Determinarea numarului de escherichia coli din ape

LABORATOR CONTROL CALITATE APA

PROCEDURA SPECIFICA

DETERMINAREA NUMARULUI DE ESCHERICHIA COLI DIN APE

COD: PSL-06-03

Avertisment: documentul este proprietatea Laboratorului Control Calitate Apa, S.C. AQUATIM SA. Reproducerea si

difuzarea documentului sunt in exclusivitate dreptul societatii. Copiile sunt numerotate si controlate.

INDICATORUL APROBARILOR SI REVIZIILOR

1. SCOP

Prezenta procedura stabileste modul de organizare si desfasurare a activitatii de detectare si enumerare a bacteriei Escherichia coli prezenta in apa, in vederea asigurarii si confirmarii capabilitatii tehnico-organizatorice a laboratorului de a satisface cerintele impuse de standardele de metoda si de calitate in vigoare.

2. DOMENIUL DE APLICARE

Procedura se aplica tuturor tipurilor de apa destinata consumului uman, precum si a altor tipuri de ape cu continut scazut de materii in suspensie, care vor fi incercate microbiologic, de catre personalul laboratorului Control Calitate Apa al S.C. AQUATIM S.A

In functie de scopul urmarit, determinarea numarului de Escherichia coli se poate face pentru:

probe nediluate de apa dezinfectate sau imbuteliate, cu un continut probabil mic sau chiar lipsite de microoroganisme;

dilutii ale probelor de apa nedezinfectate, cu un continut necunoscut de microorganisme.

3.DOCUMENTE DE REFERINTA SI CONEXE

3.1.Documente de referinta

MCL-01    Manualul Calitatii;

PGL-01 Ghid pentru elaborarea procedurilor;

PGL-03 Analiza cererilor, ofertelor si contractelor;

PGL-16 Echipamente;

PGL-17 Trasabilitate masurarii;

PGL-18 Prelevarea;

PGL-19 Manipularea obiectelor de incercare;

PGL-20 Asigurarea calitatii rezultatelor;

PGL-21 Raportarea rezultatelor;

PGL-22 Estimarea incertitudinii de masurare;

POL-01 Gestionarea materialelor de referinta.

POL-MB-01 Pregatirea, sterilizarea si pastrarea resurselor materiale utilizate in incercarile

microbiologice;

POL-MB-02 Manipularea, decontaminarea si eliminarea deseurilor microbiologice;

POL-MB-03 Controlul intern al calitatii materialelor utilizate in incercarile microbiologice;

POL-MB-04 Igienizarea in laboratorul de incercari microbiologice si controlul ei.

ILL-01    Instructiune de lucru balanta analitica AW 220 Shimadzu

ILL-MB-01    Instructiune de lucru autoclav HMC;

ILL-MB-02    Instructiune de lucru autoclav Systec;

ILL-MB-04    Instructiune de lucru baie de apa GFL

ILL-MB-05    Instructiune de lucru bec de gaz Integra, Fireboy;

ILL-MB-06    Instructiune de lucru bec de gaz WLD-TEC, Gasprofi 1;

ILL-MB-07    Instructiune de lucru bidistilator Fistreem Cyclon;

ILL-MB-08    Instructiune de lucru etuva Memmert;

ILL-MB-11    Instructiune de lucru hota cu flux de aer laminar vertical Heto Holten;

ILL-MB-13    Instructiune de lucru masina automata de spalat sticlarie de laborator;

ILL-MB-16    Instructiune de lucru numarator de colonii electronic aCOLyte;

ILL-MB-17    Instructiune de lucru pH-metru WTW VARIO;

ILL-MB Instructiune de lucru pH-metru WTW 340 i;

ILL-MB-19    Instructiune de lucru refrigerator Sanyo, MPR 311 D;

ILL-MB-22    Instructiune de lucru incubator Memmert, BE 500;

ILL-MB-25    Instructiune de lucru incubator Sanyo Gallenkamp;

ILL-MB-26    Instructiune de lucru plita electrica cu agitare VELP;

ILL-MB-27    Instructiune de lucru baie de apa Memmert;

ILL-MB-28    Instructiune de lucru hota cu flux de aer laminar vertical Faster;

ILL-MB-29    Instructiune de lucru refrigerator Sanyo, MPR 514.

3.2.Documente conexe

4.DEFINITII SI ABREVIERI

4.1.Definitii

Pentru necesitatile prezentei proceduri se folosesc termenii definiti in MCL si termenii:

Escherichia coli bacterie din grupul bacteriilor coliforme, rezistenta la saruri biliare, care produce indol din triptofan la (44 0.5) ⁰C in (21 3) ore;

colonie: aglomerare de bacterii care se dezvolta dintr-o singura celula sau grup de celule de acelasi fel (unitate formatoare de colonie) si este vizibila cu ochiul liber pe suprafata mediului de cultura solid;

mediul de cultura solutie care asigura nutrientii si conditiile fizico-chimice necesare cresterii si multiplicarii bacteriilor;

suspensie initiala (dilutie primara): suspensie (solutie) obtinuta dupa ce un volum masurat din proba de analizat a fost amestecat cu de noua ori cantitatea de diluant.

dilutii decimale: suspensii (solutii) obtinute prin amestecarea unui volum masurat din suspensia initiala cu de noua ori volumul de diluant si repetarea acestei operatii cu urmatoarele dilutii pana se obtine o serie de dilutii decimale, corespunzatoare pentru inocularea mediului de cultura.

4.2.Abrevieri

MCL    Manualul calitatii

PGL    Procedura generala a laboratorului

PSL    Procedura specifica de incercare a laboratorului

POL    Procedura operationala a laboratorului

ILL    Instructiune de lucru a laboratorului

SL    Sef laborator

RC    Responsabil calitate

RI    Responsabil incercare

RRL    Responsabil regim

REMC Responsabil echipamente de masura si control

RMAP Responsabil monitorizare apa potabila

RMAR Responsabil monitorizare apa reziduala

CL    Caiet de lucru

RG    Registru laborator

mg    miligrame

g    grame

L litru

ml mililitru

mg/L miligram pe litru

sol. solutie

mm    milimetru

m    micrometru

PP    polipropilena

UV    radiatie ultravioleta

EMC    echipament de masura si control

EIP    echipament individual de protectie

E.coli    Escherichia coli

TSA    Agar - Soia - Triptona

TBA     Agar- Triptona -Saruri biliare

UFC    unitate formatoare de colonie

5.DESCRIEREA ACTIVITATII

5.1.Principiul metodei

Principiul acestei metode este bazat pe concentrarea bacteriei E.coli, din probe relativ mari, pe suprafata unor membrane filtrante, urmata de incubarea acestora pe un mediu de cultura selectiv si diferential. In acest proces microrganismele din proba de incercat sunt retinute pe suprafata filtrului prin efectul de separare al membranei acestuia. Schimbul de produse nutritive si metabolice are loc prin sistemul poros al membrane filtrante.

Un esantion din proba de apa este filtrat printr-o membrana sterila, cu diametrul porilor de 0,45 μm, care retine bacteriile E.coli. Membrana este plasata pe mediul nespecific TSA si incubata la (36 2) ⁰C pentru pentru 4-5 ore, dupa care membrana respectiva este transferata pe mediu cu caseina si saruri biliare (TBA) si incubata la (44,0 0,5) ⁰C pentru 19-20 ore;

Coloniile dezvoltate pe membrana dupa incubare, care sunt capabile sa formeze indol din triptofanul adaugat in mediul agar, sunt numarate ca si colonii de E. coli.

Numarul bacteriilor E.coli prezente se calculeaza din numarul coloniilor dezvoltate pe membrane si confirmate prin testul cu indol si se exprima in 100 ml proba.

5.2.Resurse necesare

5.2.1.Sticlarie si alte materiale consumabile

spatule;

fiole de cantarire cu capac;

cilindri gradati de 100 ml, 500 ml, 1000 ml, clasa A;

pipete gradate de 10 ml clasa A;

containere din inox sau tava cu capac din PP, pentru sterilizare pipete;

balon Griffin sau pompa plastic cu piston;

cutii Petri sterile, de plastic, cu diametrul de 55-60 mm;

baloane cotate de 500 ml, 1000 ml, clasa A;

vas pentru vid (Kitasato), volum 2000 ml;

pahare Berzelius cu volum de 100 ml;

sticle de laborator, transparente, cu dop filetat din PP, volum 100 ml, 250 ml, 500 ml, 1000 ml;

flacon pentru prelevare probe, din PP, cu gat larg, capac filetat din PP, sau sticle prelevare probe, transparente, cu dop slefuit, volum 500 ml, 1000 ml;

palnii din polipropilena PP, autoclavabile, pentru instalatiile de filtrare, cu volum de 100 -300 ml;

pungi speciale pentru sterilizarea palniilor din PP;

pistol dozator pentru apa sau siringi din plastic, cu capatul cu filet, pentru unitati filtrante;

pensa din inox, efilata, pentru ridicarea membranelor de pe sita de filtrare,

unitati filtrante, cu membrana cu diametrul porilor de 0,2 m;

membrane filtrante, din ester mixt de celuloza sau nitrat de celuloza, cu diametrul de 47-50 mm, sterile, impachetate individual, cu diametrul porilor de 0.45 μm, de culoare verde, cu caroiaj negru;

markere permanente pentru sticla si plastic;

rondele de hartie de filtru;

apa;

gaz;

curent electric.

Sticlaria este verificata metrologic, fiind insotita la livrare de certificat de calitate.

Mebranele filtrante utilizate pentru incercarile microbiologice corespund cerintelor tehnice din ISO 7704. Pentru fiecare lot de membrane filtrante luat in lucru, RRL impreuna cu RI face controlul calitatii acestuia, conform procedurii operationale "Controlul intern al calitatii materialelor utilizate in incercarile microbiologice', cod POL-MB-03, cu inregistrarea rezultatelor in "fisa control calitate membrane filtrante', cod FPOMB3-2.

Pentru fiecare lot in lucru, din cutiile Petri de plastic sterile, RI executa controlul sterilitatii acestora conform procedurii operationale "Controlul intern al calitatii materialelor utilizate in incercarile microbiologice', cod POL-MB-03, cu inregistrarea rezultatelor in "fisa control sterilitate cutii unica folosinta', cod FPOMB3-3.

5.2.2. Medii de cultura si reactivi

5.2.2.1. Medii de cultura

Mediile de cultura necesare in incercarea numarului de E. coli din apa sunt:

mediul Agar - Soia - Triptona (TSA);

mediul Agar - Triptona - Saruri biliare (TBA).

5.2.2.1.1. Mediul Agar-Soia-Triptona (TSA) se obtine dintr-un mediu complet deshidratat cu urmatoarea compozitie (g/ L):

peptona din caseina15 g;

peptona din soia.5 g;

clorura de sodiu..5 g;

agar.15 g.

5.2.2.1.2.Mediul de cultura Agar - Triptona - Saruri biliare (TBA) se obtine dintr-un mediu complet, deshidratat cu urmatoarea compozitie (g/ L):

triptona.20.0 g;

saruri biliare..1.5 g;

agar...................15.0 g.

Pentru hidratarea si dizolvarea mediilor deshidratate se utilizeaza apa distilata grad 3, in conformitate cu SR ISO 3696/ 1995, obtinuta conform ILL-MB-07, la bidistilatorul Fistreem, cod EMC MB 07. Calitatea apei distilate este monitorizata prin determinarile fizico-chimice, executate de un laborant chimist si microbiologice, executate de un laborant bacteriolog; inregistrarile monitorizarii se fac de catre executanti in caietul monitorizare parametrii apa bidistilata, cod CL-15-AB.

Mediile de cultura utilizate sunt de calitate analitica recunoscuta. La livrarea acestora, loturile de medii sunt insotite de certificate de calitate si/sau buletine de analiza.

Pentru fiecare lot din mediu de cultura luat in lucru, RRL impreuna cu RI face controlul calitatii acestuia, conform procedurii operationale "Controlul intern al calitatii materialelor utilizate in incercarile microbiologice', cod POL-MB-03, cu inregistrarea rezultatelor in "fisa control calitate medii de cultura', cod FPOMB3-1.

Reactivii

Reactivii utilizati in incercarea numarului de E.coli din apa, pentru executarea dilutiilor de probe, corectarea pH-ului mediului de cultura, pentru neutralizarea agentului dezinfectant sau pentru testele de confirmare sunt:

hidroxid de sodiu, p.a.;

acid clorhidric 1 mol/L;

dihidrogeno-fosfat de potasiu;

clorura de magneziu;

tiosulfat de sodiu pentahidrat;

alcool etilic absolut;

indol, sub forma de solutie de culoare galben deschis, gata preparata si livrata in flacoane brune, cu volumul de 100 ml, cu urmatoarea compozitie:

p-Dimethylaminobenzaldehida..0,5 g

acid clorhidric, c = 1 mol/L100ml

Reactivii utilizati sunt de calitate analitica recunoscuta. La livrarea acestora, loturile de reactivi sunt insotite de certificate de calitate si/sau buletine de analiza.

Solutiile preparate se pastreaza in sticle de laborator, cu dop rodat sau cu filet si sunt etichetate; etichetele contin:

scopul utilizarii;

denumirea solutiei;

concentratia solutiei;

data prepararii solutiei;

termen de valabilitate (daca este cazul).

5.2.3.Echipamente

Autoclav HMC, tip HV-L 50, serie , cod EMC MB 01, ILL-MB-01, amplasat in camera preparare medii (E 06).

Balanta Sartorius, tip BP 310P, serie 81107857, cod EMC MB 03, ILL-MB-03, amplasata in camera balantelor. Verificarea metrologica a balantei se face anual Verificarea si etalonarea se face conform programului de etalonari, verificari metrologice si mentenanta, cod FG-16-03, editia 01/revizia 0, intocmit anual de REMC.

Baie de apa Memmert, tip WB 10, serie 13050586, cod EMC MB, ILL-MB-27, amplasata in camera preparare medii (E 06), capabila sa mentina o temperatura de (45 1) ⁰ C. Etalonarea se face conform programului de etalonari, verificari metrologice si mentenanta, cod FG-16-03, editia 01/revizia 0, intocmit anual de REMC.

Baie de apa GFL, tip 1041, serie 104878006, cod EMC MB 04, ILL-MB-04, amplasata in camera preparare medii (E 06).

Plita electrica cu agitare VELP, tip AM 4, serie 162966, cod EMC MB 26, ILL-MB-26, amplasata in camera preparare medii (E 06),

pH-metru WTW (electrod SenTix V), tip VARIO, seria 04390005, cod EMC MB 17, ILL-MB-17, amplasat in camera preparare medii (E 06). Etalonarea se face conform programului de etalonari, verificari metrologice si mentenanta, cod FG-16-03, editia 01/revizia 0, intocmit anual de REMC.

pH-metru WTW, tip 340 i (electrod SenTix 41), serie 06311277 (A062705010), cod EMC MB 18, ILL-MB-18, amplasat in camera preparare medii (E 06). Verificarea si etalonarea se face conform programului de etalonari, verificari metrologice si mentenanta, cod FG-16-03, editia 01/revizia 0, intocmit anual de REMC.

Bidistilator Fistreem Cyclon, serie FI-G040015, cod EMC MB 07, ILL-MB-07, amplasat in camera preparare medii (E 06).

Refrigerator Sanyo, tip MPR 514, serie 08100013, cod EMC MB 29, ILL-MB-29, amplasat in camera de incercari microbiologice (E 05). Etalonarea se face conform programului de etalonari, verificari metrologice si mentenanta, cod FG-16-03, editia 01/revizia 0, intocmit anual de REMC.

Hota cu flux de aer laminar vertical Heto Holten, tip Biosafe 1.2, serie 97263000c, cod EMC MB 11, ILL-MB-11, amplasata Hota cu flux de aer laminar vertical Faste

Hota cu flux de aer laminar vertical Faster, tip BSC EN 1-3, serie 255, cod EMC MB 28, ILL-MB-28, amplasata in camera de incercari microbiologice (E 05).

Instalatie de filtrare microbiologica MBS I, cod EMC MB 09, ILL-MB-09, amplasata in hota cu flux de aer laminar vertical Heto Holten, din camera de incercari microbiologice (E 05).

Instalatie de filtrare microbiologica Sartorius, cod EMC MB 10, ILL-MB-10, amplasata in hota cu flux de aer laminar vertical BSC EN 1-3, din camera de incercari microbiologice (E 05).

Bec de gaz Integra, tip Fireboy, cod EMC MB 05, ILL-MB-05, amplasat in hota cu flux de aer laminar vertical Faster BSC EN 1-3, din camera de incercari microbiologice (E 05).

Bec de gaz WLD-TEC, tip Gasprofi 1, serie 0613686, cod EMC MB 06, ILL-MB-06, amplasat in hota cu flux de aer laminar vertical Heto Holten, din camera de incercari microbiologice (E 05).

Incubator (termostat) Memmert, tip BE 500, serie e5020412, cod EMC MB 22, ILL-MB-22, amplasat in camera termostatelor (E 04), capabil sa mentina temperatura la (362) ⁰ C. Etalonarea se face conform programului de etalonari, verificari metrologice si mentenanta, cod FG-16-03, editia 01/revizia 0, intocmit anual de REMC.

Incubator (termostat) Sanyo Gallenkamp, serie 5695/05/480, cod EMC MB 25, ILL-MB-25, amplasat in camera termostatelor (E 04), capabil sa mentina temperatura la (36 2)⁰C. Etalonarea se face conform programului de etalonari, verificari metrologice si mentenanta, cod FG-16-03, editia 01/revizia 0, intocmit anual de REMC.

Numarator de colonii electronic aCOLyte, serie 3000-188, cod EMC MB 16, ILL-MB-16, amplasat in camera termostatelor (E 04).

Autoclav Systec, tip 3170 ELV, serie 2202039, cod EMC MB 02, ILL-MB-02, amplasat in camera decontaminare (E 03). Etalonarea se face conform programului de etalonari, verificari metrologice si mentenanta, cod FG-16-03, editia 01/revizia 0, intocmit anual de REMC.

Masina automata de spalat sticlarie de laborator SteelCO, tip DS 500, cod EMC MB 13, ILL-MB-13, amplasata in camera decontaminare (E 03).

Etuva Memmert, tip UE 500, serie c 5030183, cod EMC MB 08, ILL-MB-08, amplasata in camera decontaminare (E 03). Etalonarea se face conform programului de etalonari, verificari metrologice si mentenanta, cod FG-16-03, editia 01/revizia 0, intocmit anual de REMC.

Incubator (termostat) Binder BD 53, serie 980513, cod EMC MB 21, ILL-MB-21, amplasat in camera termostatelor (E 04), capabil sa mentina temperatura la (44 0.5)⁰C. Etalonarea se face conform programului de etalonari, verificari metrologice si mentenanta, cod FG-16-03, editia 01/revizia 0, intocmit anual de REMC.

Lampa cu ultraviolete Vilbert Lourmat, cu suport, serie 0515286, cod EMC MB 12, ILL-MB-12 amplasata in camera termostatelor (E 04).

5.2.4.Resurse umane

Responsabilul de regim microbiologie: biolog

Responsabilul de incercare: biolog;

Executant: laborant;

Recoltator probe

Verificarea curenta se face de catre RI si/sau RRL.

Supervizarea se face prin sondaj de catre SL.

5.3. Conditii prealabile

5.3.1. Prelevarea, identificarea, conservarea, manipularea si transportul probelor de apa pentru incercarea de E.coli se face conform procedurii generale de prelevare, cod PGL-18 si a procedurii generale de manipulare a obiectelor de incercare, cod PGL-19, de catre recoltatorii laboratorului.

In cazul solicitarilor de incercari de catre clientii externi, prelevarea probelor poate fi executata de catre acestia. In aceasta situtie laboratorul mentioneaza in raportul de incercare emis faptul ca probele sunt prelevate de solicitanti, acesta neasumandu-si responsabilitatea acestei etape, ci doar asupra rezultatelor obtinute.

Probele de apa pentru incercarile microbiologice se preleveaza in recipiente sterile, cu volumul de 500 ml sau 1000 ml (in functie de numarul incercarilor pentru proba respectiva si de tipul probei), din sticla sau din polipropilena, respectand prescriptile de prelevare a probelor de apa potabila, suprafata sau subterana, descrise in PGL-18. Recipientele cu probele de apa, ce vor fi incercate microbiologic, se vor pastra inchise inainte de umplerea acestora. In momentul recoltarii, se desface cu grija capacul recipientului, evitandu-se atingerea acestuia sau a gatului recipientului. Umplerea recipientelor se face fara clatirea acestora. Imediat dupa recoltarea probei se inchide capacul. Recipientele de probe nu se umplu complet cu apa, lasandu-se un spatiu cu aer, necesar pentru amestecul probei inainte de examinare si pentru prevenirea unei contaminari accidentale.

In cazul probelor de apa tratate, care contin dezinfectanti (halogeni), recipientele pentru recoltare contin un agent reducator al dezinfectantului rezidual din apa (0.1 ml solutie 1.8 % de tiosulfat de sodiu pentru fiecare 100 ml volum proba recoltata), care nu afecteaza viabilitatea si cresterea organismelor cautate. Acesta neutralizeaza agentul dezinfectant, prevenind continuarea actiunii bactericide in timpul transportarii probei.

Recipientele cu probe pentru incercari microbiologice sunt transportate in genti frigorifice, in cel mai scurt timp posibil, la LCCA, unde vor fi incercate imediat dupa receptionarea si esantionarea lor; daca acest lucru nu este posibil, recipientele vor fi pastrate timp de maxim 24 ore de la recoltare, la o temperatura de (5 3) ⁰C, in refrigeratorul Sanyo MPR 514-R, din camera de lucru, cod E 05.

Receptia, inregistrarea si codarea probelor de apa pentru toate incercarile microbiologice, deci si pentru determinarea numarului de E.coli, se realizeaza in camera de receptionare probe apa potabila, cod P 10, de catre RRL sau loctiitorul acestuia. Inregistrarea probelor se face sub semnatura, in registrul evidenta microbiologica probe apa potabila, cod RG-15-EMAP, pastrat in dulapul din biroul de prelucrare date biologie, cod E 17.

Esantionarea probelor pentru incercarile microbiologice, se realizeaza de catre RRL sau loctiitorul acestuia, in camera de lucru, cod E 05. Inregistrarea esationari probelor se face sub semnatura, in registrul evidenta esantionare microbiologica probe apa potabila, cod RG-15-ESMAP, pastrat in dulapul numarul 1 din camera de incercari microbiologice, cod E 05.

5.3.3.Pregatirea materialelor necesare incercarii

5.3.3.1. Pregatirea sticlariei si a altor materiale de laborator

Pregatirea sticlariei si materialelor necesare incercarii bacteriilor coliforme consta in spalarea, uscarea, ambalarea si sterilizarea acestora. Operatia se executa de catre un laborant bacteriolog, conform procedurii operationale "Pregatirea, sterilizarea si pastrarea resurselor materiale utilizate in incercarile microbiologice", cod POL-MB-01.

Sticlaria de lucru se spala si se usuca in masina automata de spalat vesela de laborator Steelco, model DS 500, cod EMC MB 13, conform ILL-MB-13. Sterilizarea materialelor pentru incercarile microbiologice se realizeaza, in functie de natura acestora, cu caldura uscata sau umeda. Inregistrarile proceselor de sterilizare se efectueaza, de catre executant, in caietele de lucru "Caiet inregistrari sterilizare termica umeda - autoclav HV-L 50", cod CL-MB-15-10 si "Caiet inregistrari sterilizare termica uscata - etuva Memmert", cod CL-MB-15-11. Operatia este verificata, sub semnatura de RI si/sau RRL.

Pana la utilizare, toate materialele de laborator (sticlarie, plastic etc.) sterilizate, se protejeaza de praf, pastrandu-se in dulapuri inchise cu usi. Recipientele sterile pentru probele de apa sunt pastrate in camera de preparare medii, cod E 06, in dulapul nr. 1, recipientele pentru ape dezinfectate si in dulapul nr. 2, recipientele pentru ape nedezinfectate, de unde sunt furnizate recoltatorului de catre RI si/sau RRL, in functie de numarul de probe si tipul de probe ce va fi prelevat. Pipetele sterile sunt pastrate, conform POL-MB-01, in camera de preparare medii, cod E 06, in dulapul nr. 2. Palniile din PP sterilizate sunt pastrate in pungile in care au fost autoclavate, in dulapul nr. 3 din camera de preparare medii, cod E 06. Cutiile Petri din plastic, sterile, de unica folosinta sunt pastrate in pungile in care au fost livrate, in dulapul nr. 4 din camera de preparare medii, cod E 06.

5.3.3.2. Pregatirea solutiilor pentru corectarea pH-ului

Solutiile utilizate in corectia pH-ului mediului de cultura si a apei de dilutie sunt: solutia de hidroxid de sodiu (NaOH), concentratie 1 mol/L (40g/ L) si solutia de acid clorhidric, concentratie 1 mol/ L (36,5g/ L).

Prepararea solutiei de NaOH se face prin cantarirea la balanta Sartorius, cod EMC MB 03, conform ILL-MB-03, a unei cantitati de 40 g (sau 20 g pentru o jumatate deportie) granule de NaOH anhidra, care se introduc intr-un balon cotat, clasa A de 1000 ml (respectiv de 500 ml pentru o jumatate de portie); se adauga treptat, pana la semn, apa bidistilata, produsa la bidistilatorul Festreem, cod EMC MB 07, conform ILL-MB-07; se dizolva granulele de NaOH agitandu-se permanent sub jet de apa rece, dizolvarea fiind insotita de o reactie exoterma. Dupa dizolvarea completa, se transfera solutia intr-o sticla de laborator termorezistenta, se acopera cu dopul din PP corespunzator, fara a se infileta complet si se sterilizeaza la in autoclavul HV-L 50, cod EMC MB 01, conform ILL-MB-01. Sticla cu solutia sterilizata de NaOH, se eticheteaza si se pastreaza dupa racire in refrigeratorul Sanyo MPR 514 R, cod EMC MB 29, pentru maxim 6 luni, sau pana la degradarea acesteia (turbiditate, impuritati).

Solutia de HCl, concentratia 1 mol/ L, este primita de laborator ca reactiv, insotit de certificat de calitate si/sau buletine de analiza. Din flaconul cu reactiv se toarna cu grija, evitandu-se prelingerea reactivului pe suprafete, un volum de aproximativ 200 ml, intr-o sticla de laborator termorezistenta, cu dop din PP, cu filet, de 250 ml si se sterilizeaza in la in autoclavul HV-L 50, cod EMC MB 01, conform ILL-MB-01. Sticla cu solutia sterilizata de HCl, se eticheteaza si se pastreaza dupa racire in refrigeratorul Sanyo MPR 514 R, cod EMC MB 29, pentru maxim 6 luni, sau pana la degradarea acesteia (turbiditate, impuritati).

5.3.3.3. Pregatirea solutiei de neutralizare a agentului dezinfectant

Pentru neutralizarea agentului dezinfectant (clorului) din apele potabile tratate, se utilizeaza solutia de tiosulfat de sodiu, cu concentratia de 1,8 %.

Prepararea solutiei se realizeaza de catre R.I., conform procedurii operationale "Pregatirea, sterilizarea si pastrarea resurselor materiale utilizate in incercarile microbiologice", cod POL-MB-01, cu inregistrarea acestora in caietul de preparare medii de cultura si solutii reactivi, cod CL-15-MB-07 si in caietul de inregistrari cantariri balanta, cod CL-15-MB-09. Se cantareste la balanta Sartorius, cod EMC MB 03, conform ILL -MB-03, o cantitate de 28,24 g tiosulfat de sodium pentahidrat, care se toarna intr-un balon cotat de 1000 ml, clasa A si se aduce la semn cu apa distilata; apa se adauga treptat, agitandu-se usor balonul pentru dizolvare.

Pregatirea mediilor de cultura

Prepararea corecta a mediilor de cultura este una din etapele de baza in incercarea microbiologica. Operatia este executata de catre R.I., conform procedurii operationale "Pregatirea, sterilizarea si pastrarea resurselor materiale utilizate in incercarile microbiologice", cod POL-MB-01, cu inregistrarea acestora in caietul de preparare medii de cultura si solutii reactivi, cod CL-15-MB-07 si in caietul de inregistrari cantariri balanta, cod CL-15-MB-09. Cantaririle la balanta se vor face in conformitate cu ILL-MB-03. Responsabilul de regim verifica sub semnatura modul de realizare a acestor activitati.

5.3.3.4.1. Prepararea mediului "Agar-Soia-Triptona"

Se cantareste la balanta Sartorius, cod EMC MB 03, cantitatea corespunzatoare de mediu deshidratat "Agar-Soia-Triptona" (40 g/L) si se toarna cu o palnie pentru pulberi intr-o sticla de laborator termorezistenta, cu dop cu filet din PP, de volum potrivit volumului de mediu ce se doreste a fi obtinut (500 ml, 1000 ml); se adauga progresiv volumul necesar de apa distilata (sau bidistilata), evitandu-se formarea de cocoloase. Apa distilata se prepara la bidistilatorul Festreem, cod EMC MB 07, conform ILL-MB-07, din apa potabila clorinata, dupa neutralizarea prealabila a clorului, prin aplicarea pe conducta de alimentare a unui filtru pentru cloruri (cu carbune activ). Mediul deshidratat este rapid disperat prin agitare si incalzire usoara la plita electrica cu agitare VELP, cod EMC MB 26, conform ILL -MB-26, urmata de dizolvare completa in baia de apa Memmert, cod EMC MB 27, conform ILL-MB-27.

Dupa dizolvarea completa se inchide flaconul cu dopul PP corespunzator (fara a se infileta complet)     si se sterilizeaza in autoclavul HV-L 50, cod EMC MB 01, conform ILL-MB-01, la temperatura de (121 3) ⁰ C, presiunea de 1.2 atm, timp de (15 1) minute. Dupa sterilizare se masoara pH-ul prin folosirea pH-metrului WTW Vario, cod EMC MB 17, conform ILL-MB-17, la temperatura de 25 ⁰C; ajustarea pH-ului se face cu solutie de NaOH 40 g/L sau HCl 36,5 g/L, astfel incat valoarea acestuia sa fie in 7.3 0,2 unitati de pH.

pH-metrul se calibreaza saptamanal, conform ILL-MB-17, de catre RI, cu solutii tampon WTW (4.01, 7.00, 10.00), inregistrarea calibrarii efectuandu-se in "Caietul inregistrari calibrari pH-metre microbiologie" cod CL-15 - MB-13.

Mediul "Agar-Soia-Triptona, dupa sterilizarea si corectarea pH-ului, se lasa la racit pana la aproximativ (47 2) ⁰C in baia de apa Memmert, cod EMC MB 27.

Se pregatesc pe masa de lucru, cutii Petri sterile, din plastic, cu diametrul de 55-60 mm. Se desface dopul flaconului cu mediu final preparat, se flambeaza gura flaconului la flacara unui bec de gaz, se ridica pe rand capacul cutiilor si se toarna mediul din flacon in acestea, astfel incat sa se obtina o grosime a stratului de mediu, de cel putin 2 mm. Se lasa mediul turnat sa se solidifice pe suprafata orizontala a mesei.

Dupa solidificare cutiile cu mediu se pot utiliza imediat sau se intorc cu capacul in jos, se aseaza una peste alta in teancuri de 10 bucati, se invelesc in folie de aluminiu, se marcheaza cu denumirea mediului si data prepararii si se depoziteaza in refrigeratorul Sanyo MPR 514 R, cod EMC MB 29, amplasat in camera de lucru, cod E 05, pe raftul etichetat cu denumirea pocedurii si a mediului respectiv, pentru o perioada de maxim o luna.

5.3.3.4.1. Prepararea mediului Agar - Triptona - Saruri biliare (TBA)

Se cantareste la balanta Sartorius, cod EMC MB 03, o cantitate de g/L (sau o jumatate din cantitate pentru preapararea unui volum de 500 ml mediu) mediu deshidratat si se toarna cu o palnie pentru pulberi intr-o sticla de laborator termorezistenta, cu dop cu filet din PP, de volum potrivit volumului de mediu ce se doreste a fi obtinut (500 ml, 1000 ml); se adauga progresiv volumul necesar de apa distilata (sau bidistilata), evitandu-se formarea de cocoloase. Apa distilata se prepara la bidistilatorul Festreem, cod EMC MB 07, conform ILL-MB-07, din apa potabila clorinata, dupa neutralizarea prealabila a clorului, prin aplicarea pe conducta de alimentare a unui filtru pentru cloruri (cu carbune activ). Mediul deshidratat este rapid disperat prin agitare si incalzire usoara la plita electrica cu agitare VELP, cod EMC MB 26, conform ILL -MB-26, urmata de dizolvare completa in baia de apa Memmert, cod EMC MB 27, conform ILL-MB-27.

Dupa dizolvarea completa se inchide flaconul cu dopul PP corespunzator (fara a se infileta complet)     si se sterilizeaza in autoclavul HV-L 50, cod EMC MB 01, conform ILL-MB-01, la temperatura de (121 3) ⁰ C, presiunea de 1.2 atm, timp de (15 1) minute.

Dupa sterilizare se masoara pH-ul prin folosirea pH-metrului WTW Vario, cod EMC MB 17, conform ILL-MB-17, la temperatura de 25 ⁰C; ajustarea pH-ului se face cu solutie de NaOH 40 g/L sau HCl 36,5 g/L, astfel incat valoarea acestuia sa fie in 7.2 0,2 unitati de pH.

Dupa sterilizare si corectarea pH-ului, mediul se raceste la (47 2) ⁰C in baia de apa Memmert, cod EMC MB 27.

Se pregatesc pe masa de lucru, cutii Petri sterile, din plastic, cu diametrul de 55-60 mm. Se desface dopul flaconului cu mediu final preparat, se flambeaza gura flaconului la flacara unui bec de gaz, se ridica pe rand capacul cutiilor si se toarna mediul din flacon in acestea, astfel incat sa se obtina o grosime a stratului de mediu, de cel putin 2 mm. Se lasa mediul turnat sa se solidifice pe suprafata orizontala a mesei.

Dupa solidificare cutiile cu mediu se pot utiliza imediat sau se intorc cu capacul in jos, se aseaza una peste alta in teancuri de 10 bucati, se invelesc in folie de aluminiu, se marcheaza cu denumirea mediului si data prepararii si se depoziteaza in refrigeratorul Sanyo MPR 514 R, cod EMC MB 29, amplasat in camera de lucru, cod E 05, pe raftul etichetat cu denumirea pocedurii si a mediului respectiv, pentru o perioada de maxim o luna.

Dupa solidificare cutiile cu mediu se pot utiliza imediat sau se intorc cu capacul in jos, se aseaza una peste alta in teancuri de 10 bucati, se invelesc in folie de aluminiu, se marcheaza cu denumirea mediului si data prepararii si se depoziteaza in refrigeratorul Sanyo MPR 514 R, cod EMC MB 29, amplasat in camera de lucru, cod E 05, pe raftul etichetat cu denumirea pocedurii si a mediului respectiv, pentru o perioada de maxim o luna.

Pregatirea apei de dilutie

Apa de dilutie utilizata in incercarile microbiologice este o solutie tampon de fosfati, cu urmatoarea compozitie: KH₂PO₄ (42.5 g), MgCl₂ (190 g), apa 1000 ml. Ea se prepara de catre R.I.prin cantarirea componentilor individuali si dizolvarea lor in apa distilata, astfel:

solutia stoc de fosfati se prepara prin cantarirea la balanta Sartorius, conform ILL-MB-03, a unei cantitati de 34 g fosfatacid de potasiu (KH₂PO₄)_, care se toarna intr-un balon cotat, clasa A, de 1000ml; se adauga un volum de 500 ml apa distilata, masurata cu un cilindru gradat clasa , de 500 ml si se agita pana la dizolvare completa; se ajusteaza pH-ul la 7,2 0.5 cu solutie NaOH 1 mol/l si se completeaza pana la 1000 ml cu apa distilata. masurarea pH-ului se face cu pH-metrul WTW 340 i, conform ILL -MB-18; solutia stoc de fosfati astfel pregatita se transfera intr-o sticla de laborator termorezistenta, de 1000 ml, care se acopera cu dopul din PP cu filet si se sterilizeaza in autoclavul HV-L 50, conform ILL-MB-01; dupa sterilizare si racire se pastreaza in refrigeratorul Sanyo MPR 514 R, amplasat in camera de lucru, cod E 05, pe raftul etichetat cu "apa de dilutie", pentru o perioada de timpmaxim 6 luni;

solutia stoc MgCl₂: se prepara prin cantarirea la balanta Sartorius, conform ILL-MB-03, a unei cantitati de 38 g clorura de magneziu (MgCl₂), care se toarna intr-un balon cotat, clasa A, de 1000ml; se adauga treptat, pana la semn, apa distilata si se agita permanent balonul, sub jet de apa rece, dizolvarea fiind insotita de o reactie puternic exoterma; solutia stoc astfel pregatita se transfera intr-o sticla de laborator termorezistenta, de 1000 ml, care se acopera cu dopul din PP cu filet si se sterilizeaza in autoclavul HV-L 50, conform ILL-MB-01; dupa sterilizare si racire se pastreaza in refrigeratorul Sanyo MPR 514 R, amplasat in camera de lucru, cod E 05, pe raftul etichetat cu "apa de dilutie", pentru o perioada de     maxim 6 luni;

solutia finala: se masoara cu o pipeta clasa A, sterila, de 1 ml, un volum de 1.25 ml din solutia stoc de fosfati, care se toarna intr-un balon cotat clasa A, de 1000 ml; cu o pipeta sterila, clasa A, gradata, de 10 ml si se masoara un volum de 5 ml din solutie stoc de MgCl₂, care se toarna de asemenea in acelasi balon cotat; se completeaza balonul pana la semn cu apa distilata si se amesteca continutul cu o bagheta de sticla; volume de cate 9 ml din solutia finala astfel preparata, vor fi distribuite cu o pipeta de 10 ml, in eprubete, care vor fi inchise cu dopuri din PP corespunzatoare, introduse in cosuri de inox si sterilizate in autoclavul HV-L 50, conform ILL-MB-01; dupa sterilizare si racire se pastreaza in refrigeratorul Sanyo MPR 514 R, amplasat in camera de lucru, cod E 05, pe raftul etichetat cu "apa de dilutie", pentru o perioada de maxim 6 luni.

Pregatirea echipamentelor

5.3.4.1.Pregatirea si verificarea starii de functionare a balantei Sartorius se face conform instructiunii de lucru pentru balanta Sartorius, cod ILL-MB-02. Confirmarea metrologica a balantei se face conform PGL-16, Echipamente cu periodicitatea specificate in anexa 3 la PGL-16.

5.3.4.2.Pregatirea si verificarea starii de functionare a autoclavelor HMC, tip HV-L 50 si Systec se face conform instructiunilor de lucru corespunzatoare, cod ILL-MB-01, respectiv ILL-MB-02. Confirmarea metrologica se face conform PGL-16 "Echipamente" cu periodicitatea specificata in anexa 3 la PGL-16.

5.3.4.3.Pregatirea si verificarea starii de functionare a termostatelor Sanyo Galenkamp si Memmert se face conform instructiunilor de lucru corespunzatoare, cod ILL-MB-25, respectiv ILL-MB-22. Confirmarea metrologica se face conform PGL-16 "Echipamente" cu periodicitatea specificata in anexa 3 la PGL-16.

5.3.4.4.Pregatirea si verificarea starii de functionare a pH-metrelor WTW VARIO si WTW 340 i se face conform instructiunilor de lucru corespunzatoare, cod ILL-MB-17, respectiv ILL-MB-18. Confirmarea metrologica se face conform PGL-16 "Echipamente" cu periodicitatea specificata in anexa 3 la PGL-16.

5.3.4.5.Pregatirea si verificarea starii de functionare a baii de apa termostatate Memmert se face conform instructiunii de lucru corespunzatoare, cod ILL-MB-27. Confirmarea metrologica se face conform PGL-16 "Echipamente" cu periodicitatea specificata in anexa 3 la PGL-16.

5.3.4.6.Pregatirea si verificarea starii de functionare a refrigeratorului Sanyo MPR 514-R se face conform instructiunii de lucru corespunzatoare, cod ILL-MB-29. Confirmarea metrologica se face conform PGL-16 "Echipamente" cu periodicitatea specificata in anexa 3 la PGL-16.

5.3.4.7.Pregatirea si verificarea starii de functionare a etuvei Memmert se face conform instructiunii de lucru corespunzatoare, cod ILL-MB-08. Confirmarea metrologica se face conform PGL-16 "Echipamente" cu periodicitatea specificata in anexa 3 la PGL-16.

5.3.4.8.Pregatirea si verificarea starii de functionare a hotelor cu flux de aer laminar Heto Holten si Faster BSC EN 1-3 se face conform instructiunilor de lucru corespunzatoare, cod ILL-MB-11, respectiv ILL-MB-28.

5.3.4.9.Pregatirea si verificarea starii de functionare a becului de gaz Integra Fireboy, respectiv Gasprofi 1 se face conform instructiunilor de lucru corespunzatoare, cod ILL-MB-05, respectiv ILL-MB-06.

5.3.4.10.Pregatirea si verificarea starii de functionare a bidistilatorului Fistreem se face conform instructiunii de lucru corespunzatoare, cod ILL-MB-07.

5.3.4.11.Pregatirea si verificarea starii de functionare a numaratorului de colonii aCOLyte se face conform instructiunii de lucru corespunzatoare, cod ILL-MB-16.

5.3.4.12.Pregatirea si verificarea starii de functionare a masinii automate de spalat sticlarie SteelCO se face conform instructiunii de lucru corespunzatoare, cod ILL-MB-13.

5.3.4.13.Pregatirea si verificarea starii de functionare a baii de apa GFL se face conform instructiunii de lucru corespunzatoare, cod ILL-MB-04.

5.3.4.14.Pregatirea si verificarea starii de functionare a plitei electrice cu agitare VELP se face conform instructiunii de lucru corespunzatoare, cod ILL-MB-26.

5.3.4.15.Pregatirea si verificarea starii de functionarec a instalatie de filtrare microbiologica Sartorius se face conform instructiunii de lucru corespunzatoare, cod ILL-MB-10.

5.3.4.16.Pregatirea si verificarea starii de functionare a instalatie de filtrare microbiologica MBS I se face conform instructiunii de lucru corespunzatoare, cod ILL-MB-09..

. Pregatirea lampii cu ultraviolete Vilbert Lourmat, cu suport, se face conform instructiunii de lucru, cod ILL-MB-12.

Pregatirea incubatorului (termostat) Binder BD 53, se face conform instructiunii de lucru, cod ILL-MB-21. Confirmarea metrologica se face conform PGL-16 "Echipamente" cu periodicitatea specificata in anexa 3 la PGL-16.

Toate termostatele, in care se realizeaza incubarea incercarilor de E.coli, precum si refrigeratoarele, in care sunt pastrate mediile de cultura, apa de dilutie si reactivii utilizati, nu se deconecteaza de la curent, ele functionand 24 de ore din 24.

5.3.5.Masuri preventive

Personalul din laborator este dotat cu echipament de protectie :

halat alb cu maneca lunga;

masca de protectie nas si gura, de unica folosinta;

manusi latex sterile si nesterile;

ochelari de protectie raze UV;

trusa medicala de prim ajutor (contine si solutii pentru neutralizare in caz de arsura cu reactivi chimici: acid boric 2%, acid acetic 2%, bicarbonat de sodiu 2 %) ;

materiale igienico-sanitare: sapun, spirt, perie dinti, creme emoliente;

lapte antidot,

Este absolut necesar ca in cazul operatiilor ce se efectueaza in laborator, EIP sa fie in perfecta stare de curatenie.

Incercarile microbiologice se executa in hotele cu flux de aer laminar, care protejeaza atat proba, cat si operatorul.Ventilatia prin sistemul CTA (centrala de tratare a aerului) este un mijloc suplimentar de reducere a concentratiei de microorganisme si substante toxice in zonele de munca.

La finalizarea activitatii se inchid toti robinetii de alimentare cu gaz si apa din spatiile de lucru. De asemenea se decupleaza de la instalatia electrica toate aparatele care permit acest lucru.

Personalul este instruit din punct de vedere al protectiei muncii, pentru fiecare loc de munca.

5.4.Executia incercarii

Operatiile sunt efectuate de executantul incercarii si sunt supervizate de R.I. si sau RRL. Executantul inregistreaza incercarile efectuate in caietul de laborator, cod CL-15-MB-03 al carui model este prezentat in anexa 1MB la procedura PGL-15 <<Metode de incercare si validarea metodei>>.

Verificarea inregistrarilor este efectuata sub semnatura de R.I. si/sau RRL. Transcrierea rezultatelor din caietul de lucru in registrele de incercare se face de catre RRL

Seful de laborator verifica prin sondaj modul de executare a determinarilor si inregistrarile efectuate.

5.4.1. Eliminarea interferentelor

Apele care contin sedimente sau cantitati mari de suspensii materiale si coloidale (fier, mangan, flocule de aluminiu, alge), pot bloca porii membranelor filtrante si ca urmare filtrarea apei nu mai poate fi realizata, sau pot determina dezvoltarea unor colonii bacteriene difuze, care mascheaza coloniile tipice si influenteaza acuratetea numararii.

Cand densitatea bacteriana este estimata a fi mare, se filtreaza un volum mic de proba sau dilutii ale acesteia, pentru a minimiza interferenta cu turbiditatea sau cu cresterea de colonii netipice in fundal. Astfel, se recomanda ca:

pentru probele de apa potabila dezinfectate se vor filtra volume de 100 ml din proba de apa, nediluata;

pentru probele de apa nedezinfectata, la care nu se cunoaste o posibila incarcare microbiologica, se vor filtra pentru fiecare incercare, volume de 100 ml proba nediluata, volume de 100 ml suspensie initiala din proba (d = 0.1), volume de 100 ml din dilutia decimala 0.01;

pentru probele de apa imbuteliata, la care raportarea rezultatelor conform legislatiei se face pentru 250 ml, se vor filtra volume de 250 ml nediluate de proba.

Tehnica filtrarii prin membrana nu poate fi aplicata apelor cu turbiditate mare si continut scazut de bacterii.

Materialele toxice (metale, fenoli, acizi, baze), cloramine si alti produsi dezinfectanti, pot de asemenea afecta regenerarea celulelor bacteriene de pe membrana filtranta.

5.4.2. Mod de lucru

5.4.2.1. Asigurarea materialelor necesare

Pentru evitarea contaminarii probei (esantionului) luata in lucru, incercarea numarului de E.coli din probele de apa se executa in hota cu flux de aer laminar vertical Faster BSC EN 1-3, cod EMC MB 28 sau in hota cu flux de aer laminar vertical Heto Holten Biosafe 1.2, cod EMC MB 11, care au fost pregatite conform instructiunilor de lucru corespunzatoare.

Executantul incercarii, precum si restul personalului implicat in incercare (R.I, RRL) poarta EIP in timpul lucrului.

Pe masa hotei cu flux de aer laminar se pregatesc cutiile Petri necesare incercarii, cu mediul de cultura TSA steril; acestea se scot de catre executantul incercarii, din refrigeratorul Sanyo MPR 514 R, in care sunt depozitate, cu minim 30 minute inainte de inceperea executiei incercarii, pentru aclimatizare. Cutiile se desfac din folia de aluminiu in care sunt impachetate si se aseaza pe masa hotei, cu capacul in jos, pentru a se evita formarea condensului pe mediul de cultura.

Executantul incercarii pregateste pe masa hotei si membranele filtrante necesare incercarii, care se gasesc in cutiile in care sunt livrate. Cutiile cu membrane filtrante sunt pastrate in dulapul 3 din camera E 05.

Pentru fiecare esantion de proba dezinfectata, care nu necesita dilutii, se pregatesc doua cutii Petri cu mediu de cultura TSA si doua membrane filtrante sterile; pentru fiecare esantion de proba nedezinfectata, care necesita dilutii decimale, se pregatesc 6 cutii Petri, in functie de cat este estimata incarcarea microbiana a acesteia. In registrul evidenta esantionare microbiologica probe apa potabila, cod RG -15- ESAMP, RRL mentioneaza pentru fiecare proba codata, modul de executie al incercarii (fara dilutie: d=1, sau cu dilutie: d = 1; 0.1; 0.01).

Pe spatele fiecarei cutii se noteaza cu un marker permanent, de catre executantul incercarii:

codul probei luata in lucru;

dilutia probei care se va filtra;

volumul filtrat;

data executiei incercarii.

Executantul incercarii i-si va aduce din dulapul 3, din camera E 06, o punga cu palnii din PP sterilizate, pe care o va deschide si va introduce palniile in dispenserul corespunzator, amplasat in hota cu flux de aer laminar. Executantul incercarii va pregati pe masa hotei un pahar Berzelius, cu volumul de 100 ml, in care va turna alcool etilic absolut si in care va introduce penseta pentru manevrarea membranelor filtrante. Un pahar Berzelius de 200 ml sau o sticla de laborator se va umple cu apa bidistilata si se va aseza pe masa hotei; din ea se va alimenta pistolul dozator sau siringile din plastic, la care se vor atasa unitatile filtrante; acestea au rolul de a steriliza apa cu care se spala baza filtranta si sunt pastrate in cutiile in care au fost livrate, in dulapul 3 din camera E 05.

In hota cu flux de aer laminar, in care se executa incercarea, se va pregati, de asemenea, un container din inox cu pipete gradate sterile, cu volumul de 10 ml, necesare pentru prepararea suspensiei initiale si a dilutiilor decimale.

In cazul probelor de apa nedezinfectate, care necesita dilutii, executantul va scoate din refrigeratorul Sanyo MPR 514-R, cu minim 30 minute inainte de inceperea executiei incercarii, cantitatea necesara de flacoane cu apa tamponata de dilutie. Pentru prevenirea distrugerii microorganismelor prin schimbari bruste ale temperaturii, se recomanda ca temperatura diluantului sa fie aproximativ aceeasi cu temperatura ambianta. Pentru fiecare incercare de bacterii coliforme dintr-o proba de apa nedezinfectata sunt necesare 4 flacoane cu cate 90 ml apa de dilutie. Pe acestea se va nota cu marcherul, codul si dilutia probei respective (0.1; 0.01).

5.4.2.2. Prepararea suspensiei initiale de proba si a dilutiilor decimale

Inainte de incercarea microbiologica, proba de apa se omogenizeaza prin agitarea manuala a recipientului cu proba, efectuandu-se cca. 25 miscari de sus in jos, cu o amplitudine de 30 cm. In functie de tipul de apa si de continutul bacterian anticipat (dilutia trebuie aleasa astfel incat numarul estimativ de UFC formate pe membranele cu diametrul de 55-60 mm sa fie intre 10 si 100) se va realiza suspensia initiala de proba si o serie de dilutii decimale necesare, in modul urmator:

se tine containerul din inox cu pipete gradate sterile, clasa A, cu volumul de 10 ml in mana stanga si cu mana dreapta se deschide containerul, prin tragerea capacului;

se scoate cu mana dreapta o pipeta din container, careia i se ataseaza la capatul superior un balob Griffin sau un ajutor manual de pipetare;

se inchide containerul cu pipete si se lasa pe masa hotei;

se ia in mana stanga recipientul cu esantionul de proba si se deschide dopul acestuia;

se apasa pedala becului de gaz din hota, care declanseaza aprinderea flacarii;

se flambeaza la becul de gaz din hota, varful pipetei gradate si gura recipientului cu proba de incercat;

se ridica piciorul de pe pedala pentru a se stinge flacara becului de gaz, care ar perturba fluxul de aer al hotei;

se introduce pipeta flambata, dupa cateva secunde de la flambare pentru ca aceasta sa se raceasca in recipientul cu proba si se aspira un volum de 10 ml din proba de apa supusa incercarii;

se lasa recipientul cu proba pe masa hotei si se ia cu mana stanga un flacon cu 90 ml apa de dilutie, marcata cu dilutia d=0.1;

se deschide dopul flaconului si se flambeaza gura acestuia la becul de gaz, care are din nou pedala apasata cu piciorul;

se introduce varful pipetei cu 10 ml proba in flacon si se goleste complet continutul pipetei;

se scoate pipeta din flacon si se lasa intr-un cos din plastic, pentru produse folosite, pregatit pe masa de lucru de langa hota;

se flambeaza din nou gura flaconul si interiorul dopului si se inchide flaconul ermetic;

se omogenizeaza amestecul prin agitarea manuala a flaconului, efectuandu-se cca. 25 miscari de sus in jos, cu o amplitudine de 30 cm; s-a obtinut astfel suspensia initiala de proba, care are dilutia d = 0.1;

se transfera, cu o alta pipeta sterila, luata din containerul cu pipete, 10 ml din suspensia initiala, in flaconul care contine 90 ml apa de dilutie, marcata cu dilutia d=0.01; pentru precizie optima, nu se va introduce pipeta mai mult de 1 cm in suspensia initiala si se va evita orice contact intre pipeta, care contine inoculul si diluantul steril;

se inchide flaconul ermetic;

se omogenizeaza amestecul prin agitarea manuala a flaconului, efectuandu-se cca. 25 miscari de sus in jos, cu o amplitudine de 30 cm; se obtine astfel dilutia d=0.01;

intervalul de timp intre sfarsitul pregatirii suspensiei initiale si momentul in care aceasta este filtrata este de maxim 45 minute, iar intre pregatirea suspensiei initiale si a dilutiilor decimale de maxim 30 minute.

5.4.2.3. Filtrarea

Instalatia de filtrare prin membrana este alcatuita din suport filtrant din inox, cu doua sau trei posturi de filtrare, amplasat pe masa hotei cu flux de aer laminar, care este conectat prin furtune speciale, la o pompa de vid si la un vas Kitasato; fiecare post de filtrare are o baza filtranta din inox, pe care este dispusa sita filtranta; pompa de vid este alimentata electric la 220 V si este amplasata pe un suport, langa hota.

Filtrarea probei si a dilutiilor acesteia se realizeaza de catre executantul incercarii in modul urmator:

cu pompa in pozitia "Off" si cu robinetul postului de filtrare inchis, se dezinfecteaza sita de filtrare, prin acoperire cu alcool etilic absolut;

se deschide robinetul postului de filtrare si se porneste pompa prin apasarea butonului "On/Off"; in cateva secunde alcoolul etilic va fi absorbit de pe sita de filtrare;

se opreste pompa si se inchide robinetul postului de filtrare;

se spala foarte bine sita de filtrare, prin acoperire cu apa distilata sterila, obtinuta prin filtrarea prin unitatea filtranta;

se opreste pompa si se inchide robinetul postului de filtrare;

se prinde cu mana stanga, o membrana filtranta sterila, impachetata individual si se se desface cu atentie, cu cealalta mana, fara a atinge membrana, ambalajul steril al acesteia;

se tine membrana, cu ambalajul desfacut, in mana stanga si cu mana dreapta se scoate din alcool penseta pentru manipularea membranei;

penseta este scuturata bine de alcool si este trecuta scurt prin flacara becului de gaz, pentru uscarea acesteia; trebuie avut grija sa nu se produca aprinderea alcoolului ramas pe penseta si producerea de arsuri la nivelul degetelor; penseta trebuie sa fie bine uscata deoarece alcool produce distrugerea membranei filtrante; varfurile pensetei sunt lasate sa se raceasca inainte de a prinde membrana;

se introduce varful pensetei in ambalajul steril al membranei, se prinde marginea membranei intre varfurile efilate ale pensetei si se pune membrana, cu caroiajul in sus, pe sita de filtrare;

se lasa penseta in paharul cu alcool;

se scoate cu mana, cu manusa sterila, prin tragere, o palnie din setul de palnii sterile si se pozitioneaza pe sita de filtrare, deasupra membranei filtrante, fixandu-se etans pe baza filtranta;

se apuca in mana dreapta flaconul cu esantionul de proba dezinfectata, sau flacoanele cu dilutiile pregatite pentru probele nedezinfectate, incepand cu dilutia cea mai mare;

se trece gura flaconului prin flacara becului de gaz;

cu pompa de vid oprita si cu robinetul postului de filtrare inchis, se toarna din flaconul respectiv in palnie volumul de proba (sau dilutie proba), care urmeaza sa fie filtrat;

se lasa flaconul pe masa hotei, se deschide robinetul postului de filtrare si se porneste pompa prin apasarea butonului "On/Off"; se lasa pornita vidarea (pompa) pana va fi filtrata toata apa din palnie;

se spala peretii palniei cu apa sterila (10-20 ml), obtinuta prin unitatea filtranta a pistolului dozator, se porneste din nou pompa si se filtreaza si aceasta;

la finalul filtrarii se opreste pompa, se asteapta pina la scaderea presiunii (manometrul pompei de vid indica 0 bar) si se inchide robinetul postului de filtrare;

se detaseaza palnia de postul de filtrare si se scoate penseta din alcool, care se usuca bine;

cu mana dreapta se prinde cu varfurile pensetei, marginea membranei filtrante si se ridica usor de pe sita de filtrare;

cu mana stanga se deschide capacul unei cutii Petri cu mediul de cultura TSA si se amplaseaza membrana cu caroiajul in sus, pe suprafata mediului de cultura, astfel incat sa nu se interpuna bule de aer intre mediu si membrana;

se apasa usor cu varfurile pensetei marginile membranei pe mediul de cultura, pentru o mai buna aderare a acesteia;

se lasa penseta in paharul cu alcool si se inchide cutia respectiva cu capacul corespunzator;

se repeta operatiile descrise anterior pentru filtrarea tuturor dilutiilor preparate

NOTA:

Pentru dilutii diferite ale aceleasi probe, aceeasi palnie poate fi utilizata fara a fi dezinfectata, cu percizarea ca dilutiile mari sa fie filtrate primele. Pentru filtrarea altei probe, se va folosi o alta palnie sterila. In timpul filtrarii unei serii de dilutii ale aceleeasi probe, baza filtrului trebuie dezinfectata numai daca s-a contaminat sau daca membrana este stricata.

Filtrarea probelor care se cunosc ca fiind poluate nu se face in mod alternativ cu filtrarea probelor de apa tratata prin acelasi aparat. Prima data se filtreaza toate probele dezinfectate, ale caror rezultate se estimeaza a fi negative, urmata de filtrarea probelor mai putin cunoscute din punct de vedere al incarcaturii lor poluante, la care se prepara dilutii.

5.4.2.4. Incubarea

Cutiile Petri cu membranele amplasate pe mediul de cultura TSA, se intorc cu capacul in jos si se     incubeaza, la (36 2) ⁰C pentru 4-5 ore in termostatul Memmert BE 500, cod EMC MB 22.

Se recomanda plasarea tuturor cutiilor Petri in incubator in acelasi timp.

Dupa perioda de incubare la (36 2) ⁰C executantul scoate cutiile respective din termostat si le aseaza pe masa hotei cu flux de aer laminar, unde urmeaza sa efectueze transferul membranelor.

Executantul scoate din refrigeratorul Sanyo MPR 514 R, cutii cu mediul de cultura TBA, cu minim 30 minute inainte de inceperea transferului, pentru aclimatizare. Cutiile se desfac din folia de aluminiu in care sunt impachetate si se aseaza pe masa hotei, cu capacul in jos, pentru a se evita formarea condensului pe mediul de cultura. Numarul cutiilor cu TBA va coincide cu cel al membranelor care trebuiesc transferate. Pe spatele fiecarei cutii cu TBA se noteaza cu un marker permanent, de catre executantul incercarii:

codul probei luata in lucru;

dilutia probei care se va filtra;

volumul filtrat;

data executiei incercarii

Transferul membranelor se realizeaza de catre executant, in hota cu flux de aer laminar, dupa cum urmeaza:

se scoate cu mana dreapta penseta din alcool;

penseta este scuturata bine de alcool si este trecuta scurt prin flacara becului de gaz, pentru uscarea acesteia; trebuie avut grija sa nu se produca aprinderea alcoolului ramas pe penseta si producerea de arsuri la nivelul degetelor; penseta trebuie sa fie bine uscata deoarece alcool produce distrugerea membranei filtrante; varfurile pensetei sunt lasate sa se raceasca inainte de a prinde membrana;

se ridica cu mana stanga capacul cutiei cu membrana ce trebuie transferata si se lasa pe masa hotei;

se prinde cutia cu membrana in mana dreapta;

se introduce un varf al pensetei intre membrana si mediul pe care este asezata;

se prinde membrana intre varfurile pensetei si se desprinde usor de pe mediu;

se lasa cutia de pe care s-a ridicat membrana pe masa hotei;

se ridica cu mana stanga capacul cutiei cu mediu TBA, pe care se va transfera membrana si se lasa pe masa hotei;

se prinde in mana stanga cutia cu mediul TBA si se amplaseaza membrana cu caroiajul in sus, pe suprafata mediului de cultura, astfel incat sa nu se interpuna bule de aer intre mediu si membrana;

se apasa usor cu varfurile pensetei marginile membranei pe mediul de cultura, pentru o mai buna aderare a acesteia;

se lasa penseta in paharul cu alcool si se inchide cutia respectiva cu capacul corespunzator;

se repeta operatiile descrise anterior pentru transferul tuturor membranelor;

Toate cutiile cu mediul TBA, pe care s-au transferat membranele, se intorc cu capacul in jos si se incubeaza in termostatul Binder BD 53, cod EMC MB 21, pentru 19-20 ore

Examinarea cutiilor se efectueaza dupa ce acestea se scot de la incubatie, iar daca nu este posibil acestea se conserva la (5 3) ⁰C, in refrigeratorul Sanyo MPR 311-D, cod EMC MB 19, timp de maxim 48 ore. Se elimina orice cutie pe care se observa o crestere confluenta a coloniilor.

5.4.2.5. Confirmarea

Dupa 20 ore de incubare, executantul scoate din termostatul Binder BD 53, toate cutiile Petri cu membrane pe mediu TBA si le aseaza pe masa de lucru din camera E 04, pe care este amplasata si lampa de UV Vilbert Lourmat.

Membranele care nu au dezvoltate pe ele colonii de culoare alb-galbuie, considerate a fi colonii prezumtive, nu necesita confirmare. Numarul de E. coli de pe le va fi inregistrat ca "0" in CL-15-MB-03.

Membranele pe care s-au dezvoltat colonii alb-galbui (prezumtive) se vor transfera pentru confirmare; acest lucru se va face de catre executantul incercarii in modul urmator:

se pregatesc un numar de rondele de filtru, cu diametrul sub 55 mm, egal cu numarul membranelor cu colonii prezumtive, ce se vor confirma;

se deschide capacul unei cutii cu o astfel de membrana, se aseaza pe masa de lucru, cu deschiderea in sus si se introduce in el o rondea de hartie de filtru;

se pune pe hartia de filtru, prin picurare, reactiv Indol, pana la saturarea acesteia;

se prinde penseta pentru manipularea membranelor in mana dreapta si cu varfurile acesteia se prind marginile membranei pe care exista colonii prezumtive;

se detaseaza usor membrana de pe mediul de cultura TBA si se aseaza pe hartia de filtru saturata cu indol;

se iradiaza membrana prin expunere la lampa cu ultraviolete Vilbert Lourmat, timp de 10 -30 minute, in functie de coloratia;

se repeta pasii de mai sus pana la finalizarea confirmarii pentru toate membranele cu colonii prezumtive.

Toate coloniile prezumtive de pe membrana, care dupa expunere la UV si-au schimbat culoarea in roz-rosietic, sunt confirmate ca UFC de E. coli.

5.4.2.5. Numararea coloniilor

RI examineaza fiecare membrana utilizata in incercarea numarului de E.coli la o proba de apa, chiar daca acestea sunt lipsite de colonii tipice.

Numararea coloniilor de pe membrane se realizeaza de catre RI, la numaratoul electronic de colonii aCOLyte, cod EMC MB 16, conform ILL-MB-16. Pentru fiecare membrana cu proba de apa codata, esantionata si incercata va exista un numar de colonii inregistrat in baza de date "E.coli", din calculatorul pe care este instalat soft-ul numaratorului de colonii.

5.5.Prezentarea rezultatelor

5.5.1.Mod de calcul

In cazul in care, metoda de incercare a unui microorganism, necesita o identificare (confirmare) a acestuia (colonii prezumtive crecute pe membrana), se calculeaza pentru fiecare membrana filtranta numarul de microorganisme detectate, dupa formula:

c

d = ─ x p, in care:

i

d = numar de colonii detectate;

c = numar colonii confirmate;

i = numar colonii puse la confirmat (incercate);

p = numar de colonii prezumtive.

Deoarece se expune la UV pentru confirmare intreaga membrana cu toate coloniile prezente pe ea, numarul de colonii prezumtive (p) va fi egal cu cel al coloniilor incercate (i), iar numarul de colonii detectate (d) obtinut conform formulei d= (c/i) x p, va fie egal cu cel de colonii confirmate; ca urmare se va nota ca rezultat, la fiecare cutie (membrana), direct numarul coloniile confirmate.

Calcularea rezultatului final de E. coli pentru o proba de apa se face din numarul coloniilor confirmate de pe toate cutiile Petri cu membrane filtrante utilizate in incercare, numar care a fost inregistrat de executantul incercarii in caietul de lucru, cod CL-15-06-03. Calculul numarului de E.coli din proba de apa, raportat la volumul de referinta, se realizeaza dupa formula:

C_s = x Vs,

in care:

C_s = numarul deUFC in raport cu volumul de referinta al probei (V_s);

N = ∑d = suma tuturor coloniilor detectate (d) pe membranele utilizate in incercarea unei probe de apa, derivind din dilutiile F₁, F₂Fi ;

n₁, n₂, n₃....n_i = numarul cutiilor luate in calcul pentru fiecare dilutie F₁, F₂ .. F_i ;

V₁, V₂, V₃...V_i = volumul test folosit cu dilutiile F₁, F₂ .. F_i ;

F₁, F₂ .. F_i = dilutia folosita pentru portiunea test V₁,V₂, V₃...V_i

( F = 1 pentru o proba nediluata, F = 0,1 pentru dilutia 0,1..etc).

Daca pe o membrana (prin care s-a filtrat o dilutie din proba: 1, sau 1 si 0,1), coloniile crescute conflueaza unele cu altele si nu pot fi numarate, sau daca numarul acestora este peste 100, membrana respectiva se va anula si se vor lua in considerare doar membranele cu dilutii mai mari ( 0,01), pe care numarul coloniilor tipice este sub 100.

Daca numarul coloniilor tipice, de pe fiecare membrana, pentru toate dilutiile este > 100, rezultatul final se va calcula pe baza numarului de colonii de pe membranele cu dilutia cea mai mica, conform formulei:

Cs > 100 x (c/i) x (1/d),

in care:

Cs = nr. UFC

c = nr. colonii confirmate

i = nr. colonii puse la confirmat

d = ultima dilutie filtrata

5.5.2.Inregistrarea rezultatelor

Dupa finalizarea numararii, la numaratorul electronic aCOLyte, a coloniilor confirmate de pe toate membranele incubate, RI scoate la imprimanta rezultatele inregistrate in baza de date "E.coli", din memoria calculatorului pe care este instalat soft-ul numaratorului electronic; de pe aceasta executantul incercarii va inregistra valorile corespunzatoare pentru fiecare proba pe care a executat-o si notat-o in caietul de lucru "inregistrari rezultate incercari Escherichia coli", cod CL-15-MB-03 al carui model este prezentat in anexa 1 MB la procedura PGL-15 '' Metode de incercare si validarea metodei''.

Rezultatul final pentru fiecare proba, este calculat de executant din numarul coloniilor de pe fiecare membrana, conform modului de calcul de la punctul 5.5.1. Rezultatele finale obtinute sunt verificate si validate sub semnatura de RI. Seful de laborator verifica prin sondaj modul de efectuare a incercarilor si inregistrarile efectuate.

Rezultatul final al incercarii este transferat din caietul de lucru "inregistrari rezultate incercari Escherichia coli", cod CL-15-MB-03 de catre RRL si inregistrat in registrele de rezultate incercari microbiologice probe apa potabila (Timisoara, cod RG-15-MAPT; Judet, cod RG-15-MAPJ; contracost, cod RG-15-MAPCC ); acestea se verifica sub semnatura de catre SL.

In cazul solicitarilor de incercari de catre clientii externi, RRL elibereaza rapoarte de incercare cu rezultatele incercarilor microbiologice din "registrul rezultate incercari microbiologice probe apa potabila contracost", cod RG-15-MAPCC. Rapoartele eliberate se verifica si semneaza de catre SL.

5.5.3.Exprimarea rezultatelor

Se face sub forma de numar Escherichia coli ( UFC)/ 100 ml de proba.

Absenta de colonii pe membranele din incercarea de E. coli a unei probe de apa nediluate se exprima ca nedectate (sau 0)/ 100 ml.

Un numar de peste 100 colonii pe membranele cu cea mai mare dilutie din proba respectiva, se exprima ca     valoare aproximativa, calculata conform punctului 5.5.1.

Valoarea rezultatului final se rotunjeste la numarul intreg apropiat.

5.5.4.Asigurarea calitatii rezultatelor

Asigurarea calitatii rezultatelor se realizeaza prin urmatorele metode de verificare a rezultatelor:

participarea laboratorului in scheme de intercomparare sau programe de teste de capabilitate;

utilizarea materialelor de referinta certificate (tulpini de referinta pure ATCC) pentru un control intern al calitatii;

introducerea diagramelor de control Shewart;

estimarea incertitudinii de masurare;

evaluarea parametrilor de performanta a unei metode (limita de detectie, repetabilitate, reproductibilitate) ;

incercarea probelor paralele utilizand aceeasi metoda;

proba dubla, data in lucru periodic, aplicand aceiasi metoda de incercare, de catre acelasi executant sau de catre doi executanti diferiti;

Indicatii complete privind aceste masuri pentru asigurarea calitattii rezultatelor se gasesc in procedura operationala POL-02 <<Diagrame de control Shewart>> si in procedura generala PGL-22  <<Estimarea incertitudinii de masurare>>, iar inregistrari ale acestor masuri se gasesc in dosarul de asigurare a calitatii cod DG-20-02-SPUV.

5.5.5.Raportarea rezultatelor

Raportarea rezultatelor se realizeaza conform procedurii "Raportarea rezultatelor", cod PGL-21.

RRL emite rapoartele de incercare cu rezultatele incercarilor microbiologice, dupa modelul pentru clientii interni sau pentru clientii externi. Informatiile cuprinse in rapoartele de incercare sunt cele prevazute in procedura generala PGL-21<<Raportarea rezultatelor>> rapoartele de incercare se intocmesc in 2 exemplare. rapoartele de incercare sunt supervizate de SL.

5.5.6.Activitati finale

5.5.6.1. Modul de colectare si distrugere a resturilor de proba

Dupa terminarea incercarilor, cantitate de apa ramasa din proba incercata este deversata la reteaua de canalizare de catre executantul incercarii. Apa deversata nu necesita neutralizare sau dezinfectare, deoarece laboratorul executa incercari microbiologice pentru ape potabile, ape din procesele tehnologice de tratare, ape subterane si de suprafata ( Bega), fara pericol de poluare a retelei de canalizare.

5.5.6.2. Modul de colectare si distrugere a deseurilor rezultate din incercarile microbiologice

Toate culturile de microorganisme rezultate din incercarile microbiologice, precum si materialele care au venit in contact cu ele, se decontamineaza inainte de curatare sau aruncare. Operatia este executata de catre un laborant bacteriolog, conform procedurii operationale "Manipularea, decontaminarea si eliminarea deseurilor microbiologice", cod POL-MB-03, cu inregistrarea proceselor de decontaminare in "caietul inregistrari decontaminare deseuri microbiologice, cod CL-15-MB-12.

Intregul proces de decontaminare se efectueaza in spatiul laboratorului microbiologic, special amenajat in acest sens si anume camera de decontaminare si sterilizare, cod E 03.

Materialele contaminate si culturile sunt introduse in pungi speciale pentru deseuri microbiologice, autoclavabile, marcate cu semnul de pericol biologic (BIOHAZARD), care sunt inchise si transportate in camera de decontaminare, unde vor fi decontaminate prin autoclavare in autoclavul Systec, cod EMC MB 02., conform ILL-MB-02. Dupa autoclavare, se face sortarea materialului decontaminat, in functie de tipul de material (de unica folosinta sau reutilizabil). Materialele de unica folosinta sunt depozitate in cosul de deseuri inactivate si ulterior preluate si incinerate de firma contractanta PRO AIR CLEAN. Materialele reutilizabile (cutii Petri, pipete), sunt spalate la masina automata de spalat sticlarie SteelCo, cod EMC MB 13, conform ILL -MB-13, dupa care sunt ambalate corespunzator si sterilizate, conform POL MB 01.

6.RESPONSABILITATI

6.1.Sef laborator

verifica si aproba prezenta procedura;

verifica respectarea programului de prelevare a probelor;

verifica activitatea de prelevare, manipulare, transport, conservare - daca este cazul, conform PGL-18;

verifica prin sondaj modul de executie a incercarii si validare a rezultatelor;

verifica si aproba rapoartele de incercare;

organizeaza, conduce si raspunde de activitatea din laborator;

stabileste sarcini concrete pentru personalul laboratorului;

face propuneri pentru dotarea laboratorului si aprovizionarea ritmica cu reactivi si materiale necesare atat in activitatea analitica cat si in cea de prelevare;

se ocupa de procurarea noilor standarde in vigoare ;

face propuneri, analize si rapoarte pentru imbunatatirea activitatii;

face instructaj cu personalul aflat in subordine;

primeste si inregistreaza probele pentru clientii externi si le preda spre analiza responsabilului de incercari ape;

verifica sub semnatura inregistrarile rezultatelor din registru de rezultate incercari ape;

gestioneaza, completeaza si verifica registrele de comenzi externe si rezultatele pentru clientii externi;

organizeaza si coordoneaza participarea la programe de comparatii interlaboratoare si pastreaza inregistrari referitoare la participare si rezultatele obtinute;

verifica prin sondaj rezultatele activitatilor de asigurare a calitatii rezultatelor desfasurate in laborator si stabileste actiuni preventive/corective, impreuna cu responsabilul de regim;

analizeaza impreuna cu responsabilul de incercare efectul defectiunilor asupra rezultatelor incercarilor anterioare.

6.2.Responsabilul Calitatii

verifica implementarea procedurii referitoare la Diagrame de control Shewart;

verifica implementarea procedurii referitoare la calculul incertitudiniide masurare ;

verifica implementarea procedurii referitoare la adecvarea la scop a metodelor de incercare ;

verifica implementarea procedurii referitoare la trasabilitatea masurarii

Responsabilul     de regim

elaboreaza prezenta procedura;

implementeaza prezenta procedura in conformitate cu Sistemul de management al calitatii;

verifica valabilitatea mediilor de cultura, reactivilor si a solutiilor de reactivi;

stabileste executantul incercarii;

receptioneaza, codeaza si inregistreaza proba in registrul de evidenta microbiologica probe apa potabila, cod RG-15- EMAP;

esantioneaza proba pentru inceperea incercarii si o inregistreaza in registrul esantionare microbiologica probe apa potabila, cod RG-15- ESMAP;

supervizeaza incercarea ;

asigura executantului incercarii documentatia necesara incercarii;

poate participa la prelevarea probelor;

verifica si valideaza rezultatele incercarilor in caietul de lucru inregistrari rezultate incercari numar de colonii", cod CL-15-MB-01,

verifica si valideaza toate caietele de lucru in care s-au facut inregistrari in timpul incercarii;

efectueaza transferul rezultatelor in registrele de rezultate incercari microbiologice, pe care le gestioneaza;

organizeaza, urmareste si inregistreaza rezultatele obtinute ca urmare a aplicarii unei scheme pentru asigurarea calitatii rezultatelor;

raspunde de efectuarea corecta si la timp a incercarii;

raspunde de corecta utilizare a aparaturii utilizate pentru incercare;

elaboreaza si semneaza rapoarte de incercare;

pregateste si da in lucru probele de control cu tulpini de referinta (martor pozitiv);

organizeaza, urmareste si inregistreaza rezultatele obtinute ca urmare a aplicarii unei scheme pentru asigurarea calitatii rezultatelor;

anunta seful de laborator de eventualele defectiuni ale aparaturii si eventualele depasiri ale

limitelor impuse de legislatia in vigoare;

informeaza seful de laborator in legatura cu necesarul de materiale si reactivi;

aplica atat procedura Diagrame de control Shewart cat si cea de calcul al incertitudinilor de masurare ;

stabileste si urmareste punerea in practica de actiuni preventive/corective.

6.4. Responsabil incercare

prepara mediile de cultura, apa de dilutie si solutiile necesare in executia incercarii;

efectueaza inregistrarile privind prepararea acestora in caietul de preparare medii de cultura si solutii reactivi, cod CL-15- 06-07;

participa la executia incercarii si supravegheza executia incercarii;

raspunde de efectuarea corecta si la timp a incercarii;

raspunde de corecta utilizare a aparaturii utilizate pentru incercare;

urmareste si stabileste momentul pentru colectarea si distrugerea reziduurilor de probe;

monitorizeaza operatia de igienizare, cu inregistrarea acesteia in caietul "inregistrari control microflora aer si suprafete", cod CL-15-MB-08;

pune in aplicare, in termenele stabilite, actiunile preventive/corective dispuse de seful de laborator.

6.5.Executantul incercarii

executa incercarea si efectueaza inregistrarile in caietul de lucru inregistrari rezultate incercari bacterii coliforme", cod CL-15-MB-02,

gestioneaza caietul de inregistrari rezultate incercari bacterii coliforme", cod CL-15-MB-02,

verifica functionarea si integritatea aparaturii, instalatiilor si a sticlariei utilizate si anunta responsabilul de incercare de eventualele nereguli constatate in functionare;

colecteaza si distruge resturile de probe si deseurile microbiologice conform procedurii operationale "Manipularea, decontaminarea si eliminarea deseurilor microbiologice", cod POL-MB-03, cu inregistrarea proceselor de decontaminare in "caietul inregistrari decontaminare deseuri microbiologice, cod CL-15-MB-12;

pregateste sticlaria necesara in executia incercarii conform conform procedurii operationale "Pregatirea materialelor utilizate in incercarile microbiologice", cod POL-MB-01, cu inregistrarea proceselor de sterilizare in caietul inregistrari sterilizare termica umeda- autoclav HV-L 50, cod CL-15-MB-10 si in caietul inregistrari sterilizare termica uscata-etuva, cod CL-15-MB-11;

executa igienizarea in spatiile destinate incercarilor microbiologice, conform procedurii operationale " Igienizarea in spatiile destinate incercarilor microbiologice", cod POL-MB-04 si a planului de curatenie, cod FG- 14-02.

7.INREGISTRARI

8.ANEXE

Nu este cazul