul microscopului.

Tot timpul studiului la microscop se tine mana in permanenta pe viza micrometrica, cu care se fac scurte miscari de rotire inainte si inapoi pentru a adapta in permanenta ochiul examinatorului, deoarece preparatul nu are aceeasi grosime pe toata suprafata sa.

Cu ajutorul celor doua vize laterale ale platinei se va misca lama cu preparatul in directie anteroposterioara si de lateralitate, in vederea examinarii lui in totalitate.

3. EXAMINAREA PREPARATELOR

TIPURI DE MICROSCOAPE OPTICE

MICROSCOPUL SI UTILIZAREA LUI

Lupa este o lentila simpla, convergenta, cu o distanta focala mai scurta decat distanta vederii clare. Ea se aseaza cat mai aproape posibil de ochi pentru ca sa vedem sub un diametru evident mai mare, obiecte mici, ale caror detalii sunt invizibile.

Microscopul este un instrument optic cu ajutorul caruia se studiaza structurile cu dimensiuni sub limita vizibilitatii cu ochiul liber.

In studiile histologice se folosesc doua tipuri de microscoape, in functie de tipul de radiatii utilizate:

Microscopul optic (fotonic)

Este un aparat optic de marit folosit in studiul explorator al structurilor cu dimensiuni micronice si care foloseste ca sursa luminoasa lumina naturala sau artificiala.

Are in alcatuire :

-o parte mecanica

-o parte optica

B.               Componenta mecanica

Reprezinta un sistem de piese mecanice ce contine sistemul optic de marit, pe cel de iluminat si pe cel de captat si transmis lumina. Aspectul si forma dispozitivului mecanic pot sa varieze usor de la un tip de microscop la altul.

Rolul acestei componente este de a sustine partile sistemului optic si de a creea posibilitatea de manevrare a componentelor sistemului optic.

Alcatuire :

A.1 Piciorul sau talpa microscopului

A.2 Coloana microscopului

A.3.Dispozitive de punere la punct a imaginii

A.4.Tubul microscopului

A.5. Platina sau masuta microscopului cu cavalerii

Piciorul, sau talpa microscopului- este un dispozitiv metalic sub forma de  U  sau  V , ce asigura stabilitatea aparatului. In el sunt montate : sursa de lumina, oglinda proiectoare si un diafragm (iris).

Coloana microscopului- de forma dreapta sau curba se articuleaza in partea sa inferioara cu piciorul microscopului. In partea sa superioara si anterioara, coloana prezinta un sistem de angrenaj prin sina dintata pentru tubul microscopului. La coloana sunt montate : platina, tubul, dispozitivul de punere la punt a imaginii.

Dispozitivele de punere la punct a imaginii , sunt fixate la coloana microscopului. Ele sunt reprezentate de doua perechi de suruburi numite vize, dispuse simetric de o parte si de alta a coloanei :

a) Vizele macrometrice-sunt reprezentate de o pereche de suruburi ce imprim tubului microscopic deplasari mari fata de preparatul de studiat, obtinand o punere la punct a imaginii aproximativ clara. Aceasta pereche de vize se angreneaza prin dintii axei orizontale care le uneste cu dintaturile oblice sapate in sistemul de angrenaj de pe tubul microscopului.

b) Vizele micrometrice, constituie cealalta pereche de vize, ce imprima microscopului miscari foarte fine, lente, pentru a completa claritatea si precizia imaginii inceputa cu viza macrometrica.

Tubul microscopului- este format din doua tuburi cilindrice, telescoape, innegrite in interior pentru a evita reflectarea luminii. Ele poarta la cele doua extremitati partea optica propriu zisa a microscopului. La extremitatea superioara a tubului interior, se adapteaza ocularul, iar in partea inferioara obiectivele prin dispozitivul numit revolver.

Revolverul- este format din doua calote sferice unite printr-o axa de rotatie.

-a) Calota superioara, este fixata excentric la capatul inferior al tubului si prezinta un orificiu circular in dreptul tubului.

-b) Calota interioara, prezinta unu pana la cinci orificii filetate pentru adaptarea obiectivelor si se poate roti pe prima calota aducand in axul optic al microscopului obiectivele. Un dinte metalic montat intre cele doua calote blocheaza fiecare obiectiv in parte cand acesta a fost adus in axa optica a microscopului prin rotirea revolverului.

Tubul purtator al sistemului optic in totalitatea sa este angrenat la o coloana vertebrala de suport prin sina dintata si se apropie sau se departeaza de platina, care sprijina preparatul de studiat, prin deplasarea verticala determinata prin rotirea celor doua perechi de vize.

Platina microscopului (masuta)- este o placa metalica rotunda sau patrata, fixata orizontal la coloana microscopului, deasupra articulatiei acesteia cu piciorul. Central platina tuturor microscoapelor prezinta un orificiu circular, larg de 2,5cm care permite trecerea dispozitivului de captat si transmis lumina inspre tubul microscopului.

Cavalerii sau valetii, fixeaza pe platina preparatul de studiat.

C.               Componenta optica

Este alcatuita din :

Sistemul de iluminare

Sistemul optic propriu -zis

B. 1 Sistemul de iluminare

Contine :

-Sursa de lumina, inclusa in talpa microscopului si este reprezentata de un bec de 6V, alimentat de un transformator.

Transformatorul este plasat in afara elementelor microscopului si are rolul de a transforma sursa de curent de la 220V la 6V ; prezinta un cordon cu stecher .

Microscoapele mai vechi utilizau sursa de lumina artificiala externa sau lumina obisnuita.

b. Sistemul de captat si transmis lumina este alcatuit din:

- Oglinda plana, este montata in talpa microscopului si are rolul de a orienta razele luminoase in axul optic al microscopului cu ajutorul a doua vize;

- Diafragm (iris) - este situat intre sursa de lumina si oglinda;

Este montat intr-un inel metalic constituind un diafragm a carui deschidere se regleaza printr-o tija laterala putand micsora sau mari conul luminos ce iese prin deschiderea circulara din talpa microscopului.

- Condensatorul - este format dintr-un sistem de lentile convergente, montate intr-un dispozitiv mobil aflat sub platina si are rolul de a focaliza lumina pe preparatul microscopic. In functie de obiectivul folosit se stabileste si pozitia condensatorului: cand se utilizeaza obiective cu putere mare de marire, se ridica condensatorul, iar cand se foloseste obiectiv cu putere de marire mica, se coboara (avand pozitie inferioara pentru obiectivul de 10x, iar pe masura ce creste puterea de marire a obiectivului se ridica condensatorul, avand pozitie maxima pentru obiectivul de 90x).

B.2. Sistemul optic propriu-zis

Este reprezentat de: 1. Sistemul obiectiv

2. Sistemul ocular

1. Sistemul obiectiv

Este format din cinci obiective, care se insurubeaza in orificiile filetate ale discului mobil al revolverului.

* Fiecare obiectiv este format dintr-un sistem de lentile convergente dispuse intr-o anumita ordine intr-un tub metalic; puterea de marire a obiectivelor este inscrisa pe acestea prin gravare.

* Lentila inferioara plasata spre portobiect se numeste lentila frontala , iar distanta dintre lentila frontala si preparat se numeste distanta frontala.

Distanta focala a obiectivului este invers proportionala cu puuterea lui de marire (de ex. Pentru obiectivul de 10x, distanta focala este de 16mm).

Obiectivele difera intre ele atat dupa puterea de marire (P ob.) dar si dupa modul de intrebuintare.

Microscopul ML4 este dotat cu:

- obiective uscate cu putere de marire 6x, 10x, 20x si 40x (spatiul dintre lentila frontala si preparat este ocupat de aer); ele sunt asezate in functie de marime si se pot roti in directia acelor de ceasornic.

- obiective umede (obiectiv cu imersie) cu putere de marire de 90x, ce permite interpunerea intre lentila frontala si preparat a unui lichid cu indice de refractie egal sau apropiat cu cel al sticlei (ulei de cedru).

2. Sistemul Ocular

Microscopul fotonic ML4 prezinta doua oculare, fiecare fiind format din doua lentile convergente montate intr-un tub metalic scurt (innegrit in interior pentru a evita reflexia luminii), care se introduce la extremitatea superioara a tubului microscopului.

Fiecare ocular se caracterizeaza printr-o putere de marire, iar microscopul ML4 este prevazut cu oculare care maresc de 5x, 7x, 10x si 15x.

Puterea de marire a ocularelor (P oc.) este gravata pe acestea.

Puterea de marire a microscopului este egala cu: P ob. x P oc.

De ex.: obiectivul de 10x si ocularul fiind de 7x rezulta :

P microscopului = 10 x 7 = 70x

Tehnica de lucru la microscopul fotonic ML4

Transformatorul se conecteaza la reteaua de 220V si apoi se stabileste legatura intre sursa de lumina (becul) a microscopului si priza proprie a transformatorului.

Prin rotirea revolverului se aduce obiectivul de 10x in axul optic al microscopului.

Se stabileste distanta interoculara in functie de distanta interpupilara a examinatorului.

Privind prin oculare, se controleaza iluminarea campului microscopic. Intensitatea luminii se corecteaza prin ridicarea sau coborarea condensatorului, in functie de puterea de marire a obiectivului.

Se aseaza lama portobiect cu lamela in sus pe fata superioara a platinei, fixand-o cu ajutorul valetilor. Se centreaza apoi preparatul in axul optic al microscopului.

Privind lateral, cu ajutorul vizei macrometrice se coboara tubul pana la o distanta mai mica decat distanta focala a obiectivului cu care examinam preparatul (distanta focala pentru obiectivul de 10x este de 16mm).

Punerea la punct a imaginii: privind prin oculare se ridica incet tubul cu ajutorul vizei macrometrice pana apare imaginea clara in campul microscopic. Apoi se corecteaza claritatea imaginii cu ajutorul vizei micrometrice.

Daca nu apare nici o imagine inseamna ca:

obiectivul nu se afla in axul optic

preparatul nu se afla in campul microscopic

s-a ridicat prea repede tubul microscopului.

Tot timpul studiului la microscop se tine mana in permanenta pe viza micrometrica, cu care se fac scurte miscari de rotire inainte si inapoi pentru a adapta in permanenta ochiul examinatorului, deoarece preparatul nu are aceeasi grosime pe toata suprafata sa.

Cu ajutorul celor doua vize laterale ale platinei se va misca lama cu preparatul in directie anteroposterioara si de lateralitate, in vederea examinarii lui in totalitate.

Trecerea la obiective cu putere de marire crescuta

Se face pentru examinarea de detaliu a preparatului.

Etapele sunt urmatoarele:

se ridica tubul microscopului cu 2-3 cm cu ajutorul macrovizei;

se roteste revolverul pana se aduce in axul optic obiectivul imediat superior ca putere de marire;

se coboara noul obiectiv cu ajutorul macrovizei pana la o distanta mai mica decat noua distanta focala (2-3mm deasupra preparatului);

privind prin oculare, se ridica condensatorul pana se ilumineaza corespunzator campul microscopic;

se corecteaza claritatea imaginii, folosind vizele micrometrice.

Folosirea obiectivelor cu imersie (90x)

cand este necesara trecerea la obiectivul cu imersie, se face o centrare riguroasa, precisa a zonei de studiat folosind obiectivul 40x, dupa care se scoate din ax obiectivul respectiv;

se pune o picatura de ulei de cedru pe lama in dreptul axului optic;

se ridica condensatorul in pozitia sa superioara maxima si apoi se aduce obiectivul cu imersie in ax;

se apropie acest obiectiv de preparat si se priveste din pozitie laterala pentru a verifica distanta frontala care este de cateva fractiuni de mm; coboram pana cand lentila frontala a obiectivului intra in contact cu uleiul de cedru, disparand spatiul de aer dintre obiectiv si portobiect;

se fixeaza claritatea imaginii privind prin ocular si folosind viza micrometrica.

Obiectivele cu imersie necesita o manipulare foarte atenta, in special in momentul coborarii tubului cu ajutorul macrovizei, deoarece exista riscul spargerii lamei portobiect si deteriorarea lentilei frontale.

Intretinerea si pastrarea microscopului:

pentru buna functionare a microscopului este necesara pastrarea lui in husa de plastic;

partile metalice se curata periodic cu o bucata de panza moale, iar obiectivele cu tifon inmuiat in solventi organici.

Dupa terminarea folosirii microscopului se fac urmatoarele operatiuni:

se ridica tubul microscopului;

se scoate lama de pe platina;

se aduce obiectivul de 10x in axul optic;

se coboara condensatorul;

se decupleaza sursa de lumina a microscopului de la transformator, iar acesta de la reteaua de 220V;

microscopul se acopera cu husa.

Se recomanda sa nu se atinga cu mana nici una dintre partile optice ale aparatului.     

Asa nu !

Alte tipuri de microscoape utilizate pentru studiul tesuturilor

I. Microscopul cu fluorescenta

Microscopia prin fluorescenta pune in evidenta fenomene luminoase care iau nastere in structuri biologice primare (naturale), sau a celor secundare, provocate cu ajutorul substantelor numite fluorocromi.

Metoda se bazeaza pe proprietatea unor substante care, iradiate cu un fascicol de lumina cu o lungime de unda mica si cu frecventa inalta emit radiatii cu o lungime de unda mare si o frecventa mai joasa, deci de culoare diferita. Aceste substante se numesc fluorescente.

Fluorescenta este conditionata (Mayer) de prezenta unor grupari fluorocrome cum ar fi: azin, oxazin, etc.

In practica curenta, prin fluorescenta se intelege emiterea de radiatii luminoase de catre o substanta supusa actiunii razelor ultraviolete (300 - 400 milimicroni). Se formeaza o imagine vizibila, colorata, care poate fi observata cu ochiul protejat de un filtru pentru radiatiile ultraviolete sau care impresioneaza placa fotografica.

Emisia spectrului de fluorescenta se prezinta sub forma de benzi (linii Stokes) si nu este un spectru continuu, fiind in functie de marimea moleculei. Fenomenul poate fi observat in orice stare de agregare a substantei, fiind mai intens la lichide si solide.

Fluorescenta unui preparat microscopic poate fi clasificata in doua categorii:

Fluorescenta primara, naturala sau autofluorescenta - produsa de substante care se gasesc in mod natural in celule sau tesuturi (lipofuscina, cromolipidele, fenilalanina, tirozina, adrenalina, noradrenalina etc.).

Fluorescenta secundara sau provocata - indusa prin tratarea sectiunilor de tesut cu fluorocromi (ex: acridin - orange); prin aceasta metoda se pot detecta acizii nucleici, fibrele de colagen, reticulina si elastice, mucinele, etc.

Tehnica de lucru

Dupa montarea dispozitivelor mentionate, se porneste lampa H.B.O. si se aseaza pe platina microscopului preparatul de examinat aplicat pe o lama portobiect nefluorescenta;

Pentru gasirea campului microscopic si punerea la punct a imaginii se procedeaza la fel caain tehnica de lucru in microscopia fotonica.

Dupa examinare se intrerupe alimentarea de la retea a lampii H.B.O.

ATENTIE - este interzis a privi radiatiile produse de lampa H.B.O. fara ochelari de protectie U.V.; este interzisa manipularea carcasei in timpul functionarii lampii sau imediat dupa stingerea ei inainte de racire, deoarece exista pericol de implozie.

Aplicatii practice

Microscopia in lumina fluorescenta reprezinta o metoda cu o larga aplicabilitate in biologia celulara.

Cu ajutorul fluorescentei primare pot fi identificati:

a.       pigmentii: porfirinele (fluorescenta rosie), lipocromii sau pigmentii carotenoizi (fluorescenta verde), cromolipidele (fluorescenta galben-verde), lipofuscina (fluorescenta rosu-brun);

b.      acizii aminati: fenilalanina, tirozina, triptofanul (fluorescenta albastra);

c.       unele virusuri si bacilul Koch emit o fluorescenta verde stralucitor

d.      dintele natural este autofluorescent, proprietate prin care se deosebeste de cel artificial;

e.       aminele biogene: adrenalina, noradrenalina, serotonina (fluorescenta verde).

Cu ajutorul fluorocromarii (fluorescenta secundara) cu acridin-orange se pot identifica:

a.       acizii nucleici: ARN-ul (fluorescenta rosie), AND-ul (fluorescenta verde-galben);

b.      fibrele de colagen, elastice si reticulina - fluorescenta verde;

c.       nucleii leucocitelor au o fluorescenta verde, iar citoplasma lor si eritrocitele raman opace;

d.      mucinele - fluorescenta verde.

Coloratia cu acridin-orange se mai utilizeaza in citodiagnosticul precoce al cancerului (studiul acizilor nucleici in conditiile unui proces tumoral).

Cea mai importanta aplicatie este imunofluorescenta, care se bazeaza pe cuplarea unui anticorp cu un fluorocrom; prin fluorescenta indusa poate fi identificata localizarea antigenelor in celule.

Microscopia prin fluorescenta se deosebeste de microscopia cu raze ultraviolete a carui principiu de functionare se bazeaza pe absorbtia luminii ultraviolete de catre moleculele preparatului.

Microscopia in ultraviolet este asemanatoare spectrofotometriei, dar rezultatele sunt inregistrate fotografic. Razele ultraviolete trec prin lentile speciale si prin sectiunea preparatului de examinat dand, datorita unui fond diferit de absorbtie, o imagine invizibila pentru ochi, dar care este inregistrata pe placa fotografica.

Metoda este utilizata pentru detectarea acizilor nucleici, a bazelor purinice si pirimidinice ale nucleotidelor ca si la detectarea proteinelor ce contin anumiti aminoacizi.

Gruparile -CH, -OCH₃, -CH₃, -CN, maresc intensitatea fluorescentei, altele ca: -CO, -COO, -NO₂, o slabesc, ceea ce reduce gama preparatelor care pot fi vizualizate printr-o astfel de tehnica.

Prin metodele de preparare a sectiunilor se pot elimina astfel de inconveniente, largind astfel posibilitatea de utilizare a microscopiei prin fluorescenta.

II. Microscopul in contrast de faza

Microscopia in contrast de faza utilizeaza un tip special de microscop fotonic ce realizeaza contrastul unor obiecte de examinat, permitand astfel studiul celulelor in stare vie, nefixate si necolorate.

Aparatul pentru contrast de faza este un microscop obisnuit, cu urmatoarele particularitati:

condensatorul are un diafragm inelar (un inel transparent intr-un disc opac);

in obiectiv se gaseste o placa sau inel de faza care are rolul de a modifica transmisia unei parti din razele luminoase care formeaza imaginea campului microscopic (este un proces de defazare intre razele luminoase care sunt transmise direct si cele care sunt difractate de preparat).

Aceste doua particularitati permit modificarea sistemului optic, adica transforma diferentele de faza invizibile pentru ochi in diferente de amplitudine care maresc contrastul elementelor preparatului.

Aplicatii practice

Microscopia in contrast de faza permite:

studiul celulelor in stare vie (celule nefixate si necolorate);

scoate in evidenta unele detalii de structura care nu se pot observa la microscopul fotonic obisnuit ca endocitoza, miscarea cililor si flagelilor, diviziunea celulara etc.

studiaza reactiile celulare la diferiti agenti fizici sau chimici;

studiaza benzile cromozomilor.

III. Microscopul cu lumina polarizata

Prin aceasta tehnica se obtin imagini ale unor constituenti in care structurile examinate sunt anizotrope, acestea facand ca viteza de propagare a luminii polarizate sa varieze cu directia de propagare; mediile respective se numesc birefringente.

Birefringenta se poate clasifica:

a. in structurile fibrilare (colagen, mielina, fibrele musculare striate, etc.) poate exista o birefrigenta pozitiva cand indicele de refractie este mai ridicat in lungime decat in plan perpendicular si refrigenta negativa in caz contrar (fibrele nucleoproteice).

b.birefrigenta cristalina sau intrinseca observata in sistemele sau moleculele in care ionii prezinta un aranjament asimetric regulat si este independenta de indicele de refractie a mediului de montare; se observa in structuri constituite din proteine sau lipide;

c. birefrigenta de forma sau structura apare atunci cand particulele submicroscopice sunt orientate regulat intr-un mediu cu indice de refractie diferit;

d.birefrigenta de tensiune se observa la structurile izotope care sunt supuse unei constrangeri mecanice si se intalneste la nivelul muschilor si in tesuturile embrionare;

e. dicroismul apare in momentul in care absorbtia unei lungimi de unda data de lumina polarizata variaza in functie de orientarea obiectului examinat. Aceste variatii apar datorita diferentelor de intensitate (amplitudinea luminii transmise de obiect). Unii coloranti organici ca rosul de Congo, pot induce dicroismul in unele structuri biologice datorita unei orientari preferentiale a moleculelor.