"STRESUL OXIDATIV SI APOPTOZA INDUSE DE MANGAN (II) - IN VIVO SI IN VITRO"

"STRESUL OXIDATIV SI APOPTOZA INDUSE DE MANGAN (II) - IN VIVO SI IN VITRO"

Manganul este un element mineral esential nutritional, dar este si potential toxic. Denumirea deriva din cuvantul grecesc corespunzator cuvantului "magic" si ramane adecvata deoarece oamenii de stiinta lucreaza inca la intelegerea diverselor efecte ale deficientei si toxicitatii manganului in organismele vii. Concentratiile ridicate de mangan in apele de suprafata sunt toxice si apar in zonele impadurite cu conifere, unde are loc mobilizarea manganului din solurile acide. Manganul este larg raspandit in scoarta pamantului, sub forma de oxizi, carbonati si silicati, considerat al doisprezecelea element si al cincilea metal ca abundenta. Acesta, desi se gaseste in organisme in cantitati extrem de mici, este esential pentru metabolismul tuturor vietuitoarelor. Manganul, fierul si zincul sunt micronutrienti esentiali pentru plantele si animalele din sistemele acvatice. Concentratia manganului este foarte mare in sedimentele de pe fundul lacurilor , marilor si oceanelor, de unde poate eliberat prin acidifierea apelor rezultata in urma poluarii artificiale, sub forma ionului Mn²⁺.   

Fara indoiala, in doze mari este toxic, determinand o serie de patologii, care au la baza generarea de radicali liberi ai oxigenului (ROS). Radicalul liber primar in sistemele biologice aerobe este radicalul superoxid, care este in echilibru cu forma sa protonata radicalul hidroperoxil. Sursele majore ale acestor radicali provin din lantul transportor al mitocondriei si din reticulul endoplasmic. Desi anionul superoxid este relativ nereactiv in comparatie cu alti multi radicali, sistemele biologice il convertesc in specii mult mai reactive, cum ar fi: radicalii peroxil, alcoxil si hidroxil.

Productia anormala de ROS poate duce la dereglari in homeostazia redox, cunoscuta ca stress oxidativ. Din fericire, celulele au mecanisme antioxidante proprii de aparare pentru a neutraliza nivelele crescute de ROS, prin intermediul compusilor antioxidanti ca vitaminele C si E, glutation (GSH), ubiquinona si enzime antioxidante: glutation peroxidaza, superoxid dismutaza si catalaza. Lezarea oxidativa intervine cand ROS celulare depasesc capacitatea antioxidanta. Consecintele pe termen lung ale stresului oxidativ au fost asociate cu patogeneza multor maladii si toxicitati, incluzand ateroscleroza, diabetul, maladiile inflamatorii cronice, tulburari neurologice si maladii cardiovasculare.

Mn induce stresul oxidativ intr-o maniera dependenta de timp si concentratie, conform masuratorilor parametrilor citotoxici, lactat dehidrogenazei si peroxidarii lipidelor. Cresterea toxicitatii a fost asociata cu reducerea glutationului la nivel mitocondrial, tripeptida abundenta cu proprietati antioxidante si stimularea expresiei genice a proteinelor de soc termic heat shock 27 (hsp 27 ) si heat shock 70 (hsp 70 ), atat la nivel tisular cat si la nivel celular.

Manganul se poate acumula si cauza citotoxicitate si distrugerea celulei. Dupa alterarea activitatii diferitelor enzime si nivelelor de expresie a genelor, distrugerea intracelulara indusa de Mn include ruperea catenelor ADN, distrugerea cromosomilor, si peroxidarea lipidica. Mecanismul complicat al citotoxicitatii acestui metal greu nu a fost inca bine stabilita, dar sunt dovezi ca generarea de ROS si cresterea stresului oxidativ joaca un rol cheie. Pentru a preveni distrugerea celulara indusa de agentii toxici, celulele raspund apeland la diverse cai de semnalizare si la stimularea expresiei genelor ce codifica factori de trascriptie sensibili la stress, proteine ca metaloproteinele si enzimele antioxidante.

Culturile primare de hepatocite sunt considerate sisteme in vitro importante pentru studiul functiei hepatice ca raspuns la diferiti inductori. Ele au aplicatii variate in toxicologie, in screeningul compusilor citotoxici si genotoxici si evaluarea agentilor chemoprotectori precum si in determinarea leziunilor caracteristice celulei hepatice si a mecanismelor biochimice asociate, induse de compusii toxici.

In vivo, este dificil sa se distinga intre efectele primare ale unui compus de cele induse secundar deoarece functiile ficatului se gasesc sub influenta diferitilor factori endogeni si exogeni care interactioneaza cu alte organe. Datorita inconvenientelor asociate studiilor in vivo de hepatotoxicitate indusa de agenti chimici, sistemele in vitro reprezinta o abordare experimentala mai buna pentru evaluarea potentialului compusilor hepatotoxici si investigarea mecanismelor prin care acestia induc leziuni hepatice.

In concentratii mici, manganul prezinta un efect protector prin reducerea radicalilor ^.OH, producand Mn(OH)²⁺. De asemenea cationului Mn²⁺ poate lega coordinativ aminoacizi, mentinand si prin aceasta cale homostazia speciilor reactive. In concentratii mari, manganul se acumuleaza in principal la nivel mitocondrial, producand grave dereglari ale metabolismului normal: inhibarea oxidarii succinatului, inhibarea NADH dehidrogenazei si a NADH citocrom c reductazei

Studiul de fata se bazeaza pe ipotezele conform carora manganul, in anumite concentratii are capacitatea de a induce stres oxidativ la nivel celular, prin modificari ale echilibrului redox mitocondrial si ulterior apoptoza ca o consecinta a prelungirii intervalului de expunere a organismului la actiunea citotoxica a manganului.

Obiectivele studiului de fata sunt reprezentate de elaborare a doua modele experimentale, in vivo si in vitro in vederea punerii in evidenta a inducerii stresului oxidativ la nivel tisular si celular prin urmarirea modificarilor profilului principalelor enzime implicate in protectia organismului, existente la nivelul tesuturilor (hepatic, renal, intestinal si branhial) intoxicate cu 75 g / l Mn²⁺ (in cazul intoxicatiei cronice la Carassius auratus auratus ), 0,5 mg / l Mn²⁺ (in cazul intoxicatiei cronice la Carassius auratus gibelio) si cu 5 mM Mn²⁺, in cazul liniei celulare Huh7.

Un al doilea obiectiv este acela de caracterizare a mecanismelor celulare si moleculare care stau la baza inducerii unui proces apoptotic consecutiv inducerii la nivel tisular, respectiv celular a unui intens stres oxidativ ca efect al tratamentului cu mangan.

Mecanismele celulare si moleculare ale tratamentului cu mangan vor fi analizate in vivo .pe loturi de Carassius auratus auratus si Carassius auratus gibelio, pe o serie de tesuturi cu importanta in procesele de detoxifiere a organismului si pe linia celulara Huh7, linie provenind din hepatocarcinom uman.

Procesul de bioacumulare a manganului va fi urmarit prin determinari de spectrometrie de absorbtie atomica, urmand ca modificarile morfologice si ultrastructurale ale celulelor hepatice si renale sa fie urmarite utilizand metode de microscopie optica si electronica.

Studiul de fata isi propune punerea in evidenta a anumitor markeri apoptotici care sustin ideea inducerii apoptozei dependenta de mitocondrie atat la nivelul tesutului hepatic si renal cat si la nivelul celulelor Huh7.

Principalii markeri apoptotici urmariti vor fi:

     evidentierea eliberarii citocromului c si a factorului inductor al apoptozei (AIF) de la nivel mitocondrial

     evidentierea procesului de externalizare a fosfatidil serinei pe fata externa a membranei plasmatice

     punerea in evidenta a procesului de fragmentare ADN

Ø          Stabilirea mecanismelor moleculare de protectie a celulelor hepatice, la actiunea manganului vor fi evaluate folosind tehnici de biologie moleculara (Real Time RT PCR), de monitorizare a nivelului de expresie genica pentru genele de interes.

Ø          Stabilirea unor corelatii intre mecanismele biochimice si moleculare care stau la baza proceselor de protectie a celulelor impotriva stresului oxidativ si apoptozei induse de tratamentul cu metale grele, reprezinta obiectivul principal al lucrarii de fata.

In vederea evidentierii modificarilor biochimice si moleculare, induse de mangan la nivel tisular si celular, am realizat doua modele experimentale:

I - model experimental in vivo folosind indivizi de Carassius auratus gibelio si Carassius auratus auratus

II - model experimental in vitro folosind linia celulara stabilizata derivata din carcinom hepatic uman - linia celulara Huh7

Teza de doctorat este structurata in doua parti si 5 capitole, la care se adauga Concluzii, si Bibliografie.

Partea I - Aspecte     teoretice

Capitolul I Manganul-metal greu, cu rol important in organismele vii realizeaza o actualizare a datelor din literatura stiintifica referitoare la: raspandire si proprietati, rolul manganului in celule, poluarea cu mangan si toxicitate

Capitolul II - "Stresul oxidativ si sistemul de aparare al celulelor impotriva acestuia" trece in revista chimia radicalilor liberi ai oxigenului, sursele biologice de radicali liberi sistemele de aparare impotriva stresului oxidativ.

Capitolul III - "Apoptoza si metalele grele" trateaza succint caile generale de semnalizare in apoptoza, efectele unor ioni ai metalelor grele asupra apoptozei si relatia dintre apoptoza si stresul oxidativ indus de metalele grele.

Capitolul IV - "Proteinele de soc termic si rolul lor in stresul celular" trateaza urmatoarele aspecte: .

PARTEA a II-a - Capitolul V "Cercetari personale" este structurata in doua subcapitole Materiale si Metode si Rezultate si discutii.

Ø          Studiul de fata ofera rezultate concludente care sustin ideea conform careia tratamentul cu 75 g / l Mn²⁺ (in cazul intoxicatiei cronice la Carassius auratus auratus ), 0,5 mg / l Mn²⁺ (in cazul intoxicatiei cronice la Carassius auratus gibelio) si cu 5 mM Mn²⁺, in cazul liniei celulare Huh7, induce un proces apoptotic consecutiv inducerii la nivel tisular, respectiv celular a unui intens stres oxidativ, care reprezinta mecanismul de baza a inducerii apoptozei ca efect citotoxic sub actiunea manganului

Ø          In urma determinarilor, prin spectrometrie de absorbtie atomica a concentratiei de mangan in apa folosita ca mediu de tratament, s-a observat diminuarea concentratiei manganului ca rezultat al ingerarii si acumularii la nivelul tesuturilor tinta.

Ø          Modificarile morfologice si ultrastructurale ale celulelor hepatice si renale demonstreaza aparitia efectelor nocive ale tratamentului cu mangan, efecte direct proportionale cu intervalul de expunere al organismului la actiunea citotoxica a manganului.

Ø          Modificarea profilelor principalelor enzime implicate in protectia organismului impotriva stresului oxidativ, existente la nivelul tesuturilor (hepatic, renal, intestinal si branhial) vin in sprijinul afirmatiei conform careia atat intoxicatia acuta cat si cea cronica la C. auratus, induc un puternic stres oxidativ tisular asociat modificarilor redox mitocondriale

Ø          Principalul efect al dezechilibrului mitocondrial a fost eliberarea GSH de la nivel mitocondrial datorita modificarii permeabilitatii membranei mitocondriale sau ca urmare a intenselor procese de oxidare a acestuia, toate acestea conducand spre apoptoza.

Pe baza rezultatelor prezentate in cadrul acestui studiu putem preciza principalele efecte pe care manganul le are la nivel tisular consecutiv expunerii la mangan a loturilor de C. auratus:

         aparitia procesului de bioacumulare a manganului la nivel hepatic, rezultate demonstrate de scaderea concentratiei de mangan din apa, direct proportional cu intervalul de expunere; rezultatele obtinute sunt in concordanta cu cele descrise de Al-Yousuf in 2000. in ceea ce priveste procesul de bioacumulare;

         consecinta acumularii manganului la nivel mitocondrial poate fi stimularea sau inhibarea activitatii anumitor enzime, dintre acestea activitatea SOD creste semnificativ atat in cazul intoxicatiei cronice, cat si in cazul intoxicatiei acute cu mangan la C. auratus    si dupa 7 zile de expunere apar noi izoforme ale Cu / Zn SOD, care pot fi utilizate ca biomarkeri ai poluarii mediului cat si o intensificare a activitatii MnSOD, posibil datorita inducerii unei sinteze crescute a acestei enzime;

         ca o consecinta a modificarii echilibrului redox celular are loc scaderea potentialului membranar mitocondrial proces asociat cu diminuarea nivelului de GSH la acest nivel;

         aparitia modificarilor membranare, morfologice si ultrastructurale au fost puse in evidenta ca o consecinta a tratamentului cu mangan, modificari direct proportionale cu intervalul de expunere;

         modificarile ultrastructurale mitocondriale reprezentate de aparitia mitocondriilor tubulare, dezorganizarea cristelor mitocondriale, ruperea membranei mitocondriale, aparitia de corpi electrono densi si tendinta de agregare a acestora perinuclear, demonstreaza aparitia unui proces apoptotic la nivelul tesutului hepatic intoxicat acut cu mangan timp de 7 zile;

         aparitia apoptozei la nivelul tesutului hepatic este sustinuta si de punerea in evidenta a unui intens proces de fragmentare ADN, ca marker al unei apoptoze tarzii;

         procesul de fragmentare ADN nu apare numai la nivel hepatic, efecte similare fiind observate si la nivelul tesutului renal, ceea ce dovedeste aparitia unor efecte citotoxice extinse ale manganului la nivelul principalelor tesuturi implicate in procesele de detoxifiere;

         modificarea integritatii ADN stimuleaza inducerea sau activarea proteinei p 53, la nivel hepatic, proces evidentiat imunohistochimic dupa 7 zile de intoxicatie acuta cu mangan;

Rezultatele mentionate sprijina afirmatia conform careia toxicitatea indusa de mangan la nivelul tesutului hepatic si renal se bazeaza pe inducerea unui intens stres oxidativ a carui consecinta principala o repezinta alterarea functiilo si morfologiei mitocondriale, ceea ce conduce la aparitia unui proces apoptotic dependent atat de mitocondrie cat si de proteina p53.

Studiul de fata a reusit sa puna in evidenta aparitia anumitor markeri apoptotici care sustin ideea inducerii apoptozei dependenta de mitocondrie la nivelul liniei celulare Huh7.

Principalii markeri apoptotici evidentiati in urma tratamentului cu magan a celulelor Huh7 au fost:

         evidentierea eliberarii citocromului c de la nivel mitocondrial, proces direct proportional cu intervalul de tratament precum si procesul de externalizare a fosfatidil serinei la nivelul membranei plasmatice;

         asociat eliberarii citocromului c s-a evidentiat si procesul de eliberarea a factorului inductor al apoptozei (AIF), proces care poate fi corelat cu aparitia in faze tarzii ale apoptozei cu procesul de fragmentare ADN;

         evidentierea acestor markeri mitocondriali sustin ideea conform careia manganul induce apoptoza dependenta de mitocondrie la nivelul liniei celulare Huh7;

         rezultatele obtinute prin studiul enzimelor implicate in stresul oxidativ si al nivelului de glutation existent atat la nivel mitocondrial cat si la nivelul lizatului celular total demonstreaza aparitia stresului oxidativ la nivelul celulelor hepatice, ca o consecinta a efectelor citotoxice ale manganului;

         pe baza rezultatelor obtinute studiul de fata sustine ideea conform careia apoptoza indusa de magan este consecinta scaderii nivelului de glutation mitocondrial, care determina aparitia dezechilibrului redox la acest nivel, eveniment care precede cascada de reactii declansatoare ale apoptozei;

o           Atat studiul in vitro cat si studiul in vivo indica faptul ca apoptoza indusa de stresul oxidativ, mediat de mangan, este un proces dependent de transcriptie. Acest lucru a fost evidentiat prin studiul modificarilor nivelului de expresie genica a doua proteine de soc termic, Hsp 27 / 30 si Hsp 70 1B / 70, proteine implicate atat in stresul oxidativ cat si in apoptoza.

o           Rezultatele obtinute sustin ideea conform careia tratamentul cu mangan este un puternic inductor al expresiei genice a doua proteine, expresie genica a carei modificare nu poate fi regasita in nivelul de expresie proteica, datorita multiplelor procesari posttrasnlationale.

o           Modificarea nivelului transcriptional al acestor gene poate reprezenta un mecanism de protectie al celulelor hepatice, la actiunea manganului in vederea neutralizarii efectelor nocive induse de acesta.

o           Toate rezultatele obtinute confirma ideea conform careia inducerea efectelor nocive ale manganului atat la nivel tisular cat si celular, este un proces multifactorial, a carui mecanism cheie este situat la nivel mitocondria.