CURS BIOLOGIEMOLECULARA

CURS BIOLOGIEMOLECULARA

PROCESAREA ARN, Transport Nuclear si Control Post-Transcriptional

Diapozitiv 2

Elongarea ARN de catre ARN polimeraza

Figura: Elongarea catenei ARN de catre ARN polimeraza

In regiunea care va fi transcrisa, dublul helix este deschis (desfacut) cu aproximativ un tur pentru a permite catenei sens sa formeze un scurt segment hibrid ADN/ARN dublu catenar cu capatul 3' ARN. Cu cat ARN polimeraza avanseaza de-a lungul matritei ADN (in dreapta), ADN este derulat in fata furcii de transcriptie in deplasare si re-rulat in spatele acestuia, eliberand astfel ARN nou sintetizat de catena matrita (antisens).

a)     O cale poate sa fie urmata este aceea in care ARN polimeraza urmeaza deplasarea catenei matrita astfel incat transcriptul va ramane atasat la nivelul elicei duplexului;

b)    O a doua posibilitate, mult mai plauzibila, este aceea ca ARN se deplaseaza in linie dreapta o data ce ADN se roteste dedesubtul sau. In acest caz ARN nu se va rasuci in jurul ADN dar ADN va ramane suprarasucit in fata sa (luati in considerare plasarea degetului intre catrenele de ADN rasucit an acest model si inpingand catre dreapta). Modelul presupune ca capetele ADN ca si ARN polimeraza sunt protejate de atasamente in interiorul celulei.

Diapozitiv 3.

Transcriptia a doua gene ribozomale contigue la E. coli

Figura: O micrografie electronica si o reprezentare schematica care prezinta doua gene supuse transcriptiei la E. coli.

Sagetile structurale rezultate o data cu cresterea lungimii lanturilor de ARN in formare o data ce moleculele de ARN polimeraza care le sintetizeaza pe acestea se deplaseaza de la situsul de initiere a transcriptiei catre situsul de terminare din structura ADN.

Diapozitiv 4

Micografie electronica a transcriptiei si translatiei simultane la E. coli

Figura: Micrografie electronica si reprezentare schematica a realizarii simultane a transcriptiei si translatiei unei gene de la E. Coli. Moleculele de ARN polimeraza transcriu ADN de la dreapta la stanga in timp ce ribozomii traduc moleculele de ARN an formare.

Diapozitiv 5

Figura: Structura determinata prin analize cu raze X a complexului format de actinomicina D si duplexul ADN la nivelul unei secvente complementare d(GAAGCTTC). Complexul este redat sub forma unui model cu bile in care structura catenei fosfat este prezentata in galben, bazele in alb, si actinomicina D este colorata in functie de tipurile de atomi: C in verde, N in albastru si O in rosu. Cele doua molecule de ADN cu simetrie inrudita sunt prezentate vertical pentru a forma un pseudo-continuu helix. Actinomicina D se leaga la nivelu fosei mari a ADN. Actinomicina D este un agent antineoplazic (anticancer) care este produs de catre Streptomyces antibioticus, inhiba puternic transcriptia si replicarea ADN probabil prin interferenta cu trecerea ARN si ADN polimerazei.

Diapozitiv 6

Terminarea Transcriptiei

Ø     Exista mai multe mecanisme care regleaza terminarea transcriptiei la bacterii si celule eucariote

Ø     La bacterii principalele mecanisme implica ARN polimeraza, unul dintre mecanisme necesitand si factorul de terminare Rho

Ø     La eucariote, mecanismele pentru terminarea transcriptiei difera pentru cele trei tipuri de ARN polimeraze

Terminarea transcriptiei ADNr

Deoarece transcriptii pre-ARNr se termina in apropierea (proximitatea) sau exact la

extremitatea 3' a secventei ARNr 28S, s-a crezut mai intai ca aceasta regiune continea unu teminator recunoscut de ARN polimeraza I. Experientele ulterioare au demonstrat ca transcriptia, in vitro, a genelor care codifica ARNr continua dincolo de extremitatea 3' a ARNr 28S matur. La Xenopus, transcriptia se realizeaza dincolo de regiunea care contine separatorul intragenic, si se termina la aproximativ 200 pb in amont de inima promotorului pre-ARNr 35S urmator; o clivare endonucleotidica realizata dincolo de extremitatea ARNr 28S formeaza extremitatea 3'. La drojdii, transcriptii care incep la nivelul inimii promotorului, se termina la nivelul separatorului intergenic, dincolo de ARNr 5S si la 300 pb in amont de inceperea secventei pre-ARNr urmator.

La ADNr de soarece, terminarea transcriptiei are loc intre 550 si 600 pb dincolo de

extremitatea 3' a ADNr 28S. Semnalul de terminare a acestui sistem este o secventa foarte conservata pozitionata pe catena sens (5'-AGGTCGACCAATTANTCCG-3'numita cutia SalI) si precedata, in general, de unul sau mai multe grupe de pirimidine bogate in timina (T). Se gasesc 8 grupe de acest tip intre perechile de baze 500 si 1 200 plecand de la extremitatea 3' a ADNr 28S (figura 8.16), dar in general terminarea se realizeaza in grupul T care precede cutia Sal I. Secventa conservata de 18 pb poate ea insati sa determine terminarea, dar aceasta este mai eficienta si mai precisa cand cele 18 pb sunt precedate si urmate de grupuri (fragmente) bogate in T. Deletii mici si insertii sau numai schimbarea unor perechi de baze la nivelul segmentului de 18 pb, la fel ca si inversarea sa , duc la pierderea activitatii sale de terminator. Se considera ca un aranjament destul de asemanator de secvente repetitive conservate (5'- GGGTTGACCA-3') furnizeaza probabil semnalul de terminare a pre-ARNr la om. Secvente repetitive conservate (5'-GACTTGC-3' precedate de grupari de T) exista in separatorii intergenici de la Xenopus, terminarea realizandu-se cel mai adesea la nivelul secventei repetitive care precede promotorul situat la extremitatea 3' a regiunii separatoare.

Exista argumente indirecte care sugereaza ca terminarea la nivelul acestor situsuri

depinde de fixarea unor proteine pe aceste situsuri specifice. Aceste indicatii au fost confirmate prin demonstratia ca unul sau mai multi factori proteici din extractul nuclear se fixeaza de secventa de 18 pb. In acest caz, fixarea proteinei la secventa de terminare a fost evidentiata de protectia fata de digestie cu endonucleaza III a unui fragment marcat la 5' si care continea acest semnal (figura 8.17). Principiul acestei experiente este ca digestia enzimatica a unui segment este oprita de proteina legata. Trebuie sa ne amintim ca endonucleaza III digera ADN bicatenar pornind de la extremitatile 3' (tabel 4.1). In aceste conditii vor rezulta fibre marcate in 5', care vor avea lungimea determinata de locul in care digestia a fost blocata de proteina legata. Cum fiecare catena poate fi marcata independent la capatul sau 5', se vor putea determina cele doua limite ale secventei blocate. In figura 8.18 este redat experimentul realizat cu doua segmente care contineau secvente de terminare probabile (cutiile Sal I si secventele vecine cuprinse intre 583 si 685 in aval de extremitatea 3' a ADNr 28S). Se constata ca profilul fragmentelor obtinute in urma digestiei cu exonucleaza III este alterat de o incubare prealabila in prezenta unui extract nuclear. Alterarea profilului de digestie indica ca o proteina (sau proteine) se leaga la secventa cutiei Sal I. Modificari la nivelul secventei cutiei Sal I sau modificarea distantelor intre cele doua secvente mai conservate impiedica legarea si afecteaza terminarea. In plus, daca un oligonucleotid corespunzator secventei consens a cutiei Sal I, este introdus intr-o unitate de transcriptie a ARN polimerazei I, acesta favorizeaza, in vitro, terminarea transcriptiei. Proteina care se leaga la cutia Sal I a fost purificata si mecanismul sau de actiune cunoscut (este in curs de deslusire).

Cuplarea terminarii si initierii transcriptiei

O caracteristica originala a secventelor de terminare este ca acestea sunt adese situate imediat in amont de promotorii gene care codifica pentru ARNr urmator (figura 8.19). Astfel de secvente de terminare au fost detectate la aproximativ - 170 pb in raport cu demararea transcriptiei ADNr de la soarece, la - 185 in amont de regiunea control a ADNr de la om si la - 200 in amont de regiunea control a ADNr de Xenopus. O curiozitate o reprezinta faptul ca eliminarea sau modificarea acestor secvente de terminare provoaca o reducere marcanta a transcriptiei care demareaza la pozitia + 1 a nucleului promotor urmator. Initial, s-a presupus ca un factor de terminare putea sa reactioneze cu un factor de initiere sau cu ARN polimeraza I, sau ca activarea putea fi rezultatul localizarii favorabile a enzimei la nivelul unor situsuri de juxtapunere apropiate promotorului ADNr. O alta explicatie este ca terminarea impiedica polimerazele ocupate cu transcrierea sa se rupa complet de complexele de transcriptie care sunt asamblate in imediata vecinatate a urmatorului promotor.

Numeroase intrebari s-au pus privind transcriptia genelor de ARNr, in particular in ceea ce priveste coordonarea expresiei acestor gene care codifica pentru ARNr, ARNr 5S si proteinele ribozomale. Implicatiile mecanice si reglatoare ale prezentei elementelor promotoare, activatoare si de terminare intr-o regiune considerata inainte ca silentioasa sunt de-a dreptul tulburatoare. Aceste descoperiri pun de asemenea problema cunoasterii modalitatilor de coordonare a terminarii si initierii transcriptiei si a proprietatilor expresiei genelor din clasele II si III. Din punct de vedere biochimic este importanta izolarea si caracterizarea factorilor de transcriptie si de terminare astfel incat sa fie posibila descifrarea completa a modului de actiune a acestora pe baze moleculare.

Terminarea transcriptiei de catre ARN polimeraza III

Daca initierea transcriptiei de catre ARN polimeraza III necesita secvente de reglare complexe si mai multe proteine, terminarea nu necesita decat enzima si un grup de resturi dezoxiadenilate la nivelul matricei. Terminarea este realizata perfect in vitro cu o ARN polimeraza III inalt purificata si cu o matrice de ADN duplex. O terminare corecta si eficace se realizeaza chiar pentru genele din clasa III lipsite de RCI, eliminand astfel ipoteza ca asocierea matritei cu TFIII A, B sau C pot juca un rol in procesul de terminare. Au fost utilizate matrite de transcriptie formate din ADN clonat special pentru a incerca definirea semnalului de terminare. Aceste experiente au demonstrat ca terminarea depinde de existenta unui numar de resturi dezoxiadenilate grupate pe catenele matricei si de secventele situate de o parte si de alta a acestui grup (tabel 8.2). De exemplu, patru dezoxiadenozine inconjurate de dezoxitimidina nu determina terminarea eficace dar patru dezoxiadenozine flancate de o parte de CG si de cealalta parte de GC (5'-GCAAAACG-3'), ca in ADNr 5S din celulele somatice de Xenopus borealis, sunt un semnal de terminare eficace. Mutatiile care modifica numarul de resturi adenilate reduc eficacitatea terminarii. Sinteza ARN se opreste la nivelul unui rest uridilat complementar unei adenine din grup. In acest caz nu par sa existe influente asupra terminarii nici din partea unor secvente departate si nici a unor secvente secundare. Daca extremitatea 3' a ADNr 5S este eliminata din gena clonata, transcriptia este continuata pana cand polimeraza III intalneste un semnal adecvat in secventa flancanta a vectorului. Daca o serie de dezoxiadenozine este inserata la un situs incorect din structura matricei unei gene din clasa III, terminarea se realizeaza adesea la acest situs modificat.

Diapozitiv 7. Secventa ipotetica de baze care formeaza un terminator eficient la E. coli

Figura: Secventa de baza a unui element ipotetic puternic (eficient) a terminatorului de la E. Coli dedusa din secventa mai multor transcripti.

a)     Secventa ADN impreuna cu ARN-ul sau corespunzator. Secventele bogate in A-T si G-C sunt prezentate in albastru si rosu. Axa de simetria de pliere evidentiaza segmentele care flankeaza segmentele care formeaza o repetitie inversa.

b)    Structura sun forma de "ac de par" si coada poli A care dirijeaza terminarea transcriptiei.

Diapozitiv 8. Terminarea Rho-independenta apare la nivelul unor secvente caracteristice ale ADN din E. coli

Figura: Secventa de terminare a operonului triptofanului trp, un situs independent Rho.

Operonul triptofan, compus din cinci gene (in albastru), este urmat de o secventa de 36 pb la capatul careia apare terminarea. Capatul 3' al ARNm corespunzator la care apare terminarea. Capatul 3' al ARNm corespunyator preyinta o structura sub forma de bucla bogata in GC care precede ultimile patru resturi U, o trasatura caracteristica a ARNm produs de gene cu situsuri de terminare Rho independente. In general, situsurile de terminare bacteriene apar intre operoni dar nu intre gene din interiorul unui operon. Din acest motiv, genele din interiorul unui operon pot fi reglate coordonat, in timp ce cele din diferiti operoni sunt reglate independent

Diapozitiv 9. Terminarea prematura prin atenuare ajuta la reglarea expresiei unor operoni bacterieni

Figura: Atenuarea furnizeaza un mecanism secundar de control a expresiei operonului Trp

Secventa Leader (L), care este localizata intre operator (O) si prima gena structurala (E). Contine un situs atenuator (banda rosie) la care transcriptia este terminata in functie de concentratia citosolica a triptofanului. Regiunea promotor-operator-leader, care are o lungime de aproximativ 200 pb, nu este reprezentata la scara cu genele structurale. AUG indica codonii start pentru translocarea secventei leader (rosu) si aARNm pentru trpE (negru).

Diapozitiv 10. Mecanismul de atenuare pentru transcriptia operonului trp

Figura: Mecanismul de atenuare a transcriptiei operonului trp

a)     Diagrama celor 140 nucleotide ale ARN trp leader. Patru regiuni prezentate in culori pot forma structuri sub forma de bucla alternative, numai una dintre acestea putand duce la atenuare.

b)    Translatia secventei trp leader incepe de la capatul 5' imediat dupa ce acesta este sintetizat, in timp ce este realizata sinteza restului moleculei ARNm trp. La concentratii crescute de trp, formarea buclei stem 3-4 urmata de o serie de resturi U in 3' determina terminarea printr-un mecanism Rho-independent. La concentratii scazute de Trp, regiunea 3' este sechestrata in bucla stem 2-3 si nu se poate imperechea cu regiunea 4. In absenta structurii sub forma de bucla necesara pentru terminare, transcriptia secventelor care codifica trp continua.   

Diapozitiv 11. Siturile pentru terminarea Rho dependenta sunt prezente in unele gene ale fagului l si ale E. coli

Ø     Factorul Rho factor este o proteina hexamera dispusa de-a lungul unui segment de baze al transcriptului ARN in formare

Ø     Rho aluneca apoi de-a lungul ARN in directia 3¢ pana cand acesta desface hibridul ARN-ADN de la nivelul situsului activ al ARN polimerazei

Ø     Daca transcriptia este terminata sau daca nu depinde de factorul Rho, acesta se elibereaza de pe ARN polimeraza

Ø     ]Siturile Rho dependente nu poseda secvente consens clare si mecanismul de terminare Rho dependent este caracteristic numai catorva operoni

Diapozitiv 12. Cele 3 ARN polimerazele folosesc diferite mecanisme de terminare

Ø     ARN polimeraza I realizeaza terminarea printr-un mecanism care necesita factori specifici de terminare care se leaga in aval de unitatea de transcriptie

Ø     ARN polimeraza II contine semnalul de terminare la nivelul unei regiuni de 0.5-2 kb apartinand situsului de adaugare a cozii poli(A), iar terminarea este cuplata cu procesul care cliveaza si poliadenileaza capatul 3¢ al transcriptului

Ø     Transcriptia realizata de catre ARN polimeraza III este terminata dupa adaugarea unei serii de resturi U

Desi se cunoaste foarte putin despre terminarea transcriptiei la eucariote comparativ cu bacteriile, cateva trasaturi de baza si similitudinile lor cu aceasta dar si diferentele fata de terminarea de la bacterii este inteleasa.

Transcriptia genelor pre-ARNr de catre ARN polimeraza I este terminata printr-un mecanism care necesita un factor de terminare specific polimerazei. Aceasta proteina de legare la ADN se poziutioneaza in aval de unitatea de transcriptie, diferit de modul de legare a factorului Rho de la E. Coli, care este un factor de terminare care se leaga la ARN.

ARN polimeraza III purificata realizeaza terminarea dupa polimerizarea unei serii de U; spre deosebire de terminarea Rho independenta de la bacterii, totusi, terminarea realizata de ARN polimeraza III nu necesita o structura secundara sub forma de bucla stem situata in amonte in structura transcriptului ARN.

La majoritatea genelor de mamifere care codifica pentru proteine, ARN polimeraza II poate termina la situsuri multiple localizate la nivelul unei regiuni de 0,5-2 kb apartinand situsului de agaugare a cozii poli(A). Experimentele cu gene mutante demonstreaza ca terminarea cu procesul care cliveaza si poliadenileaza transcriptul ARNm in formare la nivelul unor secvente specifice asociate cu domeniul fosforilat carboxil terminal (elementele/domeniul CTD) ale ARN polimerazei dupa initiere. Acest complex de clivare/poliadenilare pot suprima terminarea cat timp secventa care semnalizeaza scindarea si poliadenilarea este transcrisa de catre polimeraza. Studii pe mutantii de drojdii indica ca scindarea transcriptului in formare, mai mult decat poliadenilarea, reprezinta un eveniment critic care semnaleaza ARN polimerazei sa termine.

Asa cum am discutat anterior terminarea transcriptiei la bacterii poate fi reglata prin atenuare si prin mecanisme de antiterminare. Mecanisme analoge de control, care implica o decizie intre elongarea catenei si terminare apar la unele gene transcrise de catre ARN polimeraza II

Diapozitiv 13. Secvente la nivelul carora ARN polimeraza III termina transcriptia

Diapozitiv 14. Transcriptia genomului virusului HIV este reglata printr-un mecanism de antiterminare

Figura: Complexul de antiterminare compus din proteina HIV tat si multe proteine celulare eucariote

Elementul TAR al transcriptului HIV contine secvente recunoscute de catre Tat si proteina celulara ciclina T. Ciclina T activeaza si ajuta pozitionarea Cdk9, o protein kinaza, langa substratul sau, domeniul CTD al ARN polimerazei II.

Transcriptia virusului HIV este reglata printr-un mecanism de antiterminare

Curent, transcriptia genomului virusului imunodeficientei (HIV) de catre ARN polimeraza II furnizeaza cel mai bine inteles exemplu de reglare a terminarii transcriptiei la eucariote. Exprimarea eficienta a genelor HIV necesita a mica proteina virala codificata de locusul tat. Celulele infectate cu mutanti tat- produc transcripti virali scurti care hibridizeaza cu fragmente de restrictie care contin regiuniule proximale promotorului ADN HIV dar nu si cu fragmentele de restrictie pozitionate mai departe in aval fata de promotor. In contrast, celulele infectate cu tipul salbatic HIV sintetizeaza transcripti lungi care hibridizeaza cu fragmente de restrictie corespunzatoare intregii si singurei unitati de transcriptie HIV. Astfel, proteina tat functioneaza ca un factor antiterminator, care permite ARN polimerazei II sa citeasca de-a lungul unui bloc transcriptional, mai mult decat proteina N a fagului lambda. Deoarece mecanismul de antiterminare coordonat de proteina tat este necesar pentru replicarea HIV, intelegerea in viitoar a acestui mecanism de control poate oferi posibilitati de determinare efectiva a unor terapii pentru rezolvarea sindromului de imunodeficienta dobandita (AIDS, Acquired immunodeficiency sindrom)

Asemeni proteinei N, proteina Tat este o proteina care se leaga la o secventa specifica din structura ARN. Ea se leaga la o copie ARN a unei secvente numite TAR, care este localizata langa capatul 5' al transcriptului HIV. Cati secventa mut din transcriptii lambda, TAR contine doua situsuri de legare: unul care interactioneaza cu Tat si unul care interactioneaza cu o proteina celulara numita ciclina T. Structurile secundare ale mut si TAR, inclus amandoua o bucla stem, sunt analoge si trebuie sa fie intacte pentru ca sa se produca legarea proteinei. Mai mult, domeniul de legare la ARN al Tat, ca si cel al proteinei N, contine o regiune bogata in arginina.

Asa cum putem vedea an figura, proteina Tat a virusului HIV si ciclina T celulara se leaga cooperativ la ARN TAR. Interactia ciclinei T cu o protein kinaza numita Cdks9 activeaza kinaza, al carei substrat este domeniul CTD al ARN polimerazei II.

(Ciclinele sunt familii de proteine omologe care se leaga si regleaza kinazele dependente de cicline, sau Cdk. Functia importanta a ciclinelor si a moleculelor Cdk este reglarea diviziunii celulare).

Studiile de transcriptie in vitro folosind inhibitori sapecifici ai Cdk9 sugereaza ca moleculele de ARN polimeraza II care initiaza transcriptia la nivelul promotorului HIV termina dupa transcrierea a aproximativ 50 de baze , numai daca CTD este hiperfosforilata de Cdk9. Legarea cooperativa a ciclinei T si a Tat la secventa TAR la capatul 5' al transcriptului HIV pozitioneaza Cdk9 astfel incat aceasta poate fosforila domeniul CTD, prevenind astfel terminarea si permitand polimerazei sa continue elongarea lantului.

De remarcat ca, Spt5 una dintre proteinele complexului ciclinei T-Cdk9, poseda o regiune a sec<ventei de aminoacizi omologa cu NusG, una dintre proteinele implicate in procesul de antiterminare dirijat de proteina N al bacteriofagului lambda. Aceasta omologie sugereaza ca aceste similitudini in medcanismul de reglare a elongarii de la bacterii la animale.

Diapozitiv 15. Procesarea ARNm de la eucariote

Figura: Schema generala a procesarii ARNm la eucariote

La putin timp dupa initierea transcriptiei de catre ARN polimeraza II la primul nucleotid al primului exon al unei gene, la capatul 5 al moleculei ARN in formare se aduga 7-metilguanina: Transcriptia realizata de catre ARN polimeraza II se termina la unul sau mai multe situsuri de terminare situate in aval de situsul poli(A), care este localizat la capatul 3' al exonului final. Dupa ce transcriptul primar este scindat la nivelul situsului poli(A), se adauga o prelungire formata din A. Coada poli(A) contine aproximativ 250 resturi la mamifere, 150 la insecte si 100 la drojdii. Pentru transcriptii primari cu putini introni, poliadenilarea, clivarea si splicingul urmeaza de obicei terminarea. Pentru genele mari, cu un numar mare de introni, intronii sunt adesea inlaturati din pre-ARNm in formare inainte ca transcriptia genei sa fie completa. De retinut ca "capisonul" ramane in moleculele de ARNm mature.

Din cursul anterior

Terminarea transcriptiei si poliadenilarea

Transcriptia a numeroase gene eucariote se continua dincolo de locul in care ARN este clivat pentru a se forma extremitatea 3' a ARNm matur. Terminarea are loc la situsuri diferite care se intind pe sute sau chiar mii de perechi de baze ADN. Astfel, regiunea in care se opreste transcriptia b-globinei la vertebrate este situata la mai mult de 1 kpb de situsul de poliadenilare. La fel, transcriptia primelor doua gene in tandem ale a-globulinei de la mamifere se opreste in regiunea de separare de aproximativ 2 kpb care separa cele doua gene. Un exemplu si mai frapant este furnizat de transcriptia regiunii tardive a adenovirusurilor. In acest caz, transcriptia continua dincolo de cele cinci situsuri de poliadenilare inainte de a se termina la capatul ADN viral.

Din contra, anumite gene eucariote par sa aiba un semnal autentic semnal de terminare a transcriptiei. De exemplu, in gena gastrinei umane, semnalul de terminare este situat la 193 pb in aval de situsul de poliadenilare. Aceasta secventa, care dicteaza terminarea transcriptiei, atat in vivo cat si in vitro, este un segment bogat in T, 5'-T9A2T5AT4AT4AT5-3'. Transcriptia unui ADN care poseda aceasta secventa undeva de-a lungul secventei sale se termina exact in 5' de acest semnal. O secventa similara, dar cu cateva diferente, este prezenta in amont si in aval la mai multe gene de vertebrate. Acest semnal care se presupune a fi de terminare si anumite secvente bogate in T din genele de drojdii, 5'-CAATCTTG-3' si 5'- T5ATA-3', amintesc semnalele de terminare dependente de r dependente de la E. coli.

Independent de prezenta semnalelor specifice de terminare, transcriptia depaseste aproape intotdeauna situsurile de poliadenilare. In consecinta, extremitatile 3' poliadenilate trebuie sa fie create prin clivare endonucleotidica urmata de polimerizarea de resturi adenilate la nivelul hidroxilului 3' astfel format. Pentru determinarea situsului de clivare sunt necesare doua secvente situate la distanta mica. Una dintre acestea cvasi-invarianta, AATAAA, este localizata intre 10 si 30 pb in amont de un nucleotid CA in apropierea situsului de clivare-poliadenilare. Inlocuirea lui T cu G in AATAAA reduce puternic eficacitatea poliadenilarii dar cele cateva extremitati formate sunt poliadenilate. Inlocuirea ultimului A din secventa cu G la capatul primei gene din tandemul celor doua care codifica pentru a-globulinei reduce producerea normala a a-globulinei. Aceasta experienta, la fel ca si altele, indica necesitatea absoluta a secventei AATAAA. Totusi, deoarece secventa AATAAA exista si in regiunea codanta a numeroase gene, unde nu exista poliadenilare, este evident necesara o a doua secventa pentru a provoca reactiile de clivare si de poliadenilare. Localizarea acestui semnal a fost studiata examinand efectul deletiilor situate in vecinatatea situsului de poliadenilare. Experientele demonstreaza ca secventa si pozitia precisa a acestui semnal variaza de la o gena la alta. In numeroase gene de vertebrate semnalul cel mai probabil este un segment bogat in GT sau T, 5'- YGTGTGYY (Y fiind o pirimidina), situat cam la 25 pb in aval de situsul de poliadenilare si adesea urmat la o distanta variabila de o scurta secventa de T (figura 8.22).

In anumite circumstante situsurile autentice de poliadenilare pot sa nu fie efective. In maturarea ARNm tardiv al adenovirusului de tip 2, un singur situs de poliadenilare din cinci potentiale este utilizat pentru producerea fiecaruia din transcriptii primari (figura 8.23). Abundenta relativa a celor cinci clase de ARNm tardiv la adenovirus reflecta, in parte, frecventa cu care transcriptul primar este clivat si poliadenilat la unul din situsurile sale caracteristice. In acest caz, abundenta relativa a moleculelor de ARNm produse plecand de la transcriptul primar de modifica in cursul infectiei, indicand ca alegerea situsului de poliadenilare este controlata. Un al doilea exemplu este cel de trecere de la producerea formei membranare la cea a formei secretate in cazul imunoglobulinelor (figura 10.72). Aceste doua forme difera printr-o regiune a lanturilor lor grele. In acest caz poliadenilarea pre-ARNm la prima pereche de semnale, cea care este folosita pentru formarea ARNm care codifica forma secretata, este suprimata; molecula de ARNm este taiata la semnalul urmator producand un pre-ARNm care poate fi maturat pentru a da nastere ARNm care codifica forma membranara. Deci, trecerea de la forma membranara la forma secretata rezulta din utilizarea reglarii diferentiale a reactiei de poliadenilare. Fenomenul si modalitatile sale de control nu sunt deplin elucidate.

Secventa AATAAA a fost implicata si in terminarea transcriptiei. Aceasta secventa situata la extremitatea 3' a secventei codante a b-globinei majore de soarece este necesara pentru terminarea care se realizeaza la o distanta de 1,5 kb. In plus, aceleasi deletii si modificari care blocheaza poliadenilarea corecta reduc si eficacitatea cu care se realizeaza terminarea in aval. Aceasta sugereaza ca recunoasterea situsului de poliadenilare trebuie sa se realizeze inainte de terminarea transcriptiei la secventa adecvata situata in aval. Ipoteza prin care considera ca complexul de transcriptie nu achizitioneaza capacitatea de a realiza terminarea transcriptiei decat dupa cea realizat transcrierea semnalului de poliadenilare constituie o modalitate interesanta de a asocia poliadenilarea si terminarea. Ea poate fi valabila in cazul in care complexul de transcriptie ar contine un factor care ar putea impiedica terminarile inoportune in timpul transcriptiei matricei si l-ar pierde pe acesta la trecerea peste semnalul de poliadenilare (figura 8.24). Daca lucrurile s-ar petrece astfel, complexul de transcriptie lipsit de acest factor s-ar putea desprinde de matrice la nivelul secventei bogate in T pe care o intalneste in continuare. Acest model este urmarea studiilor realizate in vitro cu ARN polimeraza II purificata, care demonstreaza ca transcriptia mai multor tipuri de matrice ADN se termina frecvent la nivelul secventelor bogate in T prezente in gena. Este posibil ca clivarea transcriptului la semnalul de poliadenilare sa permita unei ARN nucleaze sau unei proteine de tip r sa se fixeze la polimeraza si sa induca terminarea la nivelul secventei bogate in T prezenta in aval (figura 3.12).

Clivarea si poliadenilarea se pot realiza in diferite tipuri de extracte celulare singura conditie fiind ca acestea sa posede moleculele ARN substrat purtatoare de semnale adecvate. Studiile realizate in vitro cu astfel de sisteme au clarificat diferite aspecte ale acestor reactii. Astfel, clivarea si poliadenilarea se pot realiza independent una de cealalta. In prezenta unor analogi ai ATP (ex. cordicepina, care este 3' dezoxiadenozin trifosfat), taierea (ruperea) se realizeaza la situsul exact dar nu este urmata de poliadenilare. Poliadenilarea se poate realiza la nivelul radicalului oxidril din 3' terminala care este precedata de o secventa AAUAA. Fractionarea unui extract de celule Hela care au capacitate de clivare si de poliadenilare a unui substrat ARN furnizeaza multe fractii proteice care, impreuna, catalizeaza aceste doua reactii. Una dintre componente este o poli A polimeraza, o alta fractie contine una sau mai multe particule ribonucleoproteice nucleare mici (snRNP) si cea de a treia este o proteina (64 kD) care se leaga la o regiune care contine secventa AAUAAA. Acesti trei factori sunt necesari pentru a asigura cuplarea clivarii cu poliadenilarea, in conditiile in care singura, poli A polimeraza poate realiza poliadenilarea unei catene de ARN clivata corect. Cu toate ca mecanismul nu este pe deplin elucidat se poate considera ca snRNP U11 impreuna cu proteina 64 kD si probabil cu alte snRNP pot forma un complex in imediata vecinatate a secventei AAUAAA care asigura clivarea ARN si permit o poliadenilare corespunzatoare. Implicarea snRNP se bazeaza pe descoperirea unor fragmente care contin secventa AAUAAA in imunoprecipitalelor obtinute cu anticorpi anti snRNP si pe inhibarea poliadenilarii, in vitro, realizata de acesti anticorpi. Rolul snRNP in poliadenilare este coerent in maturarea ARN: U7 snRNP este implicata in crearea extremitatilor 3' ale ARNm de histone, U3 snRNP in producerea extremitatii corecte a ARNr 28S si U1, U2, U5 SI U4/U6 in maturarea pre-ARNm. Cum genelor de la drojdii si probabil de la celelalte eucariote inferioare le lipsesc semnalul canonic de poliadenilare, AAUAAA, formarea cozii poli A poate fi cuplata cu terminarea transcrierii. Secvente ca 5'-T5ATAT, care favorizeaza terminarea, pot fi utile in crearea extremitatii 3' necesare poliadenilarii. Formarea extremitatii 3' poate fi si rezultatul clivarii endonucleotidice a unui trancript mai lung urmata de poliadenilarea realizata de poli A polimeraza. Nu s-a stabilit inca daca la drojdii intervin snRNP.

Diapozitiv 16. *Procesarea post-transcriptionala. Formarea "coifului" ARNm de la eucariote

Figura: Structura "capului" la ARNm eucariot. Acesta este prezentat drept cap 0, cap 1 sau cap 3 daca nu prezinta alte modificari ulterioare in functie de pozitia de metilare a nucleozidului (in O2'), sau daca primele doua nucleozide sunt O2' metilate.

Din cursul anterior

Coiful

In afara de o exceptie cunoscuta (ARNm de la picornavirus) toate moleculele de ARNm de la eucariote, celulare si virale, poseda un coif la extremitatea 5'. Coifurile transcriptilor nucleari si citoplasmatici ai polimerazei II sunt asociate cu proteine care se leaga specific. Pentru moment rolurile acestor proteine si ale coifului nu sunt deplin clarificate. S-a stabilit totusi ca coiful interactioneaza specific cu factorii de initiere in asamblarea complexului de traducere.

Formarea coifului la extremitatea 5' a transcriptilor polimerazei II are loc imediat dupa initiere; chiar si moleculele de ARN cele mai scurte poseda acest coif. Unul dintre substratele enzimei care realizeaza adaugarea coifului (guanil transferaza) este GTP; celalalt este extremitatea difosfat creata prin eliminarea fosfatului terminal al trifosfatului primului nucleotid al ARN in formare (figura 8.21). In reactia de adaugare a coifului, fosfatul terminal al pre-ARNm este inlocuit cu gruparea guanil a GTP cu pierderea a doi fosfati terminali din GTP. Nu se poate realiza reactia daca pre-ARNm nu poseda decat un monofosfat 5' terminal. Astfel coifurile marcheaza primul nucleotid la nivelul caruia incepe transcriptia. Restul de guanidina adaugat este metilat in pozitia 7 a ciclului purinei de catre guanin-7-metil transferaza; radicalii hidroxil 2' ai primelor doua nucleotide sunt apoi metilati de catre 2'-O-metil transferaza. Gruparea 7-metil-GTP nu poate constitui substrat pentru reactia de adaugare a coifului. Moleculelor ARN U sunt li se adauga coiful in acelasi mod; dar in aceste caz metilarile ulterioare furnizeaza 2, 2' -7-trimetil guanozina la fel ca si substituentii 2'-O-metil prezenti la primele nucleotide ale transcriptului. Deoarece moleculelor de pre-ARNm formate in extractul celular, sau cu ARN polimeraza II purificata li se adauga coiful corect, activitatile enzimatice responsabile sunt probabil asociate polimerazei. Reactiile de initiere ale procesului de adaugare a coifului realizate de catre polimeraza II sunt probabil cuplate obligatoriu deoarece transcriptii nucleari formati de catre ARN polimeraza III, care poseda o extremitate trifosfat (ex. ARN U6, ARNr 5S si pre-ARNt), nu sufera procesul de adaugare a coifului. Ne intrebam care sunt parametrii care determina diferitele tipuri de coifuri ale pre-ARNm si pre-ARN U.

Rolul coifurilor in timpul transcriptiei si maturarii transcriptilor primari in ARNm nu este clar. De exemplu, rezultatele obtinute privind implicarea coifului in maturare sunt contradictorii. Este posibil ca coiful sa aiba un rol in formarea complexelor nucleare de ribonucleoproteine (nRNP) in care moleculele de pre-ARNm sunt sechestrate in timpul transportului ARNm in afara nucleului sau in asamblarea particulelor ribonucleoproteice citoplasmatice (cRNP). Exista indicatii care sugereaza ca coifurile si proteinele asociate acestora asigura protectia moleculelor de ARNm de o degradare care ar putea sa demareze la extremitatea 5'. Mai bine stabilita este necesitatea coifului pentru atasarea ARNm de ribozomi inainte de demararea traducerii. Unul dintre factorii de initiere, eIF-4 E, este un factor de recunoastere specific coifului in timpul asocierii subunitatii 40S a ribozomului la extremitatea 5' a ARNm. Se considera ca eliminarea coifului unei molecule de ARNm impiedica traducerea sa in vivo. In vitro s-a dovedit ca moleculele de ARNm care nu poseda coif pot fi totusi traduse. Singura exceptie cunoscuta de la aceasta exigenta este ARN genomic de la picornavirus (de ex. . virusul polio) care functioneaza ca ARNm pentru toate proteinele codificate de virus. In plus, in celulele infectate de catre virusul polio se opreste sinteza proteinelor gazdei deoarece o proteina virala inactiveaza proteinele celulare legandu-se la nivelul coifului.

Diapozitiv 17. Capatul 5¢-cap este adaugat moleculei in formare dupa initierea transcriptiei de catre ARN polimeraza II

Figura: Adaugarea "coifului" la transcriptii ARNm in formare prin adaugarea 7'-metil citozina

Primele doua reactii sunt catalizate de o enzima responsabila de adaugarea coifului care se asociaza cu domeniul CTD al ARN polimerazei II la scurt timp dupa initierea transcriptiei. Doua metil-transferaze diferite catalizeaza reactiile 3 si 4. S-adenozin metionina (S-Ado-Met) este sursa de grupari metil (CH3) pentru cele doua etape de metilare; restul guanilat (G) este metilat primul, apoi hidroxilul din pozitia 2' al primului sau primelor doua nucleotide (N) din transcript.

Diapozitiv 18. Pre-ARNm este asociat cu proteine hnRNP care contin domenii conservate de legare a ARN

Figura: Vizualizarea hnRNP (heterogen nuclear ribonucleoproteine) asociate cu transcriptii in formare intr-un ovocit de la Nophthalmus viridescens (triton)

O portiune a cromozomului "in perie". ADN din axa cromozomului este colorat in alb cu colorantul specific pentru ADN, DAPI. Filamentele lungi rosii sunt transcripti in formare legati cu hnRNP, care prezinta fluorescenta rosie dupa colorarea cu un anticorp fata de proteine hnRNP.

Diapozitiv 19. Interactia unui motiv RNP la nivelul proteinei U1A si a ARN

Figura: Structura complexului format intre un motiv RNP format din proteina U1A si ARN

a)     Diagrama unui motiv al domeniului RNP. Regiunile conservate RNP1 si RNP2 sunt localizate in doua catene beta pozitionate in mijloc;

b)    Reprezentare a suprefetei complexului format din proteina U1a si ARN determinata prin cristalografie cu raze X. ARN formeaza a bucla stem cu portiunea monocatenara a buclei legata la suprafata proteinei. Capetele C si N terminale sunt orientate catre dreapt asi stanga. Aminoacizii acizi sunt colorati in rosu si albatru respectiv.

Diapozitiv 20. Proteinele hnRNP pot fi implicate in procesarea si transportul ARNm

Figura: Hibridizarea moleculelor de ARN in vitro accelerata de catre proteinele hnRNP.

Prezenta structurilor secundare complexe an structura moleculelor de ARN hibridizarea intre secventele lungi complementare din molecule separate. Asocierea dintre proteine hnRNP si ARN se considera ca previne formarea structurilor ARN secundare , facilitind astfel imperecherea diferitelor molecule complemtare. Aceste molecule pot avea functii similare in vivo.

Diapozitiv 21. Pre-ARNm sunt scindate la situsuri specifice 3¢ si rapid poliadenilate

Figura: Model de clivare si poliadenilare a ARNm in celulele de mamifere

Factorul specific de poliadenilare si clivare (CPSF) se leaga la o regiune in amonte AAUAAA de situsul de poliadenilare. CStF interactioneaza cu o secventp din aval bogata in GU sau U si cu CPSF legat, formand o bucla in ARN; legarea CFI si CFII ajuta stabilizarea complexului. Legarea poli(A) polimerazei (PAP) stimuleaza apoi clivarea la nivelul situsului poli(A), care este de obicei pozitionat la 10-35 nucleotide in 3' fata de semnalul de poliadenilare din aval. Factorii de clivare sunt eliberati, casi produsul de clivare din aval care este rapid degradat. Legarea PAP adauga apoi aproximativ 12 resturi A la o rata scazuta la gruparea hidroxil 3' generata prin reactia de clivare. Legarea proteinei de legare PABII (Poli(A) binding protein la coada poli(A) initiala scurta accelereaza rata de adaugare catalizata de PAP. Dupa adaugarea a 200-250 resturi, PABII semnalizeaza oprirea polimerizarii.

Diapozitiv 22. Etapa finala de maturare: intronii sunt inlaturati iar exonii sunt sudati impreuna

Figura: Demonstratie ca intronii sunt inlaturati prin electronomicroscopie asupra hibrizilor ADN-ARN formati de aovirusul ADN si ARNm carfe codifica hexon, o proteina virala majora.

Din cursul anterior

Secventele codante ale genelor eucariote (exonii) sunt frecvent intrerupti de catre regiuni necodante (intronii). Aceasta descoperire curioasa a ridicat numeroase intrebari fundamentale.

1) Unde, cand si cum au aparut intronii la nivelul genelor si care este rolul lor in evolutie ?

2) Cum transcriptii primari ai acestor gene mozaic sunt transformati in molecule ARN mature, lipsite de introni ?

3) Care este influenta procesului de excizie-epissage asupra reglarii expresiei genelor?

4) Care este functia, daca exista vreuna, intronilor in multitudinea operatiilor care

afecteaza genoamele contemporane. Sunt intronii vestigii ale evolutiei genelor si au vreun rol in viata organismelor contemporane.

Scopul nostru principal este de a expune ceea ce stim despre structura intronilor, despre mecanismele prin care acestia sunt eliminati si despre influenta procesului de maturare asupra expresiei genelor eucariote.

Roberts si Sharp au obtinut premiul Nobel pentru Fiziologie si Medicina in 1993, pentru descoperirea structurii discontinue a genelor.

Diapozitiv 23. *Electrono-micrografie care evidentiaza formarea hibridului pre-ARNm/ARNm

Figura: O micografie electronica si reprezentarea sa schematica privind formarea unui hibrid intre catena antisens a genei de ovalbumina de la pui (asa cum a fost obtinuta prin clonare moleculara) si ARNm corespunzator. Segmentele complementare ale ADN (linia punctata rosie) si ARNm (linia rosie) au fost anelate pentru a evidentia pozitia exonilor. Segmentele care formeaza bucle externe (I la VII), care nu au secvente suplimentare cu structura ARNm, sunt intronii.

Din cursul anterior - Frecventa intronilor

Frecventa genelor in mozaic variaza foarte mult in functie de speciile eucariote. Acestia sunt foarte frecventi la vegetale si la animale si la virusurile care le infecteaza. Intronii sunt mult mai rari in genele nevertebratelor (ex. Drosophila, nematodele si ariciul de mare). Totusi, mai multe gene care guverneaza morfogeneza la Drosophila (ex. grupele ultrabitorax si Antennapedia) prezinta aranjamente complexe de introni si exoni. Cea mai mare parte a genelor S. cerevisiae sunt lipsite de introni (genele pentru actina si pentru alte cateva molecule de ARNt sunt exceptii) dar genele mozaic sunt mult mai numeroase la o specie inrudita numita Schizosaccharomyces pombe. Cu toate ca intronii sunt rari in genele nucleare, ei sunt mult frecventi in genele mitocondriale ale acestei drojdii. La descoperirea lor s-a crezut ca genele mozaic sunt o caracteristica proprie genelor eucariote. Evidentierea lor in gena timidilat sintetazei bacteriofagului T4 a demonstrat ca aceasta idee era falsa. De atunci, au mai fost descoperiti introni si in gena care codifica ARNtSer si in gena pentru ARNr de la Archeobacterii, etc. Acum nu mai este surprinzator ca cercetari mult mai avansate evidentiaza alti introni in genele procariotelor . Au fost descoperiti introni si la anumite bacterii.

Intronii exista in genele nucleare care codifica pentru ARNm. ARNr (dar numai in genele lungi pentru ARNr de la eucariotele inferioare) si pentru un grup de gene care codifica ARNt. De asemenea, intronii sunt frecventi in genele mitocondriale si din cloroplaste, care codifica pentru moleculele ARN mesager, ribozomic si de transfer din aceste organite. Totusi, in genele mamiferelor unde prezenta intronilor este o regula, exista si exceptii. Cea mai mare parte a genelor pentru histone nu contin introni, ca si cele doua familii de gene care codifica pentru interferonii a si b, in timp ce gena pentru interferon g contine foarte multi (figura 8.2). Nu se cunosc inca exemple privind prezenta intronilor in genele pentru ARNr 5S si 5,8S si nici pentru ARN U, 7SL si 7SK.

 Diferite tipuri de introni

Toti intronii sunt transcrisi ca parti integrante ale moleculelor precursoare de ARN si sunt apoi eliminati printr-un proces de taiere-legare numit excizie-episaj. Structura si mecanismele de episaj stau la baza clasificarii diferitelor tipuri de introni (tabel 8.4)

Tabel . Secvente consens la nivelul a diferite tipuri de situsuri de episaj

Nota: Bazele sunt notate asa cum apar in structura ARN. Y reprezinta o pirimidina si indicele n indica un numar multiplu de pirimidine. R reprezinta o purina. Literele subliniate sunt bazele invariante si sagetile indica situsurile de taiere.

Diapozitiv 24. Secvente consens la nivelul a diferite tipuri de situsuri de "splicing"

Diapoyitiv 25. Splicing-ul" se produce la nivelul unor secvente conservate, scurte

Figura: Secventele consens din jurul situsurilor de "splicing" 5' si 3' din structura pre-ARNm de la vertebrate

Cu toate ca bazele 5(GU) si 3'(AG) sunt apoape invariante in structura intronului, totusi bazele care le flankeaza pe acestea sunt prezente la frecvente mai mari decat cele asteptate in cazul unei distributii aleatoare. O regiune bogata in pirimidina (albastru deschis) situata in apropierea capatului 3' al intronului este prezenta in majoritatea cazurilor. Punctul de ramificare adenozinic, de asemenea invariant este format de obicei de 20 la 50 baze in directia 3'. Regiunea centrala a intronului, care poate fi cuprinsa intre 40 pb si 50 kilobaze lungime nu este necesara procesului de spicing.

Din cursul anterior

Intronii genelor nucleare pentru ARNm

Intronii genelor nucleare care codifica pentru proteine, primii care au fost descoperiti, au o marime de la 10 pb la 10kpb. Intronii genelor omologe de la diferite specii de vertebrate pot sa difere prin lungime si secventa asemeni intronilor din genele neinrudite. Marimea exonilor pare sa se situeze in jurul valorilor de 52, 140, 223 si 229 pb, ultima fiind cea mai frecventa. Exista si situatii (rare) in care lungimea intronilor este de 15 la 30 pb sau de mai multe sute sau mii de pb. Caracteristicile cele mai comune ale intronilor sunt secventele din 5' (secvente situate in amont sau donatoare) si in 3' (in aval sau acceptoare) adica jonctiunile exon-intron sau situsurile de excizie-episaj.

Secventele nucleotidice ale fiecarei jonctiuni exon-intron sunt conservate remarcabil in aproape toate genele nucleare pentru ARNm la aproape toate speciile studiate (tabel 8.4). Secventa care flancheaza cel mai frecvent situsul de episaj din 5' este CRG (unde R reprezinta o purina), cea care formeaza capatul din 3' fiind adesea reprezentata de un singur G. Cele mai mari variatii se intalnesc in secventele care inconjoara intronii, insa mutatii la nivelul acestor situsuri nu impiedica niciodata episajul, chiar daca exista cazuri in care poate fi afectata viteza. Structurile cele mai putin variabile se gasesc in intron. Primele doua nucleotide ale extremitatii 5' ale intronului in ARN sunt aproape intotdeauna GU (GC in cazuri exceptionale); urmatoarele cinci nucleotide nu sunt invariabile, cu toate ca secventa AGAGU pare sa fie consensus. Modificarile lui nucleotidelor G sau U prezente la nivelul jonctiunii impiedica, in general, realizarea episajului, in timp ce modificarile pozitiilor adiacente afecteaza diferit episajul. Cele sase nucleotide de la extremitatea 5' a intronului sunt suficiente pentru situsul de episaj. Chiar si jonctiunile criptice (ascunse), care nu sunt folosite decat rar sau cand situsurile dominante sunt pierdute sau modificate, poseda secventa GU la extremitatea 5' a fragmentului care trebuie eliminat. Capatul 3' al intronului se termina invariabil prin AG, foarte adesea precedat, in intronii de mamifere, de o secventa bogata in pirimidina (YnNYAG). Si in acest caz mutatiile care inlocuiesc invariabilele A sau G printr-o alta baza impiedica episajul acestei jonctiuni.

Un rest A apropiat de extremitatea 3' a intronului este un participant esential la episajul moleculelor pre-ARNm. In intronii mamiferelor, pozitia acestui A nu este invariabila deoarece poate fi utilizat orice A dintre nucleotidele situate in pozitiile 18 la 37 in amont de situsul de episaj. Totusi, mutatii la nivelul secventei vecine acestui A (cel utilizat) provoaca o importanta diminuare a eficacitatii episajului in vitro; astfel, cu toate ca nucleotidul A esential nu apare intr-un context invariant, secventa vecina influenteaza folosirea sa. Din contra, in cazul moleculelor de pre-ARN nucleare de la drojdie, restul A este furnizat de un heptanucleotid , 5'-UACUAAC-3', situat intre nucleotidele 6 si 59 in amont de situsul de episaj.

Prezenta secventelor consensus ale situsurilor de excizie-episaj nu semnifica intotdeauna ca intronul poate fi excizat. In anumite cazuri, una sau doua secvente ale acestui situs sunt situate in exoni si in introni in locuri unde nu se produce in mod normal excizie-episaj. Totusi, astfel de situsuri criptice (ascunse) pot functiona in anumite circumstante (ex., cand situsurile autentice sunt modificate sau absente).

Ocazional, intronii poseda mai mult de o jonctiune 5' sau 3', permitand procese de excizie-episaj alternative. De exemplu, intr-o regiune precoce a SV40 sunt doi introni care au amandoi acelasi situs 3' dar jonctiunile 5' sunt diferite. Rezultatul acestor procese de episaj alternativ duc la formarea a doua molecule de ARNm plecand de la acelasi transcript primar. In anumite circumstante, alegerea episajului este reglata in timp in functie de tesut. Adesea, situsuri de episaj exista dar nu sunt folosite. Astfel, genoamele retrovirale provin din transcripti de ADN proviral care nu au suferit excizie-episaj, dar producerea de ARNm care codifica pentru anumite proteine virale necesita excizie. In acest caz acelasi transcript poate fi excizat sau nu.

Cum s-a mentionat anterior, intronii pot contine alte elemente genetice, cum sunt elementele activatoare (enhancers) ale altor gene, semnale de replicare si de impachetare a cromozomului sau secvente necesare asamblarii pre-ARNm in particulele ribonucleoproteice (RNP).

Diapozitiv 26. *Etapele procesului de producere a ARNm matur (gena ovalbuminei de pui)

Figura: Secventa etapelor de producere a ARNm eucariot asa cum se poate vedea pentru gena ovalbuminei de la pui. In urma transcriptiei, transcriptului primar a se adauga "capul" si "coada" poliA. Intronii sunt apoi excizati si exonii sudati impreuna pentru a forma structura ARNm matur.

Din cursul anterior

Splicingul intronilor moleculelor pre-ANRm nucleare

Studiul mecanismelor de splicing in cazul pre-ARNm nucleari a fost facilitat de existenta genelor mozaic clonate, si in particular a formelor modificate natural sau deliberat ale acestor gene. Substrate special preparate, prin fuziune de exoni si introni, au ajutat mult la identificarea structurilor necesare pentru un splicing fidel. Cea mai buna a fost insa abordarea biochimica, gratie folosirii de extracte celulare capabile sa realizeze splicing si de asemenea purificarea elementelor masinariei acestei reactii. Au fost utilizate substrate ARN purtatore de coif; acestea au fost obtinute prin transcrierea matritelor ADN special preparate, inserate in aval de promotorul fagului SP6 si utilizand ARN polimeraza specifica acestuia (figura 6.23).

Caracteristici generale

Splicingul pre-ARNm nucleari are loc in nucleu, in acelasi timp cu transcriptia pentru anumite gene sau dupa transcriptie pentru altele. Exista indicatii care sugereaza ca adaugarea coifului la extremitatea 5' a transcriptului are implicatii asupra procesului de maturare. Conceptual si practic, este foarte important sa se cunoasca cum o molecula pre-ARNm care contine mai multi introni poate fi maturata astfel incat exonii vecini sa poata fi asociati corect. Deoarece se stie ca situsul 5' al unui intron poate fi clivat in acelasi timp cu situsul 3' al altuia, este foarte important sa se inteleaga cum, in cursul unei reactii normale, acest lucru poate fi evitat pentru a se putea realiza un splicing alternativ.

Diapoyitiv 27. Analiza produsilor ARN formati intr-o reactie de "splicing" in vitro

Figura: Analiza produsilor ARN formati printr-o reactie de splicin "in vitro".

Un extract nuclear de celule Hela a fost incubat cu 497 nucleotide ARN radiomarcate (in partea de sus) care contin portiuni din doi exoni (rosu si roz) din ARNm pentru beta-globina separati de un intron de 130 nucleotide (albastru). Dupa incubare perioade diferite de timp, ARN a fost purificat si supus electroforezei si autoradiografiei in prezenta de markeri ARN (linia M). Este indicat numarul de nucleotide din diferite specii. Majoritatea moleculei initiale de care migreaza mai incet (497 b) a fost corect maturata copnducand la un produs de 367 nucleotide. Intronul excizat (aprox 130 b) migraza mai lent decat ne-am fi asteptat tinand cont de masa sa moleculara, indicand ca nu este o molecula lineara. De asenmenea, unul din intermediarii reactiei (339 b) manifesta o mobilitate electroforetica anormal de lenta. Analize suplimentare au indicat ca in ambele cazuri intronul nu este o molecula lineara ci op molecula sub formp de "laso". Banda de 252 b, un produa aberant in reactia in vitro este mult redusa in reactiile in care ARN poseda structura "cap".

 Din cursul anterior

Traseul reactiilor de splicing

In primul rand vor fi discutate etapele de clivare si de legare care constituie reactiile de splicing. Etapa initiala o constituie asamblarea unui complex de maturare (splicing). Primii produsi detectati in vitro sunt rezultatul clivarii la nivelul situsului de splicing 5': unul contine exonul 5', celalalt intronul si exonul 3' (figura 8.83). Cum pentru nici o specie de ARN nu s-a evidentiat o alterare a produsului clivat la nivelul situsului 3', inseamna ca taierea la nivelul situsului 5' trebuie sa preceada decuparea situsului 3'. O data ce reactia progreseaza se acumuleaza doi produsi: exonii asociati corect si intronul complet liber. Atat produsul clivarii initiale si intronul excizat contin o structura in 'loso' asemanatoare celei descrise pentru intronii mitocondriali de tip doi obtinuti prin auto-splicing (figura 8.83). Structura in laso a fost pentru prima data sugerata de mobilitatea electroforetica anormala a intronului eliberat, de incapacitatea sa de a servi drept matrita pentru realizarea unei transcriptii inverse pornind de la un punct apropiat de extremitatea 3' si de rezistenta acestuia la digestie completa cu mai multe ribonucleaze. Structura a fost apoi confirmata prin izolarea ribonucleotidelor punctului de ramificare (inchidere a lasoului). Acesta contine intotdeauna, indiferent de intronul eliberat, fosfatul 5' al guanozinei de la nivelul jonctiunii intronului asociata printr-o legatura diester cu hidroxilul din pozitia 2' al unei adenozine. A fost astfel explicata existenta neasteptata a unor molecule de ARN nuclear care posedau o ramificare pornind de la hidroxilul 2' al unui rest adenozil.

Diapozitiv 28. Mecanismul de "splicing" presupune doua reactii de transesterificare

Figura: "splicingul" exonilor din molecula pre-ARNm apare prin intermediul a doua reactii de transesterificare.

In prima reactie, legatura ester dintre griparea 5'-fosfat a intronului si oxigenul din 3' (rosu) al exonului 1 este schimbata pentru o legatura ester cu oxigenul 2' (albastru inchis) al restului A de ramificare. In cea de a doua reactie, legatura ester dintre fosforul din 5' al exenului 2 si oxigenul 3' (albastru deschis) al intronului este schimbata pentru o legatura cu oxigenul 3' al exonului 1, eleberand intronul sub forma unei structuri "in laso" si resudand cei doi exoni. Sagetile arata unde atomii de oxigen din gruparile hidroxil activare reactioneaza cu atomii de fosfor.

Diapozitiv 29. Secventa reactiilor de transesterificare implicare in unirea exonilor

Figura: Secventa reactiilor de transesterificare care aduc impreuna exonii moleculelor de pre-ARNm (exonii si intronii sunt desenati in albastru si portocaliu; R si Y reprezinta purina si pirimidina): 1) Gruparea 2'-OH a unui intron specific A ataca nucleofil gruparea 5'-fosfat de la capatul 5' al capatului intronilor pentru a ajunge la o structura sub forma de laso; 2) Gruparea 3'-OH eliberata formeaza o legatura 3'-5'-fosfodiester cu restul terminal 5' a exonului 3' , determinand astfel unirea celor doi exoni si eliberarea intronului sub forma de laso.

Diapozitiv 30. Moleculele de "small nuclear RNAs (snRNAs) asista reactia de "splicing

Figura: Diagrama interactiilor dintre pre-ARNm, U1ARNsn,.si U2ARNsn in procesul de splicing-ul timpuriu

Regiunea 5' a U1ARNsn initial imperecheate cu nucleotide la capatul 5' al intronului (albastru) si capatul 3' al exonului din 5' (rosu inchis) al pre-ARNm; U2ARNsn se imperecheaza cu o secventa care include punctul de ramificare A, desi acest rest nu este imperechiat. In figura este prezentata secventa punctului de ramificare de la drojdii. Structurile secundare ale ARNsn care nu sunt alterate in timpul "splicingului" sunt prezentate sunt forma de linii diagramate. Dreptunghiurile rosii reprezinta secvente care leaga proteine snRNP recunoscute de catre anticorpii anti-Sm. Din motive necunoscute, antiserurile de la pacienti cu boli autoimune sistemice cum este "lupus eritematos" (SLE) contin acesti anticorpi. Acesti anticorpi au fost utili in caracterizarea componentelor reactiilor de "splicing".

Diapozitiv 31. Spliceozomul - complex ribonucledoproteic compus din multe molecule de "snRNPs"

Figura: Micrografia eloectronica a unui "spliceozom"

Extractele din celulele HeLa au fost amestecate cu pre-ARNm pentru beta-globulina; reactia a fost intrerupta inainte ca "splicingul" sa fie complet, astfel incat sa poata fi purificat "spliceozomul" care contine RNPsn si pre-ARNm.

Din cursul anterior

Asamblarea spliceozomilor

Deoarece splicingul are loc la nivelul spliceozomilor apare necesitatea cunoasterii structurii, asamblarii si mecanismelor de actiune ale acestora. Particulele de splicing izolate dintr-un amestec de reactie in care clivarea in 3' a fost inhibata, sunt de forma elipsoidala si cu dimensiuni de 25 x 50 nm (figura 8,85). In particula, intronul este asociat fiecaruia dintre snRNP U1, U2, U4/U6 si U5. Spliceozomii functionali contin si alte proteine, si in particular pe cele care sunt implicate in legarea snRNP la tintele lor care sunt normal fixate pe structura pre-ARNm nuclear.

O secventa minimala a exonului este necesara legarii snRNP la intron. Dupa schema actuala de asamblare a spliceozomilor , se leaga primele particulele snRNP U1 la functiunea 5', chiar daca exista sau nu situsuri functionale pentru fixarea, in continuare, a snRNP U2 si U5 (figura 8.86); dar aceasta singura legatura este insuficienta pentru a provoca clivarea situsului 5'. Prima legare este apoi urmata de asocierea snRNP U2. U5 si U4/U6, asociere care necesita ATP. Legarea snRNP U2 la situsul sau de pe intron se bazeaza pe imperecherea de baze; in timp ce incorporarea complexului snRNP U4/U6 si U5 in spliceozom depinde de interactiile dintre snRNP. O schema asemanatoare este valabila pentru asamblarea particulelor de splicing pentru pre-ARNm de la drojdii. Dupa legarea exonilor evolutia spliceozomului este incerta, dar snRNP sau sub-ansamble ale acestora sunt probabil reciclate atunci cand ARN intronic este degradat. Acest mers al reactiilor reprezinta a secventa posibila dar nu obligatorie a asamblarii spliceozomilor. Pentru a fi mult mai siguri este necesara analiza relatiilor precursor-produs. Modelul nu explica cum se realizeaza clivarea situsului 3', cum se realizeaza legarea exonilor si nici de ce acesta este limitata la exonii adecvati.

Diapozitiv 32.Ciclul de actiune la nivelul spliceozomului

Figura: Ciclul de "splicing" al "sliceozomului"

RNPsn implicate in "splicing" (U1, U2, U4, U5 si U6) asociate cu pre-ARNm si intre ele intr-o anumita ordine secventiala in scopul formarii "spliceozomului". Acest complex "ribonucleoproteic" catalizeaza apoi cele doua reactii de transesterificare care au ca rezultat "splicingul" (sudarea) exonilor (rosu inchis si deschis) si eliberarea intronului (albastru) sub forma unei structuri "laso". Cu toate ca pentru reactiile de transesterificare nu este necesara hidroliza ATP, se considera ca acesta este necesar pentru a furniza energia necesara rearanjamentele structurii care apar in timpul ciclului. De retinut ca proteinele snRNP din structura "spliceozomului" sunt distincte fata de RNPhn discutate anterior. La eucariotele superioare asocierea U2ARNsn cu pre-ARNm este asistata de o proteina RNPhn numita U2AF, care se leaga o regiune baogata in pirimidina situata langa situsul 3' de splicing. De asemenea U2AF actioneaza probabil si cu alte proteine necesare pentru splicing prin intermediul uni domeniu care contine repetitii dipeptidice serina-arginina (motivul SR). Punctul de ramificare A din structura pre-ARNm este indicat cu caracter rosu boldit.

Diapozitiv 33. Auto-"splicing-ul" intonilor de grup II furnizeaza indicii pentru evolutia snRNPs

Figura: Diagrame schematice care compara structurile secundare de auto-splicing ale intronilor de grup II (a) si UARNsn prezent in spliceozomi (b).

Prima reactie de transesterificare este indicata prin sageti negre; ce a doua reactie prin sageti albastre. Punctul de ramificare A este prezentat boldit. Similitudinile acestor structuri sugereaza ca structurile ARNsn evolueaza din introni de grup II, cu aceste ARNsn care actioneaza in trans si este functional analog cu domeniile corespunzatoare intronilor de grup II.

Din cursul anterior

Splicing autacatalitic sau catalizat de spliceozomi

Rezultatul final al splicingului intronilor din grupa II si a pre-ARNm este acelasi: intronul eliberat sub forma de laso si cei doi exoni vecini uniti intre ei. In plus, mecanismul reactiilor celor doua procese este asemanator. In cele doua cazuri, hidroxilul 2' al intronului serveste drept centru nucleofil pentru realizarea clivarii situsului 5' si un hidroxil 5' al exonului situat in amont este centrul nucleofil care cliveaza situsul 3' pentru a forma legatura exon-exon. Diferenta cheie este ca anumiti introni din grupa II sunt automaturati in vitro, in timp ce splicingul pre-ARNm nucleari necesita o masinarie elaborata formata din mai multe snRNP si proteine accesorii. Totusi, anumiti introni din grupa II necesita maturaze pentru reactia in vitro cu toate ca nucleotidele si centrele catalitice implicate in cele doua procese sunt aceleasi. Presupunand ca splicingul autocatalitic necesita o repliere foarte specifica a ARN, maturazele ar fi necesare pentru stabilirea si stabilizarea unei structuri care permite transesterificari secventiale adecvate. Astfel, singura diferenta intre cele doua mecanisme ar fi maniera in care intronul achizitioneaza conformatia sa catalitic activa.

Aceleasi conditii sunt valabile pentru splicingul catalizat de catre particule. Este posibil ca snRNP si factorii asociati sa creeze un esafodaj pe care intronul sa poata fi corect pliat, astfel incat cele doua jonctiuni si punctul de ramificare sa fie juxtapuse si active. In acest sens, implicarea spliceozomilor in splicingul pre-ARNm nucleari, este analoga celei a maturazei pentru intronii din grupa II. Ne putem intreba de ce replierea pre-ARNm nucleari necesita un astfel de complex in timp ce numai maturaza este suficienta pentru anumiti introni din grupa II. Raspunsul se poate gasi in complexitatea maturarii care trebuie sa se realizeze. Intronii mitocondriali din grupa II se aseamana fiecare posedand mai multe secvente foarte conservate. Una sau doua proteine sunt probabil suficiente pentru a realiza si a mentine conformatia activa a intronilor. Problema este evident mult mai complexa pentru pre-ARNm nucleari data fiind diversitatea de marime si de secventa a acestora si deci si numarul de introni. O singura proteina nu ar putea determina adoptarea unei conformatii active pentru toti intronii. Particulele snRNP, foarte conservate se pot imperechia cu doua sau trei secvente conservate prezente in toti intronii, pot interactiona intre ele si pot impune o conformatie care favorizeaza cele doua transesterificari catalizata de catre ARN.

Alt tip de auto-splicing

Intronii din grupa II din structura moleculelor de pre-ARNm mitocondriale de la drojdii poseda si ei secvente conservate si structuri secundare definite dar aceste sunt distincte de cele caracteristice intronilor grupei I. Si intronii din grupa II sunt supusi procesului de auto-splicng dar , din pacate, cunostintele noastre sunt mai reduse in ceea ce priveste structurile secundare si tertiare ale acestor substrate, si privind detaliile moleculare ale reactiei de maturare. Sunt clare doua puncte ale acestui mecanism: 1) contrar reactiilor de automaturare pe care le suporta intronii din grupa I, maturarea intronilor din grupa II nu necesita un nucleotid initiator si 2) produsul de reactie are o structura de 'laso' (figura 8.76).

Ca si in cazul intronilor din grupa I, procesul de auto-splicing implica doua etape de transesterificare, una in urma clivarii la nivelul situsului 5', si cealalta pentru clivajul situsului 3' si legarea celor doi exoni. Totusi, diferenta fundamentala consta in natura atacului nucleofil: guanozina pentru intronii din grupa I si hidroxilul 2' apartinand unui nucleotid al intronului in cazul intronilor din grupa II (figura 8.82). Structura in laso rezulta din realizarea unei nou legaturi 2'-5' fosfodiester in mijlocul secventei ARN.

Structura tridimensionala a intronului, spontana sau facilitata de proteine asociate, trebuie sa aduca hidroxilul 2' al lasoului in apropierea situsului de splicing 5' si sa activeze transesterificarea. Alegerea legaturii internucleotidice care este clivata depinde probabil de secventele, specifice grupei II, GUGCG prezenta la extremitatea 5' si secventa YAU prezenta la extremitatea 3' a intronului (tabel 8.4). Acest mecanism se aseamana cu cel folosit la maturarea pre-ARNm nucleari. Necesitatea particulelor ribonucleoproteice care actioneaza in trans pentru realizarea splicingului intronilor din pre-ARNm este datorata faptului ca procesul, in acest caz, este mult mai complex si specific diferitelor tipuri de pliere a diferitelor specii de pre-ARNm, necesare asigurarii splicingului corect la nivelul jonctiunilor exon-intron.

Diapozitiv 34. Secventele elementelor conservate in mai multi introni din clasa I

Diapozitiv 35. Majoritatea transcriptiei si procesarea ARN apare intr-un numar limitat de domenii din nucleul celulelor de mamifere

Figura: Localizarea poliadenilarii ADN si afactorilor de splicing in nucleul fibroblastelor de mamifere

Imagine microscopica digitala folosita pentru reconstruirea unei sectiuni de groase de 1 micro-metru dintr-un nucleu de fibroblaste colorat.

a)     Sectiune colorata in urma marcarii cu poli-dT cu rodamina rosie pentru a detecta procesul de poliadenilare a ARN (rosu) si cu DAPI pentru a detecta ADN (albastru). ARN poliadenilat este localizat la un numar limitat de loci discreti pozitionate intre regiunile de cromatina, desi nu toate regiunile care contin nivele scazute de ADN contin ARN poliadenilat detectabil (sagetile).

b)    Aceeasi sectiune prezentata in a) colorata pentru a detecta ARN poliadenilat (rosu) si proteina esentiala implicata in splicing SC-35, care a fost vizualizat cu un antcorp monoclonal marcat cu fluoresceina verde. Regiunile unde colorantii s-au suprapus apar in galben. SC-35 este prezentat in centru multor loci (sageti).

Diapozitiv 36. Concluzii

Precursorii ARNm de la eucariote sunt procesati prin adaugarea structurii "cap", scindare 3' si poliadenilare, sudarea exonilor (splicing) si inlaturarea intronilor inainte de transportul ARNm in citoplasma unde urmeaza a fi tradus de catre ribozomi;

Structura "cap" este adaugata la capatul 5' al pre-ARNm, in formare, de catre o enzima specifica care este asociata cu domeniul CTD fosforilat al ARN polimerazei II, la putin timp dupa initierea transcriptiei;

Transcriptii pre-ARNm, in formare, sunt asociati cu o clasa de proteine de legare a ARN numite hnRNP;

La majoritatea genelor care codifica pentru proteine, un semnal de poliadenilare conservat (AAUAAA) este situat la 10-30 nucleotide in amonte de situsul poli(A) unde apare clivarea si poliadenilarea.

Un complex multiproteic care include poli(A) polimeraza (PAP) realizeaza scindarea si poliadenilarea pre-ARNm. O proteina nucleara de legare la poli(A), PABII, stimuleaza adaugarea de resturi A de catre PAP si opereste procesul odata ce "coada" poli(A) atinge 200-250 resturi;

Splicingul ARN este realizat de catre un complex ribonucleo-proteic, numit "spliceozom", care este asamblat prin interactiile a cinci particule RNPsn diferite, intre ele, si de asemenea cu pre-ARNm. Spliceozomul catalizeaza doua reactii de transesterificare care sudeaza exonii si inlatura intronul sub forma unei structuri in "laso", care este ulterior degradata.

Intronii autocatalitici de grup II, care au fost evidentiati in genele cloroplastelor si mitocondriilor de la plante si fungi, prezinta o structura secundara inalt conservata, care este necesara pentru auto-splicing. Se considera ca particulele RNPsn din spliceozomi ca au o structura secundata similara cu cea a intronilor de grup II;

Majoritatea transcriptiei si procesarea ARN din nucleii celulelor eucariote se realizeaza la nivelul unui numar limitat de domenii. O retea proteica fibroasa din interiotul nulcleului formeaza o matrice nucleara. Aceasta poate servi la organizarea unor centre de transcriptie si procesare a ARN.

Diapozitiv 37. Reglarea procesarii ARNm: proteina U1A inhiba poliadenilarea propriului pre-ARNm

Figura: Diagrama capatului 3' al pre-ARNm care codifica proteina U1A, o secventa specifica a unei proteine de legare la ARN care este parte componenta a complexului U1RNPsn.

Legarea proteinei U1A la ambele situsuri situate in amonte de blocurile situsului poli(A) de poliadenilare, dar nu de clivare, a pre-ARNm. De retinut ca secventa semnalului de poliadenilare din amonte difera usor de semnalul singular uzual AAUAAA. Aceasta secventa neobisnuita se gaseste in putine molecule pre-ARNm.

Diapozitiv 38. "Splicing-ul" tesut specific controleaza expresia fibronectinelor alternative

Figura: "Splicingul" pre-ARNm al fibronectinei specific fibroblastelor si hepatocitelor (splicing specific tipului celular).

Gena fibronectinei (sus) contine mai multi exoni care se pare ca provin dintr-o gena ancestrala care a suferit un numar de duplicari ale exonilor. Exonii cu secvente omologe sunt prezentati cu aceeasi culoare. In aceasta diagrama, intronii (liniile subtiri albastre) nu sunt desenati la scala; majoritatea lor sunt mult mai lungi decat orice alti exoni. ARNm pentru fibronectina produs de catre fibroblaste include exonii EIIIA si EIIIB, in timp ce acestia sunt eliminati din structura ARNm pentru fibronectina prezent in hapatocite.

Din cursul anterior

Splicingul alternativ: mai multe proteine codificate de o singura gena

Cea mai mare parte a genelor pre-ARNm sunt maturate dupa un mecanism care exclude fiecare intron decupandu-l la nivelul situsurilor de clivare 5' si 3'. Astfel, diferitii exoni ai unui transcript sunt conservati in ordinea initiala sub forma unei secvente continue in molecula de ARN matur (splicing constitutiv). Totusi, anumite molecule de pre-ARNm pot fi maturate in mai multe moduri determinand formarea unei familii de ARNm inrudite structural, fiecare posedand o insiruire diferita de exoni diferiti, si putand codifica o familie de proteine izoforme. Acest tip de maturare a ARN este numit splicing alternativ. Un numar mare de gene de la Drosophila, om si virusuri sunt transcrise intr-o molecula pre-ARNm care sufera maturare (splicing) alternativa. Aceste gene codifica pentru un numar mare de proteine dintre care unele sunt implicate in constituirea citoscheletului, in contactia musculara, sunt receptori membranari, hormoni polipeptidici, sunt implicate in metabolismul intermediar si in transpozitia ADN.

Splicingul alternativ furnizeaza o modalitate de diversificare a informatiei purtate de o gena fara a modifica organizarea sa genomica. Acest mod de maturare reprezinta o maniera eficace de a produce o varietate de ARNm care codifica pentru proteine inrudite in care secventele comune sunt specificate de exoni comuni in timp ce secventele distincte deriva din exoni maturati diferit. In anumite cazuri, moleculele de ARNm maturate diferit sunt produse in acelasi timp, si diferitele molecule proteice izoforme pot asigura functii identice sau diferite. Cele patru proteine izoforme care stau la baza constituirii mielinei sunt toate componente ale anvelopei mielinice ale celulelor sistemului nervos central; cele doua izoforme de imunoglobuline sunt respectiv membranara si secretata. Anumite molecule transcript sunt maturate diferit in functie de tesut. Astfel, o gena unica exprima calcitonina in tiroida si izoforma sa, o proteina inrudita prezenta in creier, fiecare fiind formata de la acelasi pre-ARNm maturat distinct. In anumite sisteme genetice (ex. gena troponinei T de la mamifere si din complexul ultrabitorax de la Drosophila), cantitatile relative si tipul de splicing al moleculelor pre-ARNm sunt reglate in cursul dezvoltarii. Splicingul alternativ are un rol important in determinarea sexului in cursul embriogenezei la Drosophila. Diferentele de activitate ale genelor de reglare la masculi si femele sunt datorate, in principal, diferitelor tipuri de splicing, specific pentru sex, care conduce la producerea de molecule transcript cu functii distincte la cele doua sexe. In plus, activitatea genelor individuale in aceasta ierarhie de reglare nu este controlata numai la nivel de splicing, dar determina o schema de splicing care actioneaza ca urmare a rezultatului acestei ierarhii.

Schema de splicing alternativ

Au fost evidentiate trei clase generale de splicing (figura 8.90). Tipul I este rezultatul utilizarii de promotori diferiti pentru a da nastere la molecule de pre-ARNm inrudite formate din regiuni 5' proximal distincte si de lungimi variabile. Genele amilazei de la soarece si a lantului usor al miozinei (CLM) de la vertebrate sunt exemple caracteristice acestei clase. Gena CLM este transcrisa plecand de la doi promotori situati la aproximativ 10 kpb unul de celalalt (figura 8.91). Molecula de pre-ARNm cea mai lunga contine toti exonii in timp ce celei mai scurte ii lipseste primul. Splicingul alternativ produce doua molecule de ARNm aproape egale continand fiecare cinci exoni constitutivi in regiunea 3' proximala dar difera prin exonii pozitionati in 5'. Maturarea celui mai lungi molecule de pre-ARNm, exonul 1 este legat de exonul 4, fiind ignorate situsurile de clivare 3' ale exonilor 2 si 3. Din contra, la maturarea pre-ARNm mai scurt sunt asociati exonii 2, 3 si 5 si nu se produce asocierea exonilor 3 si 4. Analiza secventei a demonstrat ca situsul 3' care flancheaza exonul 2 este defectiv, ceea ce explica defectul de asociere a exonilor 1 si 2. Absenta jonctiunii exonilor 1 si 3, 3 si 4 este atribuita altor cauze distincte pe care le vom discuta mai tarziu.

Cel de al doilea tip de splicing implica moleculele pre-ARNm care poseda secvente 3' proximal de lungimi variabile, in general deoarece poliadenilarea transcriptului se face plecand de la situsuri diferite (figura 8.90). Cele cinci grupe diferite de ARNm tardiv de la adenovirusul 2 sunt rezultatul splicingului alternativ posibil numai datorita folosirii a cinci situsuri de poliadenilare diferite. Aceeasi explicatie tine cont de originea celor doua specii de ARNm ale lanturilor grele ale imunoglobulinei. Gena unica a calcitoninei de la mamifere produce doua molecule de ARNm (figura 8.92); una provine dintr-un pre-ARNm scurt, cealalta codifica pentru o peptida inrudita cu calcitonina. Cei patru exoni ai pre-ARNm scurt ai calcitoninei sunt retinuti. Molecula pre-ARNm lung contine doi exoni suplimentari, 5 si 6; acestia sunt prezenti in ARNm al peptidei inrudite, dar exonul 4 este absent. Situsul de jonctiune 3' al intronului 4 este partenerul preferat al situsului 5' al celui de al treilea intron. In acest caz, maturarile realizate sunt determinate de utilizarea de semnale de poliadenilare diferite si specifice de (pentru) tesut.

In al treilea tip de splicing alternativ, care este cel mai variat si cel mai neasteptat, o molecula de pre-ARNm da nastere la diferite molecule de ARNm functionale (figura 8.90). Sunt prezenti toti exonii potentiali in pre-ARNm si alegerea posibilitatilor de maturarea se realizeaza folosind exonii existenti. Schema jonctiunilor a si b prezentate in figura 8.90 este realizata in numeroase gene. Un bun exemplu il constituie gena pentru troponina T din muschii scheletici rapizi (figura 8.93). Grupele a si b de ARNm ale troponinei T contin respectiv exonul 16 sau exonul 17. Acesta este rezultatul asocierilor exonilor 15, 16 si 18 sau 15, 17 si 18. Alegerea exonului utilizat este reglata in cursul dezvoltarii. Astfel, exonul 16 este specific ARNm pentru troponina din muschiul adult si exonul 17 este folosit in moleculele ARNm adulte si embrionare. Cele 32 de combinatii posibile care implica exonii 4 la 8 sunt reprezentate in grupele a si b; esantionul de molecule ARNm mature merge de la excluderea completa la retinerea tuturor celor cinci exoni.

Pot exista si procese de maturare care implica situsurile de clivare 5' si 3' interne ale exonilor sau ale intronilor (figura 8.90c). Astfel, clivarea la nivelul unui situs 5' autentic este de obicei insotita de clivarea la nivelul situsului 3' normal de la extremitatea intronului, dar exista posibilitatea clivarii unui alt situs 3' situat in intron, avand ca rezultat lungirea exonului urmator. Un rezultat similar se obtine daca are loc o clivare alternativa in intron sau in exon (figura 8.90d). Existenta si folosirea, unor astfel de situsuri de jonctiune, criptice presupune ca splicingul alternativ determina formarea unor faze de lectura reale. Un astfel de splicing alternativ este folosit de catre SV40 si de catre virusul polioma pentru a exprima mai multe molecule de ARNm plecand de la un singur transcript al regiunii precoce (figura 8. 94). Aceasta modalitate de splicing atenueaza distinctia intre proprietatile codante ale exonilor si intronilor.

Un exemplu interesant de splicing alternativ specific pentru tesut este cel al genei care codifica pentru elementul transpozabil P de la Drosophila. In acest caz, conservarea intronului care contine un codon fara sens (STOP), impiedica expresia transpozazei (proteinei responsabile de transpozitie) in tesuturile somatice. Expresia acesteia in tesuturile liniei germinale este rezultatul eliminarii intronului in aceste tesuturi, permitand extinderea secventei fazei deschise de lectura la un exon necesar activitatii acestei enzime (transpozazei).

Un exemplu extrem de splicing diferential exista in expresia genelor pentru retrovirus. Provirusul integrat este transcris intr-o copie completa de ARN genomic viral care este in final impachetata in virion: nu are loc nici o clivare in molecula de ARN destinata virionilor. Dar acelasi transcript reprezinta si ARN, care codifica pentru transcriptaza inversa si proteina core. In plus, acelasi transcript este un pre-ARNm care in urma maturarii produce ARNm pentru proteinele anvelopei. In cazul leucemiei umane a celulelor T si a imunodeficientei umane, diferitele moduri de splicing al transcriptului primar produc diferite molecule de ARNm care produc fiecare o proteina particulara necesara multiplicarii virale sau patogenitatii (figura IV.6).

Selectionarea situsului de clivare

Principala enigma relativ la splicingul constitutiv sau alternativ al pre-ARNm, este modul in care sunt alese perechile de jonctiune corecta a exonilor. Pentru acest fenomen exista doua mari categorii de explicatii posibile. Una presupune existenta unor structuri intrinseci ale pre-ARNm sau a unor intermediari care apar in cursul formari ARNm: acestia sunt factorii cis. O alta explicatie presupune implicarea unor factori care sunt pozitionati in trans, proteine sau alte molecule de ARN care pot influenta alegerea intronului care trebuie eliminat. Este foarte probabil sa existe o ierarhie de eficienta a situsurilor de clivare, care ar putea reflectarea avantajului relativ al formarii spliceozomilor la situsurile 5' si 3' cele mai favorizate. In cazul moleculelor de ARNm pentru doua antigene T ale SV40, cele doua reactii de clivare alternativa sunt determinate prin alegerea punctului bransare a intronului. Exista numeroase exemple care demonstreaza ca prezenta unei mutatii la nivelul unui situs de jonctiune determina folosirea altui situs care de obicei nu era utiliza. Exista numeroase argumente in favoarea idei ca factorii care actioneaza in trans determina rezultatul reactiilor de splicing. Acest lucru este adevarat cand molecule de pre-ARNm, presupuse identice, sunt maturate diferit, in functie de conditiile fiziologice sau in tesuturi particulare. Este posibil ca particulele snRNP sau proteine de tipul maturazelor sa poata fi exprimate, si sa functioneze, intr-un mod programat in timpul dezvoltarii specifice a anumitor tesuturi, influentand astfel schema de splicing. Multe dintre aceste puncte vor fi clarificate cu certitudine in anii urmatori.

Diapozitiv 39. Expresia proteinei Sxl 11.3 (Sex-lethal) in timpul embriogenezei la Drosophila

Figura: Expresia proteinei "Sex-lethal" (Sxl) in timpul embriogenezei la Drosophila.

In moleculele de pre-ARNm, exonii sunt prezentati sub forma unor cutii rosii si intronii ca niste linii albastre; splicingul este indicat prin linii punctate. O sageata verticala rosie indica codonul de start AUG de la care incepe translatia ARNm.

a)     Timpuriu, in dezvoltare, pre-ARNm sxl este sintetizat din PE, care este activa numai la embrionii femeli. Acest pre-ARNm este intotdeauna maturat asa cum este prezentat in figura.

b)    Mai tarziu, in timpul dezvoltarii, este sintetizat un pre-ARNm pentru sxl este sintetizat din PL atat la femele cat si la masculi. La masculi, acest transcript este maturat (spilice) pentru a da nastere unui ARNm format din patru exoni. Deoarece exonul 3 contine in structura un codon stop (banda rosu inchis), la masculi nu se produce o molecula functionala. La femele, fixarea proteinel Sxl timpurii la pre-ARNm pentru Slx, impiedica splicingul exonilor 2 si 3. ARNm rezultat, care contine trei exoni, este tradus intr-o proteina functionala Sxl, care si aceasta se leaga la pre-ARN pentru Sxl sintetizat mai tarziu, asigurand producerea sa continua la femele. De retinut ca exonul 2 al transcriptului timpuriu prezentat in a) este identic cu exonul 4 al transcriptului tardiv; b) Acest exon codifica domeniul RNP care mediaza legarea proteinei Sxl la ARN.

Diapozitiv 40. Cascada "splicing-ului"adaptativ care controleaza diferentierea sexuala la Drosophila

Figura: Cascada splicingului adaptativ (regulated = de reglare) care controleaza expresia genelor sxl (sex-lethal), tra (transformer) , si dsx (doule-sex) din embrionii de Drosophila.

Pentru claritate, numai exonii (dreptunghiurile rosu deschis) si intronii (liniile albastre) supusi splicingului reglator sunt prezentati. Splicingul este indicat prin linii punctate in fata (femele) sau in spate (mascul) fata de pre-ARNm. Benzile rosu inchis semnifica prezenta unor codoni stop in fazele de lectura, care impiedica sinteza unei proteine functionale. Numai embrionii femeli produc proteine functionale Sxl, care impiedica splicingul intre exonii 2 si 3 din pre-ARNm Sxl si dintre exonii 1 si 2 din pre-ARNm pentru tra. In contrast, legarea complexului Tra-Tra2 la pre-ARNm pentru dsx activeaza splicingul intre exonii 3 si 4. Ca un rezultat al acestei cascade de reglare a splicingului, proteine Dsx distincte sunt produse in embrionii femeli si masculi. Acestia represeaza transcriptia genelor necesare pentru diferentierea sexuala a sexelor opuse.

Diapozitiv 41. Mai multe izoforme proteice sunt comune sistemului nervos al vertebratelor

Figura: Splicingul alternativ al ARNm pentru slo care codifica canalul pompei de Ca2+/K+, in celulele perilor auditivi care contribuie la perceptia sunetelor de diferite frecvente. (splice=matisare, imbinare)

a)     Cohlea de pui, un tun de 5 mm, contine un epiteliu cu celule ale perisorilor auditivi care sunt adaptate unui gradient de frecvente vibrationale de la 50 Hz la capatul apical (stanga) la 5000 Hz la capatul bazal (dreapta).

b)    Proteina Slo contine 7 alfa elice transmembranare (S0 la S6), care se asociaza pentru a forma canalul de K+. Domeniul citosolic, care include 4 regiuni hidrofobe (S7 la S10), regleaza deschiderea canalului ca raspuns la Ca2+. Izoformele canalului Slo, codificate de izoforme ARNm obtinute prin de splicing alternativ pornind de la acelasi transcript primar, se deschid la concentratii diferite de calciu. Numerele rosii se rtefera la regiunile in care splicingul alternativ produce diferite secvente aminoacide in diferitele izoforme Slo. De exemplu, doua secvente aminoacide (prezentate in codul cu o litera) obtinute prin splicing alternativ in regiunea 3' sunt prezentate in partea de jos a figurii. Liniile de unire indica jonctiunile exonice. Splicingul la unul dintre situsurile de imbinare si de reunireAVS codifica in unul din exoni la GRK. Celulele perisorilor de la capatul apical al cohleei realizeaza numai splicing de secvente scurte, in timp ce celulele perisorilor de la capatul bazal realizeaza ambele tipuri de splicing alternativ. Alte forme de splicing alternativ sunt imbogatite in celulelor perisorilor auditivi in diferite localizari specifice de-a lungul lungimii cohleei.

Diapozitiv 42. Concluzii

Expresia anumitor proteine este reglata prin controlarea procesarii transcriptului primar al genei care codifica pentru aceasta. Acest tip de reglarea genica este in special comun pentru genele care codifica proteine importante pentru functionarea sistemului nervos la vertebrate;

Poliadenilarea pre-ARNmcare codifica proteina U1A este inhibata prin chiar legarea proteinei U1A la doua situsuri identice situate foarte aproape in amonte fata de situsul poli(A) al pre-ARNm pentru U1A. Drept rezultat, nu se produce ARNm functional, expresia proteinei U1A fiind represata. Reglarea de acest fel nu este foarte comuna;

"Splicingul" alternativ al transcriptilor primari produsi din unitati complexe este adesea reglat. Ca rezultat, pot fi exprimate diferite tipuri de ARNm pentru aceeasi gena in diferite tipuri celulare sau in diferite stadii de dezvoltare;

Splicingul alternativ poate fi reglat de catre proteinele care se leaga la diferite situsuri specifice din apropierea situsului reglare a matisarii din structura ARN. Se considera ca inhibitorii de splicing actioneaza pentru a bloca steric accesul acestor factori la secventa ARN. Activatorii procesului pot determina splicingul prin asocierea lor cu situsurile dfe reglarea a imbinarii (matisarii).

Diapozitiv 43. Porii nucleari asigura transportul activ al macromoleculelor intre nucleu si citoplasma

Figura: Complexul porului nuclear (NPC)

a)     Anvelopa nucleara a ovocitelor de Xenopus vizualizata prin microscopie electronica

Sus: fata citoplasmatica a complexului porului nuclear (NPC); Mijloc: fata nucleoplasmica a anvelopei nucleare dupa indepartarea membranei nucleare a NPC, aratand structura sub forma de cos; Jos: Fata nucleoplasmatica a anvelopei nucleare dupa indepartarea membranei nucleare prin tratament bland cu detergent. Reteaua laminara, care se insereaza in inelul nuclear al NPC, este expus dupa acest tratament.

b) Modelul schematic al NPC

Diapozitiv 44. Model pentru trecerea moleculelor de "mRNP" prin complexele porului nuclear

Figura: Modelul trecerii moleculelor RNPm prin complexul porului nuclear (NPC) bazat pe studiile de microscopie electronica la Chironomous tentans

Dupa curbare RNPm se deplaseaza prin inelul terminal, se extinde si trece prin regiunea centrala a NPC cu capatul 5' inainte asociindu-se cu ribozomii din citoplasma. Se crede ca NPC sufera o modificare conformationala in timpul transportului.

Diapozitiv 45. Determinarea heterocarionului evidentiaza diferentele dintre proteina A1 si proteina C din "hnRNP" de la om privind trecerea prin porii nucleari

Figura: Utilizarea heterocarionilor demonstreaza ca proteina A1hnRPN poate cicliza in si in afara citoplasmei, in timp ce proteina umana C hnRNP nu poate

Heterocarionii au fost separati prin tratamentul celulelor Hela si a celulelor de Xenopus in cultura cu polietilen glicol. Celulele au fost tratate cu cicloheximida imediat dupa fuziunea lor pentru a impiedica sinteza proteica. Dupa 2 ore, celulele au fost fixate si colorate anticorpi specifici pentru proteinele C si A1 hnRNP marcati cu fluoresceina. Acesti anticorpi nu se leaga la proteinele proteinele de Xenopous omologe.

a)     Un preparat fixat vizualizat prin microscopie in contrast de faza contine celule HeLa (capatul sagetii) si de Xenopous nefuzionate (sageata punctata) ca si heterocarioni fuzionati (sageata solida). In heterocarionul din figura, nucleul rotund HeLa este in dreapta nucleului oval de Xenopous.

b)    si c) Cand acelasi preparat este vizualizat prin microscopie de fluorescenta , proteinele colorate ChnRNP sunt colorate in verde si A1 hnRNP in rosu. De retinut ca celulele nefuzionate de Xenopous sunt necolorate confirmand ca anticorpii sunt specifici pentru proteinele umane. In heterocarion, hnRNP C apare in ambii buclei HeLa c);

b) Cu toate ca sinteza proteica a fost blocata dupa fuziunea celulara, o parte din hnRPN A1 trebuie sa fi parasit nucleul celulelor HeLa sa se deplaseze prin citoplasma si sa intre in nucleul de Xenopous di heterocarion.

Diapozitiv 46. Model privind exportul proteinelor nucleare cargo purtatoarea a unui semnal de export nuclear bogat in leucina

Figura: Mecanismul propus pentru transportul proteinelor "cargo" continand un semnal de export nuclear bogat in leucina (NES nuclear export signal)

In nucleoplasma, proteina exportina 1 se leaga cooperativ la NES din structura proteinei cargo pentru a fi transportata si la Ran-GTP. Dupa formarea complexului cargo, acesta trece prin complexul porului nuclear NPC si RanGAP, localizat in citoplasma, stimuleaza transformarea ran-GTP in Ran-GDP. Modificarile conformationale la nivelul Ran care insotesc acest proces conduce la disocierea complexului. Proteina cargo care contine semnalul de export nuclear NES este eliberata singura in citosol, in timp ce exportina 1 si Ran-GDP sunt transportate inapoi in nucleu prin intermediul prin complexele porului nuclear. RCC1 localizata in nucleu stimuleaza transformarea Ran_GDP in Ran-GTP. Repetarea acestui ciclu duce la exportul mai multor molecule de proteina cargo.

Diapozitiv 47. Model de export nuclear al moleculelor de ARNm mediat de "hnRNP"

Figura: Mecanismul propus pentru exportul nuclear al ARNm prin intermediul hnRNP

a)     Capatul 5' al complexului format din ARNm-hnPNP (RNPm) se asociaza cu CBC (Cap Binding Complex), care trece mai intai prin Complexul Porului Nuclear (NPC).

b)    hnRNP care trebuie sa ramana in nucleu (potocaliu si albastru) sunt indepartate in timpul trecerii RNPm prin NPC, aceste proteine carora le lipseste secventele NES (Nuclear Export Signal) vor ramane an nucleu in timp ce hnRNP purtatoare de NES, cum este A1 hnRNP , sunt transportate pri NPC impreuna cu ARNm pe care il transporta in citoplasma.

c)     Complexul RanGAP stimuleaza hidroliza GTP de catre Ran. Proteinele naveta hnRNP disociaza apoi de pe proteinele receptoare (exporetina 1 pentru semnale de export nujclear bogate in leucina) care sunt transportate inapoi in nucleu. Apoi ARNm este disponibil sa interactioneze cu prpteinele citosolice RNPm, inclusiv cu poli(A) binding protein (PABP), care se leaga in 3' la coada poli(A) a ARNm.

Diapozitiv 48. Proteinele purtatoare de semnale nucleare de localizare sunt recunoscute de receptori si transportate in nucleu

Figura: Demonstratie ca Semnalul de Localizare Nucleara (NLS Nuclear Localization Signal) al antigenului T al SV40 poate directiona o proteina citoplasmatica in nucleul celular.

a)     Piruvat kinaza normala, vizualizata prin imunofluorescenta dupa tratarea celulelor in cultura cu un anticorp specific, este localizata in citoplasma.

b)    O piruvat kinaza himera, care contine un semnal NLS al SV40 la capatul sau N-terminal, este directionata catre nucleu. Proteina himera a fost exprimata in urma transfectiei unei gene modificate produsa prin fuziunea unui fragment al unei gene virale care codifica NLS al SV40 cu gena piruvat kinazei.

Diapozitiv 49. Model de import a proteinelor citosolice purtatoare de semnale NLS

Figura: Mecanismul propus pentru proteinele de transport "cargo"care contin un semnal de localizare nucleara (NLS) din citoplasma in nucleu.

In citopplasma (sus), importinele alfa si beta interactioneaza cooperativ cu proteina cargo pentru a fi transportate, cu NLS care se leaga la importina alfa. Subunitatea beta a importinei beta al complexului cargo trimeric rezultat cu componentele NPC, translocand complexul in nucleoplasma prin mecanisme slab intelese, mecanisme care necesita hidroliza ATP. In nucleoplasma, Ran-GTP interactioneaza cu importina beta, determinand disocierea complexului cargo, eliberand proteina cargo libera in nucleoplasma.

Pentru a sustine un alt ciclu de import, importina alfa monomera si complexul importina beta-Ran-GTP sunt transportate inapoi in citoplasma. Proteina de activare RanGAP (Ran GTP activating protein) din citoplasma stimuleaza transformarea ran-GTP la Ran-GDP avand drept rezultat o transformare conformationala la nivelul Ran care determina disicierea de importina beta. Importina beta libera interactioneaza apoi cu importina alfa si se formeaza un nou complex cargo purtator al unui semnal bazic NLS, care initiaza un alt ciclu de import nuclear. Se presupune ca Ran-GDP este de asemenea translocat prin porii nucleari din citoplasma in nucleoplasma, unde factorul nucleotidic de schimb Ran (RCC1) determina eliberarea GDP si relegarea GTP.

Diapozitiv 50. Proteina Rev a HIV Rev regleaza transportul moleculelor de ARNm viral ne-maturate

Figura: Rolul proteinei Rev an transportul moleculelor de ARNm ale HIV din nucleu catre citoplasma

Genomul HIV, care contin regiuni codante suprapuse, este transcris intr-un singur transcript primar de 9 kb. In urma splicingului se obtin mai multe molecule ARNm de aproximativ 4 kb in urma splicingului unuia dintre introni (linia albastra in unghi), si mai multe molecule de ARNm de aproximativ 2 kb in urma splicingului a doi sau mai multi introni. Dupa transportul in citoplasma, fiecare specie de ARNm este tradusa in citoplasma in diferite proteine virale. Proteina Rev, codificata de catre ARNm de 2 kb, interactioneaza cu RRE (rec Reponse Element) de la nivelul moleculelor supuse si nesupuse procesului de splicing, stimuland transportul lor in citoplasma.

Diapozitiv 51. Concluzii

Diapozitiv 52. Concluzii

Diapozitiv 53. Editarea ARN modifica secventele moleculelor pre-ARNm

Figura: Editarea pre-ARNm pentru apo-B

ARNm pentru apo-B produsa in ficat are aceeasi secventa ca si exonii din transcriptul primar. Acest ARNm este tradus in Apo-B 100, care prezinta doua domenii functionale: unul N terminal (verde) care se asociaza cu lipidele si un domeniu C-terminal (portocaliu) care se leaga la receptorii LDL de pe membrana celulara. In cazul ARNm pentru apo-B din intestin, codonul CAA din exonul 26 este editat la codonul UAA stop. Ca rezultat celulele intestinale produc Apo-B48, care corespunde domeniului N-terminal al Apo-B100.

Din cursul anterior

Editarea ARN (RNA editing) utilizeaza informatii din diferite surse

O prima axioma a biologiei moleculare este aceea ca secventa ARNm poate reprezenta numai ceea ce este codificat in ADN. Dogma centrala propune o relatie lineara in care o secventa de ADN este transcrisa intr-o secventa ARNm care este direct transformata intr-o proteina. Existenta genelor intrerupte si indepartarea intronilor prin splicingul ARN introduce un pas in plus in procesul de expresie al genelor: secventele codante (exonii) din ADN trebuie sa reconstituiti in ARN. Procesul ramane astfel unu transfer al informatiei in care codul purtat de secventa ADN nu este modificat.

Modificari ale informatiei codificate de ADN apar in circumstante exceptionale, cel mai reprezentativ exemplu fiind generarea de noi secvente care codifica pentru imunoglobuline la mamifere si pasari. Aceste modificari apar specific in celulele somatice (limfocitele B) in care imunoglobulinele sunt sintetizate. Noua informatie este generata in ADN-ul unui individ in timpul procesului de reconstructie a genei imunoglobulinei; informatia codificata in structura ADN este modificata printr-o mutatie somatica. Informatia din ADN continua sa fie transcrisa cu exactitate in ARN.

Editarea ARN (RNA editing-prelucrarea ADN) este un proces in care informatia este modificata la nivelul ARN. S-au evidentiat situatii in care secventa codanta din ARN difera de secventa ADN dupa care a fost transcrisa. Prelucrarea ARN apare in doua situatii diferite, determinate de diferite cauze. In celulele de mamifere sunt situatii in care substitutia (modificarea) apare la o singura baza din structura ARNm, determinand o modificare a secventei proteinei codificate. In mitocondriile de la Trypanosoma, modificari mai extinse apar in transcriptii multor gene, cand bazele sunt sistematic adaugate sau inlaturate.

In figura 32.11 sunt prezentate secventele genei pentru apolipoproteina-B (apo-B) din intestinul si ficatul mamiferelor. Genomul contine o singura (intrerupta) gena a carei secventa este identica in toate tesuturile, cu o regiune codanta de 4563 codoni. Gena este transcrisa intr-un ARNm care este tradus intr-o proteina de 512 000 Da reprezentand intreaga secventa codanta in ficat.

O forma mai scurta a proteinei, aproximativ 250 000 Da, este sintetizata in intestin. Aceasta proteina consta in regiunea A-terminala a proteinei intregi. Ea este tradusa de pe o molecula de ARNm a carei secventa este identica cu cea din ficat cu exceptia unei modificari a lui C in U la codonul 2153. Aceasta substitutie modifica codonul CAA pentru glutamina in UAA codon Stop (ocru).

Cine poarta responsabilitatea acestei substitutii (ce realizeaza aceasta modificare)? Nu a fost evidentiata in genom o gena alternativa sau un exon care sa codifice pentru noua secventa, si nici nu a fost descoperita o modificare a modului de splicing (de maturare). In aceste imprejurari se impune concluzia ca modificarea s-a realizat direct in secventa transcriptului. Exista o enzima care recunoaste specific transcriptul apo-B si modifica C2153 in T? O astfel de enzima trebuie sa recunoasca o anumita regiune a structurii secundare in mod analog enzimelor capabile sa modifice structura ARNt. Conceperea unui sistem in vitro pentru acest cercetarea acestui proces de prelucrare sugereaza ca o secventa relativ mica (aprox. 50 baze) situata in vecinatatea situsului de editare este o tinta suficienta.

Prelucrarea in acest mode este rara, dar apo-B nu este unica. Un alt exemplu este furnizat de receptorul pentru glutamat din creierul de soarece. Prelucrarea unei singure pozitii modifica codonul pentru glutamina, de pe ADN, intr-un codon pentru arginina pe ARN; arginina joaca un rol important in controlul fluxului ionic prin neurotransmitator, astfel incat prelucrarea (editarea) este in mod clar necesara pentru functionarea fiziologica.

Modificari dramatice ale secventei au fost detectate la numeroase gene mitocondriale de la Trypanosoma. In primul rand s-a descoperit ca in secventa subunitatii II a citocrom oxidazei proteina are -1 frameshift (o modificare de cadru) fata de secventa genei coxII. Secventele genei si proteinei, care sunt prezentate in figura 32.12 (GenesV), sunt conservate la mai multe specii de Trypanosoma. Cum functioneaza aceasta gena?

ARNm al coxII prezinta un insert de patru nucleotide (toate uridine) langa situsul de frameshift. Insertia restaureaza faza de lectura corespunzatoare; aceasta insereaza un aminoacid in plus si modifica aminoacizii pe fiecare parte pentru a crea faza de lectura corecta. Nu a mai fost descoperita o a doua gena pentru aceasta secventa, si oamenii de stiinta sunt fortati sa conchida, pentru moment, ca aceste baze in plus au fost inserate in timpul sau dupa realizarea transcriptiei. O discrepanta asemanatoare intre ARNm si secventele genomice a fost gasita pentru genele SV5 si in cazul para-mixovirusului care provoaca pojarul. In aceste cazuri este vorba de adaugarea unui rest G in structura ARNm.

Au fost evidentiate secvente ARN prelucrate similar si pentru alte gene. Aceste includ deletii sau aditii de uridina. In figura 32.13 (GenesV) este prezentat cazul extraordinar al coxIII. Mai mult de jumatate din resturile din structura ARNm constau in uridine care nu sunt codificate de gena. Compararea ADN genomic si a ARNm demonstreaza ca nu exista structura mai mare de 7 nucleotide care sa nu fie modificata; insertiile sunt formate din fragmente care contin mai mult de 7 uridine.

De unde provine informatia pentru inserarea specifica a uridinelor? O molecula de ARN ghid contine secventa care este complementara cu ARNm corect prelucrat (editat). In figura 32.14 este redat un model pentru aceasta actiune in gena citocromului b de la Leishmania.

Secventa de sus arata transcriptul original, sau ARN pre-editat. Golurile reprezinta bazele care urmeaza a fi inserate in urma procesului de prelucrare (editare). Pentru a crea o secventa ARNm valida, in aceasta regiune, trebuiesc inserate 8 uridine.

ARN ghid este complementar cu ARNm pe o distanta semnificativa care includ regiunile din jurul regiunii care urmeaza a fi prelucrata (edited region). Tipic, complementaritatea este mai extinsa in regiunea 3' a regiunii de prelucrare si adesea mai redusa in regiunea 5'. Imperecherea dintre ARNm ghid si ARN pre-editat (pre-edited RNA) lasa spatii (locuri) unde resturi neimperechiate din ARN ghid nu gasesc complementaritate in ARN pre-editat. Cand reactia este completa, ARN ghid se separa de ARNm, care devine disponibil pentru translatie (traducere).

Specificarea secventei finale editate poate fi complexa; in acest exemplu in acest exemplu o secventa mai lunga este editata prin inserarea impreuna a 39 de resturi U, dar acest proces pare sa necesite doua molecule ARNs ghid, care actioneaza la situsuri adiacente, fie simultan fie succesiv. Ne putem imagina situatii mult mai complicate in care, de exemplu, dupa ce o molecula ARN ghid ajuta la crearea secventei prelucrate, aceasta este preluata de o alta molecula ghid pentru continuarea editarii.

Moleculele ARNs ghid sunt codificate ca unitati de transcriptie independente. In figura 32.15(Genes V) este prezentata o harta cu regiuni mitocondriale relevante la Leishmania. Aceasta include 'gena' pentru citocromul b, care codifica pentru secventele pre-editate si doua regiuni care specifica moleculele ARNs ghid. Genele pentru regiunile codante majore si pentru moleculele lor ARNs ghid sunt raspandite (separate)

In principiu, o mutatie fie in 'gena' sau in structurile care codifica ARNs ghid pot schimba secventa primara a ARNm, si astfel pe cea a proteinei. Pe criterii genetice, fiecare dintre aceste unitati pot fi considerate ca contin o regiune 'gena'. Daca unitatile sunt exprimate independent, ele pot complementa desigur in trans. Daca mutatiile sunt valabile, putem gasi prin urmare ca sunt necesare 3 grupe de complementare pentru a codifica pentru secventa primara a unei singure proteine.

Analiza si caracterizarea intermediarilor partial editati (prelucrati) sugereaza ca reactia se desfasoara de-a lungul ARN pre-editat in directia 3'-5'. Molecula ARN ghid are nu numai rolul de a dicta specificitatea inserarii uridinelor prin imperecherea sa cu ARN pre-editat dar si de a furniza concret resturile U care sunt inserate.

Molecula ARN ghid se termina in cu regiuni de 3-5 resturi de uridina, dupa care urmatoarele uridine sunt adaugate pentru a genera cozile 3'-oligo U. Cozile au o lungime eterogena, variind de la 5 la 24 resturi U. Aceste uridine sunt inserate in ARN prelucrat printr-o reactie care se aseamana cu splicingul intronilor din grupa I. Imperecherea dintre ARN ghid si ARN pre-editat se aseamana cu imperecherea dintre regiunea IGS a intronului si exonul 5'. In figura 32.16 (Genes V) este redata reactia care se realizeaza prin doua transesterificari.

In primul transfer, regiunea care urmeaza a fi prelucrata este atacata de 3'-OH al ultimului rest de uridina din coada ARN ghid cu care este imperechiat. Aceasta realizeaza ruperea ARN pre-editat in doua parti. O parte o reprezinta regiunea 5', terminata printr-o grupare 3'-OH. Cealalta parte este o molecula hibrid in care coada 3' a ARN ghid este legata covalent la ARN care urmeaza a fi prelucrat. Acest intermediar este o molecula lineara a carei structura este mentinuta prin imperecherea bazelor.

In cel de al doilea transfer, gruparea 3'-OH generata in urma primului transfer ataca legatura dintre cele doua resturi U din regiunea cozii ARN ghid. Se reface astfel integritatea moleculei ARN pre-editata, care a castigat un rest U si se reface structura ARN ghid, care a pierdut un rest uridina din coada. Ciclul se repeta pana la terminarea procesului.

Structurile moleculelor partial prelucrate sugereaza ca resturile de uridina sunt adaugate una cate una si nu in grup. Este posibil ca reactia sa se realizeze prin mai multe cicluri in care resturi de uridina sunt adaugate, testate pentru complementaritatea lor cu molecula ATN ghid, retinute daca sunt acceptate si daca nu inlaturate. Astfel ia nastere gradat o molecula de ARN corect prelucrata. Nu se stie inca daca acelasi tip de reactii se desfasoara si in cazul in care prelucrarea moleculelor presupune inlaturarea de resturi U sau adaugarea de C.

Diapozitiv 54. Editarea ARN la protozoare

Figura: Mecanismele de editare a moleculelor de ARNm din kinetoplastul de la Tripanosoma

O secventa ancora (albastru) din molecula de pre-ARNm ne-editata hibridizeaza cu o secventa ancora (galben) situata in pozitia 5' a unei secvente ARN ghid (ARNg), care directioneaza apoi adaugarea sau indepartarea de resturi U. Este prezentata numai o mica regiune a pre-ARNM. Resturile U adaugate sunt prezentate in rosu iar cele aindepartate prin delta. Numerele incercuite identifica situsurile la nivelul carora apare editarea.

Diapozitiv 55. Anumite molecule de ARNm sunt asociate cu structuri citoplasmatice sau localizate in regiuni specifice

Diapozitiv 56. Localizarea ARNm pentru Ash1 in mugurele de la drojdii

Diapozitiv 57. Durata de viata a moleculelor de ARNm

Diapozitiv 58. Efectul stabilizator al secventelor AUUUA asupra timpului de injumatatire al ARNm (t1/2)

Figura: Demonstratia experimentala a efectului de destabilizare a secventelor AUUUA asupra jumatatii de viata (T1/2) a ARNm

Celulele in cultura au fost transfectate separat cu vectori de expresie care contin secventele beta-globinelor prezentate in diagrama si au fost determinate jumatatile de viata ale ARNm exprimati . Secventele AUUUA (rosu) au fost ale genei care codifica pentru o citokina numita factor care stimuleaza coloniile granulocite-macrofage (GMCSF), al caror ARNm are o durata de viata de aproximativ o ora. Inserarea lor in genele beta-globinei, care in mod normal exprima o molecula de ARNm stabila, avand drept rezultat scurtarea vietii ARNm recombinant pentru beta-globina.

Diapozitiv 59. Viteza de degradare a moleculelor de ARNm de la eucariote este reglata

Figura: Reglarea Fe-dependenta a stabilitatii ARNm pentru receptorul pentru transferina

Elementele de raspuns la Fe (IRE) pozitionate in 3' in structura ARNm prezinta o structura stem sub forma de bucla bogata in secvente AU (galben) care promoveaza degradarea ARNm. La concentratii intracelulare scazute in Fe, conformatia IRE-BP (verde inchis) este aceea care se leaga la IRE, inhiband astfel degradarea. Drept rezultat, nivelul receptorului pentru transferina creste, astfel incat mai mult Fe poate fi adus in celula.

Diapozitiv 60. Translatia unor molecule de ARNm este reglata specific de proteine de legare

Figura: Reglarea dependenta de Fe a translatiei ARNm pentru feritina.

La concentratii scazute in Fe legarea IRE-BP blocheaza initierea translatiei. Acelasi mecanism controleaza translatia ARNm care codifica ALA sintaza. Elementele IRE ale acestor doua molecule de ARNm sunt localizate la capatul 5' si nu contin secvente bogate in AU care sa promoveze degradarea si sunt prezente in regiunea 3' a ARNm al receptorului pentru transferina.

Diapozitiv 61. ARN antisens regleaza translatia ARNm al transpozazei la bacterii

Figura: Controlul antisens al translatiei ARNm al transpozazei codificata de elementul bacterian mobil IS10

Capatul 5' al ARNm al transpozazei (rosu) produs de pe catena mai mica care incepe la PIN, este complementar cu capatul 5' al moleculei ARN antisens (negru), produsa de catena de deasupra care ancepe la POUT. Deaorece POUT poseda un promotor mai puternic decat PIN, se va produce mai mult ARN antisens decat transpozaza, astfel incat tot ARNm pentru transpozaza hibridizeaza cu cu ARN antisens mai abundent. Atat timp cat codomul de start AUG (verde) si secventa de legare la ribozom Shine-Dalgarno (galben) sunt in regiunea hibridizata , initierea translatiei ARNm al transpozazei este blocata. Foarte rar translatia ARNm pentru transpozaza este initiata inaintea hibridizarii cu ARN antisens, conducand la o rata redusa a transpozitiei IS10

Diapozitiv 62. Concluzii

Diapozitiv 63. Genele pre-ARNr sunt similare la toate eucariotele

Figura: Structura generala a unitatilor transcriptionale pre-ARNr

Cele trei regiuni codante (albastru) codifica pentru ARNr 18S, 5,8S si 28 S prezente in ribozomii eucariotelor superioare sau a echivalentilor lor de la alte specii. Ordinea acestor trei regiuni codante in genom este intotdeauna 5'-3'. Variatiile de lungime ale regiunilor spacer transcrise (tan) sunt responsabile de diferenta majora de lungime a unitatilor de transcriptie de la diferite organisme.

Diapozitiv 64. Genele pre-ARNr functioneaza ca organizatori nucleolari

Figura: Micrografie a cromozomilor politeni preparati de la musca si care contin o singura transgena pre-ARNr

Diapozitiv 65. snoRNAs (small nucleolar RNAs) asista procesarea ARNr si asamblarea subunitatilor ribozomale

Figura: Procesarea pre-ARNr si asamblarea ribozomilor la eucariote

a)    Intermediarii majori si timpul necesar pentru diferitelor etape de procesare a pre-ARNr la eucariotele superioare. Proteinele ribozomale si nucleolare asociate cu pre-ARNr 45S imediat dupa sinteza sa, formeaza o molecula pre-RNP de 80S. Sinteza ARNr 5S apare in afara nucleolului. Secventa secundara extinsa a ARNr nu este reprezentata. De retinut ca acest ARN constituie aprope 2/3 din masa subunitatilor ribozomale si proteina numai 1/3.

b)    Calea de procesare a transcriptului primarpre-ARNr de 6,6 kb (35 S) la Sacharomices cerevisiae. Regiunile spacer transcrise (tan) care sunt inlaturate in timpul procesarii, separa regiunile corespunzatoare formelor mature 18S, 5,8 S si 25 S ARNr. Au fost identificati toti intermediarii trecuti in diagrama.

Diapozitiv 66. Auto-splicing-ul intronilor de grup 1 - ARN catalitic

Figura: Mecanismele de splicing ale intronilor din grupul I si din grupul II automatisabili si spiceozomul care catalizeaza splicingul ARNm.

Intronul este marcat in albastru si exonii care urmeaza a fi matisati in rosu.

In intronii din grupul I , un cofactor guanozinic (G)care nu face parte din catena ARN se asociaza cu situl activ. Gruparea hidroxil 3'al acestei guanozine participa la o reactie de transesterificare cu fosfatul de la capatul 5' al intronului; aceasta reactie este analoga cu cea care implica gruparea hidroxil 2' a situsului de ramificare A din intronii de grup Iisi din intronii pre-ARNm matizati in spliceozomi. Transesterificarea urmatoare care leaga capetele 5' si 3' ale celor doi exoni este similara in toate cele trei mecanisme de splicing . De retinut ca intronul de grup I se elibereaza sub forma unei structuri lineare spre deosebire de produsii ramificati din celelalte doua cazuri.

Autosplicingul intronilor din grupa I.

Splicingul intronului pre-ARNr de la Tetrahymena, care reprezinta prototipul grupei I, se realizeaza printr-o serie de transesterificari concertate in cursul carora fosfoesterii sunt schimbati fara hidroliza intermediara. Cu exceptia etapei de initiere, favorizata de prezenta guanozinei libere sau a nucleotidelor sale, toate grupele reactive implicate in transesterificare sunt continute in secventa intronului. In plus, specificitatea de schimb a legaturilor este o consecinta a organizarii tridimensionale a intronului, rezultata din imperecherea intre secvente distante dar conservate ale intronului (fig. 8.75 si 8.77)

Prima etapa a splicingului este legarea guanozinei la o secventa a intronului (figura 8.78). Perechea de electroni liberi ai hidroxilului 3' ai guanozinei poate provoca un atac nucleofil asupra fosfatului jonctiunii exon-intron 5' (-UpA-) provocand clivarea acestui situs (figura 8.79). Hidroxilul 3' creat la situsul de clivare (extremitatea 5' a exonului) reactioneaza cu fosfatul 3' al jonctiunii, provocand legarea celor doi exoni si eliberarea intronului linear, de 413 nucleotide. Segmentul de intron linear suporta apoi alte doua transesterificari intramoleculare si hidrolize, cu eliberarea mai intai a 15 nucleotide si apoi formarea intronului final prin eliberarea altor 4 nucleotide. Trebuie sa retinem ca reactiei globale nu ii este asociata nici o modificare neta de energie: fiecare rupere a unei legaturi fosfodiester fiind compensata prin formarea concomitenta a unei alte legaturi fosfodiester.

Guanozina sau unul dintre derivatii ei 5' fosforilati, este specifica initierii reactiei de splicing. Modificarea gruparilor hidroxil 2' sau 3', sau potentialului de imperechere a guanozinei cu un rest de citozina, modifica (altereaza) capacitatea de initiere a splicingului. Evident, imperecherea guanozinei cu un rest complementar al intronului este importanta pentru pozitionarea corecta a hidroxilului 3' al guanozinei si pentru reactia sa cu fosfatul 5' al jonctiunii.

Cele doua jonctiuni exon-intron sunt probabil apropiate una de alta pentru a permite legarea celor doi exoni dupa clivarea initiala realizata de guanina. Acest proces este usurat de replierea intronului astfel incat cele doua jonctiuni sa se poata suprapune, probabil, in vecinatatea situsului de legatura al guanozinei. O posibilitate este ca, in intron, o anumita secventa sa fie capabila sa se imperecheze cu o secventa a exonului situata la fiecare jonctiune (figura 8.80). Prezenta unei astfel de secvente ghid intern ar permite reactia gruparii hidroxil 3', creata prin clivarea jonctiunii exon-intron 5' de catre guanozina, cu fosfatul 3' al situsului de splicing pentru a forma produsul matisat. Restul G care termina intronul si nucleotidele adiacente acestuia determina situsul de splicing 3'. Modificarile conformationale in intronul linear eliberat se presupune ca faciliteaza circularizarea si eliberarea de mici oligonucleotide (figura 8.81).

Mecanismul de autosplicing evidentiat pentru gena ARNr de la Tetrahymena este aplicabil si altor introni din grupa I. Acestia poseda cu totii 4 secvente conservate (A, B, 9L si 2) si alte doua secvente neconservate 9R si 9R' (tabel 8.5 si figura 8.75). Aceste 6 elemente apar intotdeauna in aceeasi ordine: 5'-9R'-A-B-9L-9R-2-3'. In plus, cea mai mare parte a intronilor din grupa I poseda si o secventa care poate servi drept ghid intern. Mutatii care impiedica splicingul au fost evidentiate si caracterizate la drojdii si ciuperci. Astfel de mutatii modifica in general posibilitatea imperecherii bazelor. Astfel, de exemplu, inactivarea splicingului determinata de modificarea secventelor 9R sau 9R' este reversibila prin schimbari compensatorii in alta secventa.

Splicingul in vitro al anumitor introni din grupa I apartinand genelor mitocondriale de drojdie pentru pre-ARNm depinde de aceleasi secvente conservate ca si cele care sunt necesare splicingului pre-ARNr de la Tetrahymena, produsii de reactie fiind analogi. Totusi, acesti pre-ARNm nu sufera procesul de auto-splicing in vitro. Splicingul acestor introni depinde de proteine, care actioneaza in trans, codificate de aceleasi gene sau de gene inrudite, de catre secvente de lectura deschise constituite din exoni si introni. Aceste proteine, maturaze, nu sunt prezente decat pentru o perioada scurta de timp si par sa favorizeze replierea intronului din structura pre-ARNm intr-o conformatie care permite splicingul. Aceasta explica de ce mutatiile fara sens (non-sens) sau alunecarea fazei de lectura in secventa intronului care codifica pentru maturaza, impiedica splicingul acestui intron ca si pe cel al intronilor din grupa I caracteristici altor gene mitocondriale. Acest model explica si de ce mutatiile supresoare sau care contin o alunecare de faza, care readuc la normal producerea maturazei restabilesc si splicingul corect. Plierea corecta a anumitor introni din grupa I este spontana si stabila in vitro in timp altii necesita proteine pentru formarea si/sau stabilizarea structurii active autocatalitic. Exista si posibilitatea ca diverse interactii proteine-proteine sa aiba rol in pliere.

Splicingul in trans

Reactiile de splicing trecute in revista pana in prezent sunt intramoleculare si sunt deci reactii in cis. Se pune problema existentei unor procese de splicing intermolecular deci despre care putem considera ca se desfasoara in trans. Mai specific, se pune problema daca doi exoni situati pe molecule de ARN separate se pot asocia cu eliminarea concomitenta a intronilor pe care ii contin. Existenta acestui proces de splicing intermolecular a fost demonstrat in vitro utilizand substrate ARN special preparate. S-a stabilit ca splicingul in trans este o etapa esentiala in producerea celulara a tuturor moleculelor de ARNm la Trypanosoma si a trei din cei patru ARNm ai genelor actinei de la C. elegans. Primul exemplu de splicing in trans in care erau implicate unitati transcriptionale situate pe cromozomi diferiti a fost descris in cazul proto-oncogenei c-myb (Vellard et al, Oncogene, 1991). In fiecare caz, situsurile de clivare sunt de tip clasic, GU la jonctiunea 5' si AG in pozitia 3', produsul fiind si el o structura ramificata (laso).

Pentru demonstrarea splicingului in trans au fost utilizate doua modele experimentale. In primul, exonul 5' si intronul care il flancheaza fac parte din aceeasi molecula de ARN, iar exonul 3' si intronul asociat cu acesta pe o a doua catena ARN (lant ARN) (figura 8.87). Imperecherea bazelor complementare intre secventele celor doua segmente intronice are loc cu o eficacitate de 15% (in extractele celulare) fata de rezultatele obtinute in cazurile in care intronii sunt pe aceeasi molecula de ARN. Deci, nici existenta structurilor secundare nici intreruperea covalenta a intronului nu impiedica splicingul.

Cea de a doua experienta se bazeaza pe prezenta secventelor complementare la nivelul a doi introni necesare pentru intalnirea (apropierea) moleculelor de ARN maturabile (supuse procesului de splicing) (figura 8.87 b), In aceasta configuratie este posibila obtinerea a patru produsi: doi formati prin splicingul in trans si doi prin splicing in cis. Rezultatul splicingului in vitro al acestui substrat este formarea produsilor de reactie trans 5' adeno-adeno 3' si cis 5' globina-adeno 3'. Se obtin produsii cis 5' adeno-globina 3' si trans 5' globina-globina 3', dar in cantitati reduse probabil din cauza apropierii bazelor imperechiate de punctul de ramificare.

Formarea ARNm al actinei functionale si a multor alte molecule de ARNm de la C. elegans se realizeaza prin splicing in trans (trans-splicing). In cazul actinei, coiful si primele 22 nucleotide ale ARNm provin dintr-un transcript de 100 nucleotide obtinut plecand de la ADNr 5S situat pe un cromozom diferit. Totusi, exemplul cel mai bine studiat de splicing in trans este cel de formare a ARNm de la Trypanosoma. Toate moleculele de ARNm de la tryponosoma contin o secventa 5' identica de 35 nucleotide, netradusa, care preceda o secventa codanta intrerupta. Acesti mini-exoni 5' provin de la extremitatea 5' a unui ARN de 137 nucleotide transcris plecand de la sute de copii in tandem ale unui segment de ADN de 137 pb (figura 8.88). Un splicing in trans asociaza mini-exonul 5' de 35 nucleotide cu un ARN al carui exon codifica pentru o proteina cu un alt ARN formand o molecula de ARN ramificata. In etapa urmatoare, situsul de maturare 3' este clivat si cei doi exoni sunt reuniti. Segmentul ramificat, continand secventele intronilor de la doua molecule de ARN separate, este apoi taiat de o enzima care realizeaza deramificarea (debransarea) rezultatul fiind separarea intronilor care erau asociati celor doua molecule de ARN. In exemplul analizat mai sus trebuie remarcat: 1) secventa situata imediat in aval de mini-exonul de la Trypanosoma este conform cu secventa consens 5'(GUAUGA), 2) jonctiunea intronului asociat cu exonul codant este analoga secventei 3' a situsurilor de excizie ([C/Un NNAG) 3) un nucleotid al intronului reprezinta punctul de ramificare, sugerand ca mecanismele de splicing in trans si in cis sunt analoge. Pentru moment modul de realizare a complexului de splicing, pentru doua molecule de ARN separate, nu este pe deplin elucidat.

Diapozitiv 67. Auto-splicingul pre-ARNr de la Tetrahymena

Figura: Auto-splicingul pre-ARNr de la Tetrahymena thermophila

Din cursul anterior

Intronii din grupa I au diferite localizari. Ei apar in gene care codifica pentru ARNr in nucleul eucariotelor inferioare cum sunt Tetrahymena thermophila (un ciliat) si Physarum polycephalum (viermele de noroi sau rama). Ei sunt comuni in genele mitocondriale ale fungilor. Prezenta lor la nivelul a trei gene din genomul fagului T4 extinde intinderea lor evolutiva pana la procariote. Intronii au fost pierduti in intregime de eubacterii, iar aceste gene prezente la T4 sunt unicul exemplu unde splicingul este necesar la eubacterii. Intronii din grupul una au comune doua proprietati:

1) ARN izolat are capacitatea de a se matura singur, reactie numita self-splicing (auto-maturare sau auto-splicing). Proprietatea nu este unica deoarece se intalneste si la intronii din grupa II. In vitro reactia de maturare se realizeaza prin self-splicing in timp ce in vivo aceasta trebuie asistata de proteine.

2) Un intron din grupa I se poate organiza intr-o structura secundara distincta, cu 9 (stem-loop) bucle pe structura (bucle pe tija). Unele dintre aceste bucle sunt generate prin reactia dintre secvente consensus scurte. Lungimea intronilor din grupa I variaza larg, secventele consensus fiind localizate la o distanta considerabila de jonctiunile implicate in splicing.

Auto-splicingul a fost descoperit ca o proprietate a transcriptilor genelor ARNr de la T. thermophila. Genele pentru cele doua forme majore de ARNr au organizarea obisnuita, in care ambele sunt exprimate ca o parte a unei unitati comune de transcriptie. Produsul este un precursor ARN 35S care poseda secventa pentru molecula mica de ARNr in regiunea 5', si secventa pentru molecula ARNr mare (26S) catre capatul 3'.

La anumite tulpini de T. thermophila, secventa care codifica ARNr 26S este intrerupta de un singur intron mic. Cand precursorul 35S este incubat, in vitro, splicingul apare ca o reactie autonoma. Intronul este excizat (eliminat) de pe precursor si se acumuleaza ca o forma lineara de 400 pb, care este apoi convertita intr-o forma circulara (Figura 32.1 -Genes V). Reactia necesita numai un cation monovalent, un cation divalent un guanidin nucleotid ca cofactor. Nici o alta baza nu poate substitui guanina, fara a fi neaparat necesara prezenta unui trifosfat (se poate utiliza la fel de bine GTP, GDP, GMP sau chiar guanozina libera). Nucleotidul guanilic trebuie sa posede gruparea 3'-OH libera

Parcursul nucleotidului guanilic poate fi urmarit prin marcare radioactiva. Radioactivitatea initiala intra si elimina intronul linear. Restul G ramane legat de capatul 5' al intronului printr-o legatura fosfodiester normala. In figura 32.2 (Genes V) sunt redate cele trei reactii de transfer care apar. In primul transfer, nucleotidul guanilic se comporta ca un cofactor care furnizeaza 3'-OH liber la capatul exonului. Al doilea transfer implica o reactie chimica similara, in care acest 3'-OH ataca cel de al doilea exon. Cele doua transferuri sunt conectate; nu au fost observati exoni liberi, deci legarea lor trebuie sa apara ca o parte a aceleiasi reactii in care se elibereaza intronul. Intronul este eliberat ca o molecula lineara, dar cel de al treilea transfer il transforma in una circulara.

Fiecare stadiu al reactiilor de auto-splicing constau intr-o transesterificare, in care un ester fosfat este convertit direct in altul fara hidroliza intermediara. Datorita legaturilor care sunt schimbate direct, energia este conservata, deci reactia nu necesita energie din hidroliza ATP sau GTP

Daca fiecare dintre reactiile consecutive de transesterificare nu implica o modificare neta de energie, de ce reactia de splicing se realizeaza complet in loc sa apara un echilibru intre produsii maturati si precursor? Concentratia GTP este relativ mare fata de cea a ARN, si astfel reactia este orientata inainte. Reactia inversa este prevenita de modificarile structurii secundare a ARN.

Sistemele in vitro nu includ proteine care sa fie absolut necesare auto-maturarii ARN. ARN formeaza o structura secundara/tertiara specifica in care gruparile relevante sunt juxtapuse astfel incat nucleotidul guanilic se poate lega la un situs specific, astfel incat sa fie apoi posibila reactia de rupere si de reunire (Figura 32.2 -Genes V). Desi reactia poate fi realizata numai de ARN, se pare ca in vivo acesta este asistat de proteine, care pot sa stabilizeze structura ARN.

Abilitatea de a se angaja in astfel de reactii de transfer rezida in structura intronului, care continua sa fie reactiv si dupa eliminarea sa sub forma unei molecule lineare. In figura 32.3 (Genes V) sunt insumate aceste activitati:

- Intronul se poate circulariza cand G situat 3' terminal ataca fiecare dintre cele doua pozitii de langa capatul 5'. Legatura interna este rupta si capatul 5' eliberat este transferat capatului 3'-OH al intronului. Ciclizarea primara implica de obicei reactia dintre G414 terminal si A16. Aceasta este cea mai comuna reactie (aratata ca cel de al treilea transfer in figura 32.2). Mai rar G414 reactioneaza cu U20. Fiecare reactie genereaza un intron circular si un fragment linear care reprezinta regiunea 5' originala 8lung de 15 baze daca atacul se produce la A16 si de 19 baze daca atacul se face la U20). Fragmentul terminal contine nucleotidul guanilic adaugat.

- Fiecare tip de cerc poate genera o molecula lineara in vitro prin hidroliza specifica a legaturii (G414-A16 sau G414-U20) care au inchis cercul. Acesta se numeste reversul ciclizarii si molecula lineara generata prin inversarea ciclizarii la A16 ramane reactiva si poate realiza o a doua ciclizare prin atacarea U20.

- Produsul final al reactiilor spontane elibereaza intronul ARN L-19, o molecula lineara generata prin reversarea formei circulare scurte. Aceasta molecula are activitate enzimatica, si poate cataliza extinderea oligonucleotidelor scurte.

- Reactivitatea intronului eliberat se extinde numai prin inversarea reactiei de ciclizare. Adaugarea oligonucleotidului UUU redeschide cercul primar reactionand cu legatura G414-A16.

Oligonucleotidul UUU (care se aseamana cu capatul 3' de 15 baze eliberat in prima ciclizare) devine capatul 5' al moleculei lineare formate. Aceasta este o reactie intermoleculara, si demonstreaza astfel capacitatea de conectare a doua molecule diferite de ARN.

Aceste serii de reactii demonstreaza clar ca activitatea autocatalitica reflecta o abilitate generalizata a moleculei de ARN pentru a forma un centru activ care poate lega cofactorii guanilici, recunoaste oligonucleotidele, si poate aduce impreuna grupari reactive intr-o conformatie care sa permite ruperea si reformarea de legaturi. Alti introni din grupa I nu au fost asa investigati in detaliu ca intronul de la Tetrahymena, dar proprietatile lor sunt in general similare.

Reactia de automaturare (auto-splicing) este o proprietate intrinseca a ARN, in vitro, dar in ce grad sunt implicate proteinele in vivo? Cateva indicatii pentru implicarea proteinelor au fost furnizate de catre sistemele mitocondriale, unde splicingul intronilor din grupa I necesita trans-activare de catre produsi ai altor gene. Unul dintre cazuri il reprezinta mutantul cyt 18 al N. crassa, care este defectiv in realizarea splicingului mai multor exoni din grupa I. Produsul acestei gene se pare a fi tirozil-ARNt sintetaza. O posibila implicare este aceea ca intronul se poate dispune intr-o structura tertiara asemanatoare cu structura tertiara a ARNt si astfel poate fi recunoscut de sintetaza. Legarea enzimei poate fi implicata direct in splicing sau poate avea un efect indirect cum ar fi stabilizarea conformatiei ARN.

Relatia dintre sintetaza si splicing este in concordanta cu ideea ca splicingul este originar o reactie mediata de ARN, care cu timpul a fost asistata de proteine care se leaga la ARN si care originar au alte functii. Capacitatea de auto-splicing a ARN in vitro poate reprezenta interactia biochimica de baza; structura ARN creeaza situsul activ, dar este capabila sa functioneze eficient in vivo numai cand este asistata de un complex proteic.

Conservarea structurii si a mecanismului de splicing printre intronii din grupa I sugereaza ca membrii nucleari si mitocondriali au o origine evolutiva comuna. O migrare trebuie sa fi avut loc intre nucleu si mitocondrie, dar pentru moment nu avem nici o informatie privind directia in care aceasta a avut loc.

Diapozitiv 68. Moleculele de pre-ARNt sufera scindare si modificarea bazelor

Figura: Procesarea pre-ARNt pentru tirozina implica patru tipuri de modificari

Un intron de 14 nucleotide (albastru) din bucla anticodon este indepartat prin splicing. O secventa de 16 nucleotide (verde) de la capatul 5i este clivata de catre RN-aza P. Resturile U de la capatul 3' sunt inlocuite de catre secventa CCA (rosu) care se gaseste in toate moleculele ARNt mature. Numeroase baze din bucla stem sunt transfoirmate in baze modificate caracteristice (galben). Nu toti ARNt contin introni care sunt matisati in timpul procesarii, dar toti sufera alte tipuri de modificari evidentiate in figura.

D=dihidrouridina; Y=pseudouridina

Diapozitiv 69. "Splicing-ul" moleculelor pre-ARNt difera de celelalte mecanisme de "splicing

Figura: Mecanismul splicingului an pre-ARNt

pre-ARNt este clivat in doua locuri, de o parte si de alta a intronului, excizand astfel intronul. Mecanismul de clivare genereaza un fosfomonoester 2'-3' ciclic la capatul 3' al exonului 5'. Reactia de jonctiune dintre doi exoni este o reactie in multe etape care necesita doi nucleozid trifosfati: GTP, care contribuie la gruparea fosfat (galben) pentru jonctiunea 3'-5' din molecula finala ARNt; si o molecula ATP care formeaza un intermediar ligaza-AMP activat- Gruparea 2' fosfat a exonului 5' este inlaturata in etapa finala.

Din cursul anterior

Splicingul ARNt

Modul in care sunt eliminati intronii ARNt a fost cel mai bine studiat si inteles la drojdie, dar anumite informatii au fost oferite in urma studiului altor eucariote inferioare si plante. Toate enzimele implicate sunt cunoscute si purificate si toti intermediarii sunt caracterizati (figura 8.89). O endonucleaza specifica pentru ARNt taie pre-ARNt la nivelul jonctiunii 5' a intronului, formand un 2', 3'-fosfodiester ciclic la extremitatea regiunii 5' a ARNt. Aceeasi enzima taie jonctiunea celuilalt intron producand o grupare 5' hidroxil la extremitatea partii 3' a ARNt. Aceste clivari ne aduc aminte de cele realizate de anumite RN-aze. Fosfodiesterul ciclic este apoi deschis de catre o fosfodiesteraza ciclica pentru a forma un 2' fosfomonoester. Dupa fosforilarea extremitatii sale 5' hidroxil, exonul 3' este adenilat de catre o ligaza specifica pentru ARNt; aceasta ultima reactie este identica cu cea catalizata de catre ADN ligaze. Legarea celor doua jumatati de molecule prin intermediul extremitatilor lor activate creeaza o legatura neobisnuita 2' fosfat, 3', 5' fosfodiester. Eliminarea fosfatului din 2', de catre o fosfataza duce la formarea ARN matur. De retinut ca fosfatul noii legaturi diester provine din ATP. Aceasta este o caracteristica care distinge maturarea ARNt de la drojdii de cea de la vertebrate (figura 8.89). In aceasta serie de reactii, clivarea endonucleazica initiala determina formarea de extremitati 5' hidroxil si 3' fosfomonoester, acesta din urma fiind convertit in 2', 3' fosfodiester de catre o ciclaza ATP dependenta. O ligaza specifica pentru ARNt uneste apoi cele doua jumatati fara a necesita activarea extremitatilor.

Fractionarea sistemului de splicing de la drojdii a dus la obtinerea unor preparate inalt purificate a doua enzime. Una catalizeaza clivarea endonucleotidica la nivelul jonctiunilor intronului, iar cealalta poseda, la nivelul unei singure polipeptide, activitatea fosfodiesterazica, kinazica, de adenilare si ligazica. Cele doua enzime sunt foarte specifice pentru reactiile de splicing ale ARNt; ele reactioneaza totusi fara a face distinctie asupra tuturor intronilor ARNt si unesc oricare doua fragmente de ARNt. Astfel au putut fi construite molecule de ARN hibride foarte interesante, formate din doua jumatati de molecule de la ARNt diferiti.

Diapozitiv 70. *Organizarea transcriptului primar ARNr 45S
Structura "cap de ciocan" a unei ribozime

Figura: Organizarea transcriptului primar ARNr 45S;

Structura "cap de ciocan" a unei ribozime

Din cursul anterior

Capacitatea catalitica a ARN de a schimba continutul informational al ARN si rolul intronilor

Ideea ca numai proteinele au activitate enzimatica a fost total rasturnata in biochimie.

Multa vreme identificarea enzimelor cu proteinele a condus la punctul de vedere ca numai proteinele, cu variatele lor structuri tridimensionale si grupari laterale, poseda flexibilitatea sa creeze situsuri active care sa catalizeze reactiile biochimice. Caracterizarea sistemelor implicate in procesarea ARN a demonstrat ca acest punct de vedere era deosebit de simplist.

Numeroase tipuri de reactii catalitice sunt acum cunoscute ca fiind catalizate de ARN. Pentru a desemna un ARN cu proprietati catalitice se foloseste termenul de ribozime si este deja posibila caracterizarea activitatii enzimatice ca si in cazul enzimelor conventionale. Unele activitati catalitice ale ARN sunt directionate catre substrate separate, in timp ce altele sunt intramoleculare si sunt descrise ca auto-maturare sau auto-splicing, in functie de tipul de reactie:

- Enzima ribonucleaza P este o ribonucleoproteina care contine o singura molecula de ARN legata la o proteina. ARN poseda capacitatea de a cataliza clivarea substratului ARNt, in timp ce componenta proteica are un rol indirect, probabil in mentinerea structurii ARN catalitic.

- Moleculele mici de ARN din clasa viroizilor au capacitatea de a realiza reactii de auto-clivare (self-cleavage). Cu toate ca aceste reactii sunt intramoleculare, molecula poate fi impartita intr-o parte enzimatica si o parte substrat ale caror functii sunt independente.

- Intronii din grupa I poseda capacitatea de a-si realiza propria maturare din pre-ARNm in care sunt continuti Reactia poate fi realizata in vitro numai de catre ARN, dar in vivo ea este asistata de proteine. Actiunea intronilor din grupa I genereaza molecule ARN care poseda multe alte activitati catalitice corelate cu activitatea de origine.

Tema comuna a acestor reactii este ca ARN poate realiza reactii intra si inter-moleculare care implica clivarea sau reunirea legaturilor fosfodiester in vitro. Cu toate ca specificitatea reactiilor si a activitatii catalitice de baza este furnizata de ARN, proteinele asociate cu acesta sunt necesare pentru realizarea reactiei in vivo.

Splicingul ARN nu reprezinta singura modalitate prin care se pot introduce modificari in continutul ARN. In procesul de ARN editing, modificarile sunt introduse la nivelul unor baze individuale, sau prin adaugarea de baze particulare in anumite pozitii din interiorul ARNm. Inserarea de baze (de obicei resturi de uridina) apare pentru transcriptii diferitelor gene mitocondriale de la anumite eucariote inferioare; anumite forme de splicing sunt utilizate pentru ruperea sau refacerea legaturilor dintre nucleotide, dar necesita, in acelasi timp, o matrita pentru codificarea informatiei in noua secventa.

Intronii au fost prima data descoperiti la eucariotele superioare. Nu au fost evidentiati la eubacterii (E. coli) dar au fost descoperiti acum cativa ani la anumite archeobacterii (ceea ce ridica cateva probleme de filogenie). Acum nu se mai admite, cum se credea in anii 1970-1980, ca eucariotele descind din procariote. La ora actuala consideram, in urma diferitelor studii comparative ale secventelor acizilor nucleici ca nu exista omologie, ca archeobacteriile, procariotele si eucariotele sunt linii independente. In 1981, Woese propune sa se considere ca cele trei directii au un stramos comun progenotele. De aceea Woese propune termenul de archeas in locul celui de archeobacterii pentru a evita ideea unei filiatii intre acestea si bacterii.

Intronii din grupa I au o structura secundara caracteristica

Toti intronii din grupa I au o structura secundara caracteristica (si probabil si secundara). In figura 32.4.(Genes V) este dat un model pentru structura secundara a intronului de la Tetrahymena care consta in formarea a 9 scurte regiuni de baze perechi (P1-9). Doua dintre aceste perechi de baze sunt generate intre elemente de secventa conservate care sunt comune intronilor din grupa I. P4 este construit din secventele P si Q, care au fiecare o lungime de 10 baze; 6-7 baze fiind implicate in imperechere. P7 este format din secventele R si S, care au o lungime de 12 baze, dar numai 5 baze sunt implicate in imperechere. Celelalte perechi de baze variaza ca secventa in fiecare intron individual. Analize de mutatii au identificat un o regiune core (intron core) care contine P3, P4, P6 si P7, care furnizeaza a regiune minima care poate realiza reactia catalitica. P1 include capatul 3' al exonului stang. Secventa din interiorul intronului care se imperecheaza cu exonul este denumita IGS (internal guide sequence). (Acest nume reflecta faptul ca initial regiunea situata imediat in 3' fata de secventa IGS se considera ca se imperechiaza cu jonctiunea de splicing 3', aducand astfel cele doua jonctiuni impreuna). O secventa foarte scurta de doua perechi de baze situata intre P7 si P9 se imperecheaza cu secventa care precede imediat guanina reactiva (G414 la Tetrahymena) la capatul 3' al intronului.

Importanta imperecherii bazelor in crearea structurii core in ARN este demonstrata de proprietatile mutatiilor cu actiune in cis (cis-acting) care impiedica splicingul intronilor din grupa I. Astfel de mutatii au fost izolate pentru intronii mitocondriali de la mutanti care nu putea indeparta un intron in vivo, si au fost izolate pentru intronul de la Tetrahymena prin transferarea reactiei de splicing intr-un mediu bacterial.

Constructia aratata in figura 32.5(Genes V) permite ca reactia de splicing sa fie realizata la E. coli. Intronul auto-maturabil (intronul care sufera auto-splicing) este plasat intr-o pozitie care intrerupe cel de al 10-lea codon secventei codante a b-galactozidazei. Proteina poate fi astfel tradusa cu succes dupa ARN numai dupa inlaturarea intronului.

Sinteza b-galactozidazei in acest sistem indica ca splicingul poate sa apara in conditii foarte diferite de cele in care s-a realizat pentru Tetrahymena in vitro. O interpretare a acestor rezultate este ca auto-splicingul poate sa se realizeze si in celulele bacteriene. O alta posibilitate este aceea ca enzimele bacteriene sa realizeze aceasta reactie.

Folosind aceasta incercare, putem introduce mutatii in intron pentru a vedea daca acestea impiedica reactia. Mutatiile in secventele consens ale intronilor din grupa I care modifica imperecherea bazelor impiedica splicingul. Mutatiile pot fi inversate (reversie) prin realizarea unor modificari compensatoare care sa restaureze imperecherea bazelor.

Mutatiile in secventele consensus corespunzatoare intronilor mitocondriali din grupa I au efecte similare. O mutatie intr-o secventa consens poate fi inversata printr-o mutatie in secventa consens complementara pentru a restaura imperecherea; de exemplu, mutatiile in regiunea consens R pot fi compensate prin mutatii in regiunea consens S.

Impreuna aceste rezultate sugereaza ca reactia de splicing a intronilor din grupa I depinde de formarea structurii secundare intre secventele consensus pereche din interiorul intronului. Principiul stabilit in urma acestor cercetari este ca secventele distante de jonctiunile de splicing sunt necesare pentru formarea situsului activ care este capabil sa realizeze auto-splicingul.

Ribozimele pot avea activitati catalitice variate

Activitatea catalitica a intronilor din grupa I a fost descoperita in virtutea capacitatii lor de automaturare, dar acestia pot realiza si alte reactii catalitice in vitro, care le-a adus numele de ribozime. Toate reactiile pe care ei le realizeaza se bazeaza pe transesterificari. Noi analizam aceste reactii in termenii relatiilor acestora cu reactia de auto-splicing.

Activitatea catalitica a intronilor din grupa I este conferita de abilitatea acestora de a genera o structura secundara si tertiara particulara, care creeaza situsuri active, echivalente cu situsurile active ale enzimelor conventionale. Figura 32.6 (GenesV) ilustreaza reactia de splicing in termenii acestor situsuri (luand in considerare formarea acestor situsuri)(este vorba de aceeasi serie de reactii prezentata anterior in figura 32.2).

Helixul P1 reprezinta formarea situsului care leaga substratul (substrate-binding site), in care capatul 3' al primului intron se imperecheaza cu IGS intr-o reactie intramoleculara . Situsul care leaga guanozina (guanosin binding site) este format de secventele din P7. Acest situs poate fi ocupat fie de un nucleotid guonozilic liber, fie de un rest de guanozina din pozitia 414. In prima reactie de transfer este folosit nucleotidul guanozilic care apoi este inlocuit cu G414. De retinut ca acest fapt implica modificari ale conformatiei (comparabile probabil cu modificarile conformationale care au loc intr-o enzima). Cel de al doilea transfer realizeaza unirea exonilor si cel de al treilea creeaza intronul circular.

ARN L-19 este generat prin deschiderea intronului circular (ultimul stadiu al rearanjamentelor intramoleculare redate in figura 32.2). Acesta pastreaza inca abilitati enzimatice. Acestea sunt asemanatoare cu activitatile implicate in reactia originala de splicing. consideram ca o molecula are functie de ribozima in conditiile in care pastreaza capacitatea de a se lega la o secventa intramoleculara complementara cu IGS la nivelul situsului de legare a substratului, in timpul legarii fie a nucleotidului G414 terminal sau a nucleotidului guanilic liber la G-binding site.

In figura 32.7 este ilustrat mecanismul prin care se realizeaza extensia unui nucleotid C5 pentru a genera un lant C6. Oligonucleotidul C5se leaga la nivelul substrate binding site, in timp ce G414 ocupa G-binding site. Prin reactiile de transesterificare, un C este transferat de pe C5 pe G situat in pozitie 3' terminala si apoi inapoi pe o noua molecula C5. Urmatoarele reactii de transfer conduc la acumularea unui oligonucleotid citozinic mai lung. Reactia este o adevarata cataliza deoarece ARN L-19 ramane neschimbat, si este disponibil sa catalizeze mai multe cicluri. Ribozimul se comporta astfel ca o nucleotidil-transferaza.

O serie de alte reactii enzimatice sunt prezentate in figura 32.8 (Genes V). Ribozima poate functiona ca o endoribonucleaza specifica pentru un anumit tip de secventa prin folosirea capacitatii IGS de a se lega la secvente complementare. In acest exemplu, IGS leaga o matrita externa care contine secventa CUCU, in loc sa lege secventa analoga care se afla de obicei la capatul exonului stang. Un nucleotid guanilic este prezent in G-binding site, si ataca secventa CUCU exact in modul in care este atacat exonul in prima reactie de transfer. Se realizeaza clivarea secventei tinta intr-o molecula 5' care se aseamana cu exonul stang, si intr-o molecula 3' care poarta la capat un rest G. Prin introducerea de mutatii la nivelul elementului IGS, este posibila modificarea specificitatii ribozimei, astfel incat acesta sa recunoasca secventele complementare noii secvente din regiunea IGS.

Reactia de clivare poate fi realizata si cu un substrat dezoxiribonucleotidic complementar dar legarea moleculei de ADN se realizeaza mult mai slab ier reactia de clivare are lob mult mai lent. Deoarece unica diferenta intre substratele ADN si ARN este lipsa gruparii 2'-OH din structura ADN, se sugereaza ideea ca aceste grupari sunt importante pentru legarea/sau desfasurarea reactiei. Acest lucru reprezinta un argument in sprijinul ipotezei ca splicingul este o proprietate a lumii ARN, in care ARN constituia forma initiala de material genetic.

Odata cu modificarea IGS se schimba si specificitatea substrate binding site fiind permisa utilizarea altor secvente ARN tinta si generarea unei activitati de tip ligaza. O molecula ARN care poseda un capat 3'-OH se poate lega la substrate binding site, iar ARN care poseda un capat 5'-G se leaga la G-binding site. Atacul gruparii hidroxil asupra gruparii fosfat realizeaza conectarea celor doua molecule de ARN si eliberarea restului G.

Reactia fosfatazei nu este direct legata de reactiile de transfer ale splicingului (maturarii). O secventa oligonucleotidica care este complementara cu IGS si terminata in 3'-fosfat poate fi atacata de G414, fiind astfel eliberat un oligonucleotid care poseda o extremitate 3'-OH. Fosfatul poate fi transferat fie pe un oligonucleotid terminat in 3'-OH (realizarea efectiva a reactiei inverse) fie apei (eliberarea de fosfat anorganic)

Reactiile catalizate de ARN pot fi caracterizate la fel ca si reactiile enzimatice clasice, in termenii cineticii Michaelis-Menten. In tabelul 32.1 (Genes V) sunt trecute in revista reactiile catalizate de ARN. Valorile KM ale reactiilor catalizate de ARN sunt scazute, ceea ce implica o legare foarte specifica a ARN la substratele asupra carora actioneaza. Numerele de turnover sunt si ele scazute reflectand o viteza catalitica scazuta. De fapt, moleculele de ARN, definite ca enzime la modul general, nu pot fi comparate cu catalizatorii proteici unde numarul de turnover tipic este de 103-106.

Cazul intronilor care codifica pentru maturaza

Studiul ADN din mitocondriile de om (si bovine) au permis observatia ca ADN din aceste mitocondrii este lipsit in intregime de introni. Nu se poate spune acelasi lucru despre drojdii care poseda introni in ADN mitocondrial. Echipa lui Slonimski (Gif-sur Yvette) a demonstrat ca un anume intron (intronul 2 al genei citocromului b din mitocondriile de drojdii) codifica pentru o proteina. Aceasta proteina provine nu numai din traducerea intronului 2, ci mai precis a exonului 1 + exon 2 +ORF a intronului 2 (open reading frame, partea fara codon stop, in faza cu exonul precedent). Aceasta proteina poseda curioasa proprietate de a exciza intronul 2 (care ii da nastere). Din acest motiv, pana nu demult, nu se putea pune in evidenta aceasta maturaza matricida care nu exista decat in cantitati foarte mici deoarece imediat formata aceasta distruge intronul din care provine (Tradusa, tradatoare a modalitate clara si expeditiva de a spune ca proteina tradusa este tradatoare deoarece ea distruge chiar intronul care i-a dat nastere).

Din contra, se poate pune in evidenta aceasta maturaza utilizand o susa de drojdie mutanta pentru care maturaza produsa este inactiva fiziologic. In acest caz intronul nu poate fi eliminat, si deci el poate continua sa produca maturaza.

Aceeasi echipa a pus in evidenta si maturaza produsa prin expresia intronului 4. Aceasta maturaza nu elimina numai propriul sau intron, dar si un intron provenind dintr-o gena vecina (care codifica o subunitate a citocrom-oxidazei). Se spera ca acesti introni au alte functii decat numai sa codifice proteinele cu rol de excizie (eliminare) a intronilor (Figura 36 83 , ETIENNE).

Cu toate ca astfel s-a demonstrat, intr-un mod foarte estetic, ca un intron poate fi tradus in proteina in aceste cateva cazuri exceptionale, nu se cunoaste inca bine rolul intronilor. In plus, nu putem inca generaliza aceste rezultate obtinute pentru genele mitocondriale de la drojdie.

Cazul intronilor care codifica pentru endonucleaza

S-a observat, la anumite tulpini de S. cerevisiae, ca un intron situat in gena ARNr codifica pentru o endonucleaza care permite ca ADN din alte tulpini sa fie decupat si sa primeasca un intron.

Anumiti introni atat din grupul I cat si din II contin faze de lectura care pot fi traduse in proteine. Sunt cunoscute mai bine functiile proteinelor codificate de anumiti introni din grupa I. Rolul acestora este sa ajute intronul sa perpetueze singur la hibrizi in care alelele genei relevante difera intre ele prin posesia acestor introni.

Polimorfismul prezentei sau absentei intronilor este destul de comun in mitocondriile fungilor (ciupercilor). Aceasta este in concordanta cu ipoteza ca acesti introni sunt la origine insertii la nivelul genelor. Putina lumina in acest proces se poate face prin analiza recombinarii la hibrizi care privesc gena pentru molecula mare ARNr de la mitocondriile de drojdie.

Aceasta gena are un intron din grupa I care contine a secventa codanta. Intronul este prezent la anumite tulpini de drojdie (numite w+) dar absent la altele (w-).Hibrizii genetici intre w+ si w- sunt polari: progeniturile sunt de obicei w

Daca ne gandim ca tulpina w+. reprezinta donorul si tulpina w- este privita ca recipient (primitor), constatam ca in hibrizii w+ x w- se genereaza o noua copie a intronului in genomul w-. Drept rezultat toate progeniturile sunt w

Mutatii pot sa apara la oricare din parinti si sa elimine polaritatea. Mutantii manifesta o segragare normala cu un numar egal de progenituri w+ sau w-. Mutatiile indica natura acestui proces. Mutatiile in tulpinile w- apar langa situsul unde intronul trebuie sa se insereze. Mutatiile in tulpinile w+ sunt prezente la nivelul fazei de lectura a intronului si impiedica producerea proteinei. Aceasta sugereaza modelul din figura 32.9 (Genes V) in care proteina codificata de intron in tulpina w+ recunoaste situsul la nivelul caruia intronul trebuie inserat in tulpina w- si face ca acesta sa fie mostenit preferential.

Care este actiunea proteinei? Produsul intronului w este o endonucleaza care recunoaste gena w- drept tinta pentru o clivare dublu catenara. Endonucleaza recunoaste o secventa tinta de 18 pb care contine situsul unde intronul va fi inserat. Secventa tinta este clivata pe fiecare catena ADN la 2 baze catre capatul 3' al situsului de insertie. Deci situsul de clivare are 4 pb separate , si genereaza monocatene libere (care atarna). Acest tip de clivare este asemanator clivarii caracteristice transpozomilor cand acestia migreaza la situsuri noi. Ruperea dublei catene initiaza probabil un proces de conversie genica in care secventa genei w+ este copiata pentru a inlocui secventa genei w-. De retinut ca inserarea intronului intrerupe secventa recunoscuta de catre endonucleaza, asigurand astfel stabilitatea procesului.

Si alti introni care contin faze deschise de lectura sunt si mobili. Seria exemplelor de introni mitocondriali la fungi poate fi continuata. Un alt caz este al celor doi introni de la fagul T4 care sunt mosteniti preferential asemenea intronului w, si a unui intron prezent in gena nucleara pentru ADNr de la Physarum care se insereaza in orice molecula acceptor de la hibrizi adecvati. In general mecanismul perpetuarii unui intron pare sa fie acelasi: intronul codifica pentru o endonucleaza care taie specific o secventa tinta la nivelul careia va fi inserat. Exista totusi diferente privind detaliile inserarii: de exemplu, endonucleaza codificata intronul fagului T4 td taie o secventa tinta situata la 24 pb mai sus situsul (in amont) la nivelul caruia intronul se va insera.

In ciuda mecanismului comun de mobilitate a intronului, nu exista omologie intre secventele situsurilor tinta sau ale regiunilor codante ale intronului. Putem considera ca intronii au avut o origine evolutiva comuna, dar evident ei au suferi o mare divergenta. Secventele tinta sunt dintre cele mai lungi si totodata cele mai specifice cunoscute pentru endonucleaze. Specificitatea asigura perpetuarea intronului numai prin inserare la un singur situs apartinand secventei tinta si nu oriunde in genom.

Aceste descoperiri intaresc punctul de vedere ca intronii care poseda secvente codante isi au originea in elemente independente care codifica pentru o functie corelata cu capacitatea de splicing a ARN sau de migrare intre moleculele ADN. In concordanta cu aceasta idee, modul de utilizare al codonilor este diferit in regiunile codificate de introni comparativ cu situatia existenta in exoni. In acelasi timp, intronii de acest tip difera probabil de intronii nucleari prin originea lor. Se pare ca acestia sunt mai degraba inserati in gene pre-existente, in timp ce intronii nucleari par sa reprezinte structuri remanente ale genelor primare.

ARN poate avea activitate ribonucleazica

Una din primele demonstratii privind capacitatea ARN de a avea activitati enzimatice a fost analiza ribonucleazei P, o endonucleaza izolata de la E. coli care este responsabila de procesarea ARNt. Ribonucleaza P poate fi disociata in cele doua componente ale sale, o molecula de ARN de 375 baze si o polipeptida de 20 000. In conditiile initiale folosite pentru a caracteriza activitatea enzimatica in vitro, ambele componente erau necesare pentru a realiza scindarea substratului.

Modificarea conditiilor ionice, cresterea concentratiilor de Mg2+, fac componenta proteica inutila. In aceste conditii singur ARN poate cataliza reactia. Analizand rezultatele considerand ca ARN este o enzima, fiecare enzima catalizeaza clivarea a cel putin patru substrate. De fapt, activitatea ARN nu este mult mai mica decat activitatea preparatelor crude de ribonucleaza P (Tabel 32.1, Genes V)..

Prin analiza diferitelor mutatii prezente in gena ARN sau in gena care codifica proteina si care determina inactivarea RN-azei P, se cunoaste faptul ca in vivo ambele componente sunt necesare pentru activitatea naturala a enzimei. Initial s-a considerat ca enzima asigura activitatea catalitica si ca ARN are un rol secundar, de exemplu de a coopera in legarea substratului (prin intermediul unor secvente scurte complementare cu regiuni expuse din ARNt). De fapt aceste roluri sunt inverse.

Cum se poate demonstra ca ARN contine centrul catalitic ?. Aceasta capacitate pare rezonabila daca consideram existenta unui centru activ ca o regiune (suprafata) care expune o serie de grupari active intr-o relatie fixa. Pentru proteina, gruparile active sunt furnizate de lanturile laterale ale aminoacizilor, care poseda o apreciabila varietate, incluzand grupari ionice pozitive si negative si grupari hidrofobe. Intr-o molecula de ARN, partile disponibile sunt mult mai restranse, constand in principal in gruparile expuse ale bazelor. Putem presupune ca scurte regiuni sunt dispuse intr-o conformatie moleculara secundara sau tertiara, furnizand o suprafata de grupari active capabila sa mentina un mediu in care legaturile pot fi rupte si refacute intr-o alta molecula. Pare inevitabil ca interactiile intre ARN cu functie catalitica si ARN substrat sa se bazeze pe crearea unui micromediu rezultat din imperecherea bazelor.

Implicatiile evolutive ale acestor descoperiri sunt curioase. Personalitatea debordanta a aparatului genetic, in care ARN este prezent la nivelul tuturor componentelor, dar proteinele realizeaza reactiile catalitice, a fost sfaramata. Pare putin probabil ca cele mai indepartate evolutiv sisteme de replicare sa fi avut in compozitia lor atat acizi nucleici cat si proteine.

Se poate considera (emite ipoteza) ca primele sisteme contineau numai acizi nucleici cu capacitate de autoreplicare si cu activitati catalitice primitive, exact cele care sa realizeze ruperea legaturilor fosfodiester. Daca presupunem ca implicarea legaturilor 2' in reactiile curente de splicing este derivata din aceste reactii catalitice primitive, putem argumenta ca acidul nucleic original (ancestral) a fost ARN, atata timp cat ADN care nu poseda grupari 2'-OH nu poate realiza aceste reactii. Proteinele au putut fi adaugate (cooptate) datorita capacitatii lor de a stabiliza structura ARN, care erau precar mentinuta fara existenta unui astfel de suport. Se poate considera ca versatilitatea (capacitatea de a indeplini mai multe functii, multilateral) proteinelor le-a permis sa preia (o parte din) cataliza reactiilor chimice, conducand eventual la un complex si la un aparat sofisticat al expresiei moderne a genelor.

Activitatea catalitica a RN-azei P necesita ARN pentru a functiona drept catalizator al unui substrat extern. Un alt exemplu pentru capacitatea ARN de a functiona ca o endonucleaza este furnizat de cateva molecule mici de ARN de la plante (aprox 350 baze) care realizeaza o reactie de auto-clivare. Ca si in cazul intronilor din grupa I este posibila realizarea unor constructii care sa functioneaza cu substrate externe.

Trei tipuri de molecule mici de la plante se incadreaza in doua grupuri generale: viroizii si virusoizii. Viroizii sunt molecule de ARN infectioase care functioneaza independent fara incapsidare cu orice proteina. Virusoizii sunt similari ca organizare, dar sunt incapsidati de catre virusurile plantelor, fiind impachetati impreuna cu genomul viral. Acesti virusoizi nu se pot replica independent si necesita asistenta de la virus (virala). Virusoizii sunt numiti adesea ARNs sateliti.

Atat viroizii si virusoizii par sa se replice dupa modelul cercului rotativ. Catena ARN care este impachetata in virus este denumita catena plus. Catena complementara. generata in timpul replicarii ARN este denumita catena minus. Au fost detectati multimeri ai celor doua forme. Ambele tipuri de monomeri sunt probabil generate prin clivarea cozii unui cerc rotitor: catena circulara plus este generata prin legarea capetelor monomerului linear.

Ambele catene plus si minus ale viroizilor sufera auto-clivare in vitro: Reactia de clivare este promovata de catre cationi metalici divalenti; acestia genereaza capete 5'-OH si 2'-3'-fosdiester ciclic. Unele dintre moleculele ARNs cliveaza in vitro in conditii fiziologice. Altele sufera procesul numai dupa un ciclu de incalzire si racire; aceasta sugereaza ca moleculele izolate de ARN au o conformatie inadecvata, dar ca se poate genera o conformatie activa cand sunt supuse procesului de denaturare-renaturare.

S-a demonstrat ca majoritatea viroizilor si virusoizilor care sufera auto-clivare au, in principiu, o structura secundara sub forma de ciocan redata in figura 32.10 (Genes V). Secventa acestei structuri este suficienta pentru clivare. Cand secventele inconjuratoare sunt eliberate nu mai este necesar ciclul de incalzire-racire, si micile molecule de ARN auto-cliveaza spontan. Aceasta sugereaza ca secventele apartinand structurii cap de ciocan interfera cu formarea sa.

Situsul activ este o secventa de numai 58 nucleotide. Capul de ciocan (hammerhead) contine 3 regiuni stem-loop (bucle) ale caror pozitie si marime sunt constante, si 13 nucleotide conservate, marea majoritate in regiunile care conecteaza (leaga) centrul structurii. Bazele conservate si duplexul stem genereaza o conformatie a moleculei de ARN (un ARN) cu o capacitate intrinseca de clivare.

Nu este necesar ca structura sa se formeze prin imperechere intramoleculara a bazelor. O structura activa cap de ciocan poate fi generata prin imperecherea unui ARN care reprezinta o parte a structurii cu un ARN care reprezinta cealalta parte. In partea de jos a figurii 32.10 este dat un exemplu de cap de ciocan generat prin hibridizarea a 19 baze ale unei molecule cu 24 de baze ale altei molecule . Hibridul mimeaza structura cap de ciocan, cu omiterea buclelor (loops) I si III. Cand imperecherea dintre cele 19 si baze se realizeaza clivarea intr-o pozitie adecvata de la nivelul structurii.

Putem sa privim partea de sus a structurii ca reprezentand substratul si partea de jos ca reprezentand enzima. Cand moleculele ARN care contin regiunea de 19 baze sunt puse in contact cu un exces de molecule ARN de 24 baze, mai multe copii de 24 baze sunt clivate. Aceasta sugereaza ca exista un ciclu al imperecherii fragmentelor de 19 si 24 baze, clivare, disocierea fragmentelor clivate de molecula ARN de 19 baze, si re-imperecherea acesteia cu un nou substrat de 24 baze. Astfel molecula de ARN de 19 baze este o ribozima cu activitate endonucleazica. Parametrii reactiei sunt similari cu cei ai altor reactii catalizate de ARN (Tabel 32. 1).

S-a demonstrat ca este posibila desemnarea unor combinatii emzima-substrat care sa formeze structuri cap de ciocan, si acestea sa poata fi folosite pentru a demonstra ca introducerea in mediu a unor molecule adecvate de ARN permite aparitia reactiei de clivare in vivo. O ribozima proiectata astfel furnizeaza o activitate de restrictie specifica orientata catre o tinta ARN. Prin plasarea ribozimei sub controlul unui promotor reglator, aceasta poate fi folosita in acelasi fel ca (de exemplu) constructiile antisens construite special pentru a modifica expresia unei gene tinta in anumite circumstante.

Diapozitiv 71. Concluzii

Asemeni moleculelor pre-ARNm, transcriptii primari produsi din genele pre-ARNr si ARNt sufera procesari extensive;

Sinteza unui precursorului pre-ARNr (45S in eucariotele superioare) de catre ARN polimeraza I si procesarea acestuia apare in nucleol;

Clivarea, digestia exonucleotidica, si modificarea bazelor pre-ARNr 45S conduce la molecule mature 28S, 18S si 5,8S ARNr, care se asociaza cu proteinele rizozomale in subunitatile ribozomale. O serie de snoARN (small nucleolar RNA) participa la procesarea ARNr;

ARNr 5S, care este sintetizat in nucleoplasma de catre ARN polimeraza III, nu este produs extensiv inaintea asamblarii cu alte molecule de ARNr si proteine pentru a forma subunitatea ribozomala;

Primele molecule de ARNr catalitic (ribozime) descoperite au fost intronii de grup I din ARNr de la Tetrahymena. Auto-splicingul intronilor de grup I si II, si splicingul pre-ARNm la nivelul spliceozomilor se realizeaza prin intermediul a doua reactii de transesterificare;

Transcriptia genelor ARNt de catre ARN polimeraza III si procesarea transcriptilor primari apare in nucleoplasma. In toate moleculele de pre-ARNt, secventa capatului 5' este indepartata de RN-aza P, o ribonucleoproteina care contin un ARN catalitic; CCA este adaugat la capatul 3'; o serie de baze interne sunt modificate;

Unele molecule de pre-ARNt contin un intron scurt in interiorul buclei anticodon. Acesta este inlaturat de enzime printr-un mecanism distinct de mecanismul de splicing al pre-ARNm si auto-splicingul intronilor;