IMUNOFLUORESCENTA (IF)

IMUNOFLUORESCENTA (IF)

Principiu: conjugatele imunofluorescente realizate cu Ac specifici recunosc antigenele din mediul de reactie, permitand evidentierea lor microscopica. Reactia de culoare obtinuta difera in fubctie de fluorocromul utilizat.

IF poate fi utilizata atat in diagnosticul microbiologic direct (in produs patologic sau cultura pura izolata), cat si in serodiagnostic. Unul dintre reactivi (Ac, Ag sau Ac anti- Ac) este marcat fluorescent.

Fluorocromii sunt substante organice care, dupa "iradiere" cu radiatii UV absorb radiatia excitanta, intra in stare de excitatie si atunci cand revin la starea "normala", pierd energia acumulata emitand radiatii luninoase.,

Ex. de fluorocromi: auramina O, rhodamina B, acridin - orange R, tripaflavina.

Tehnicile IF pot fi de tip direct sau indirect:

* Tehnica IF directa: presupune incubarea probei in prezenta conjugatului:

- Ag este necunoscut, provine dintr- o cultura de identificat sau dintr-un produs, piesa bioptica etc,

- produsul de identificat este incubat in prezenta Ac cunoscuti, marcati fluorescent,

- se spala cu tampon fosfat salin, apoi cu apa distilata, pentru indepartarea Ac nespecifici,

- de usuca preparatul si se examineaza la microscopul cu fluorescenta.

- Aplicatii: diagnosticul unor specii ca: Legionella pneumophila, Bordetella pertussis, Mycobacterium tuberculosis, Chamydia trachomatis, treponema pallidum, Cryptococcus neoformans, Histoplasme capsulatum, Pneumocystis carrinni.

- metoda este rapida, aplicabila pentru frotiuri din produse patologice sau cultura de identificat,

- se aplica in anatomie patologica, histochimie, probe biopsice, amprente tisulare etc.

- pentru fiecare Ag de cercetat trebuie preparat serul care contine Ac specifici, marcati fluorescent.

* Tehnica IF indirecta: presupune efectuarea unui frotiu pornind de la Ag cunoscut,

- frotiul se acopera cu un ser de cercetat si dupa o incubatie de 30 min la 37˚C, se spala cu tampon fosfat salin si apa distilata, pentru indepartarea reactivilor care nu au intrat in reactia Ag - Ac.

- pe frotiu se aplica un ser cu Ac anti- imunglobulina de om, marcati fluorescent si se incubeaza 30 min la 37˚C, se spala, se usuca si se examineaza la microscopul cu fluorescenta,

- in situatia in care in serul de cercetat exista Ac specifici Ag - lui cunoscut, se formeaza complexul Ag- Ac, iar in etapa urmatoare, Ac anti- Ig de om se cupleaza pe complex,

- in mod indirect, prin fluorescenta, se identifica Ac,

- Aplicatii: diagnosticul serologic al infectiilor produse de Legionella pneumophila, Mycoplasma pneumoniae, Leptospira spp, Borrelia burgdorferi, Treponema pallidum, Helicobacter pylori, Toxoplasma gondii, Pneumocystis spp.