TESTE IMUNOENZIMATICE - ENZYME IMMUNOASSAY - EIA/ ELISA

TESTE IMUNOENZIMATICE - ENZYME IMMUNOASSAY - EIA/ ELISA

Principiu: prezenta complexelor Ag- Ac poate fi vizualizata si cuantificata, prin adaugarea in mediul de reactie:

a conjugatului reprezentat fie de un Ag, fie de un Ac cunoscut, cuplat cu o enzima,

a substratului cromogen specific enzimei de marcare.

Indicatii:

ELISA poate fi folosita pentru identificarea de antigene sau anticorpi. In functie de modificarea activitatii markerului enzimatic, reactiile ELISA pot fi clasificate in:

reactii "in faza omogena",

reactii "in faza heterogena".

La tehnicile "in faza omogena activitatea markerului enzimatic este modificata de catre reactia Ag - Ac, ceea ce permite relevarea directa a reactiei. Ac joaca rolul reactivului de legare si de revelator al complexului Ag/ Ac, ceea ce face inutila etapa de separare.

aceste reactii sunt utilizate in special, pentru evidentierea de medicamente si haptene in prelevate biologice,

utilitatea lor in microbiologia clinica este redusa.

La tehnicile "in faza heterogena" comportamentul markerului enzimatic este amplificat de catre reactia Ag/ Ac.

este necesara o etapa de separare intre complexul Ag/ Ac marcat si Ag sau Ac marcat, ramas liber,

aceasta varianta ELISA este larg utilizata in microbiologia clinica.

a)      Dozarea de Ag: tehnicile utilizate pot fi de tip competitiv sau necompetitiv: direct si indirect.

Tehnici competitive: competitia se realizeaza direct fata de Ac anti- Ag imobilizati prin absorbtie pe un suport solid,

reactivii sunt adaugati in reactie, in urmatoarea ordine: in prima etapa- Ag de dozat si, dupa incubare, in a doua etapa, Ag marcat.

concentratia de Ag din proba este invers proportionala cu activitatea enzimei citita spectrofotometric dupa adaugarea substratului.

Tehnici necompetitive directe:

Ac anti- Ag sunt absorbiti pe suportul solid,

in prima etapa a reactiei, se adauga in sistem proba cu Ag de dozat,

dupa incubare si spalare, in a doua etapa, se adauga conjugatul, format din Ac anti- Ag marcati enzimatic,

dupa o n oua etapa de spalare si incubare, adaugarea substratului cromogen releva activitatea enzimatica, direct proportionala cu cantitatea de Ag cuplata.

Tehnici necompetitive indirecte: deosebirea fata de tehnica directa apare in etapa a doua, cand Ag reactioneaza cu Ac nemarcati, adaugati in exces.

in acest caz revelarea se face printr- un conjugat reprezentat de Ac anti- imunglobulina marcati enzymatic.

Conditia pentru ultimele doua tehnici este ca Ag de dozat sa prezinte cel putin 2 epitopi, identici sau nu, de unde si denumirea de tehnici cu dublu situs sau "sandwich".

In microbiologia clinica tehnicile ELISA/ EIA de evidentiere a AG sunt utilizate pentru:

diagnosticul rapid al unor bacterioze: infectii cu Streptococcus pyogenes, infectii genitale cu Chlamydia trachomatis,

diagnosticul unor infectii virale, al caror agent etiologic este necultivabil sau greu de cultivat: virusul hepatitei B (Ag HBs, Ag HB e) si C (Ag core/ miez), HIV (Ag p 24) rotavirus si virusul Norwalk,

diagnosticul bronsiolitei sugarului cu virus sincitial respirator, pentru orientarea tratamentului spre o etiologie virala si evitarea abuzului de antibiotice,

diagnosticul rapid al gripei,

diagnosticul infectiilor herpetice,

diagnosticul gastroduodenitelor virale.

b) Dozarea de Ac: datorita marii lor heterogenitati, Ac nu sunt determinati, de regula, prin competitie, ci prin metode necompetitive directe sau indirecte.

* Tehnici necompetitive directe cu Ag marcate:

- pe baza solida este fixat in exces Ag,

- in prima etapa, Ac din proba se leaga specific de Ag,

- dupa incubare si spalare, in a doua etapa, un Ag marcat enzimatic reactioneaza cu al 2- lea situs al Ac din complex,

- revelarea complexului format in primele doua etape se face prin adaugarea substratului cromogen,

- activitatea enzimatica masurata este proportionala cu concentratia Ac din proba,

- tehnica mai este denumita "a dublului situs", pentru ca Ac sunt cel putin bivalenti.

* Tehnici necompetitive indirecte cu Ac anti- imunglobulina marcati:

- deosebirea fata de tehnica directa apare in etapa a doua, cand Ac din proba reactioneaza cu Ac anti- imunglobulina marcati enzimatic,

- activitatea enzimatica este direct proportionala cu cantitatea de Ac din proba,

- cu ajutorul acestei tehnici putem determina apartenenta Ac dozat la clase de imunglobuline.

* Tehnici prin competitie, cu Ac marcati:

- Ac de dozat intra in competitie cu Ac marcati, care au aceeasi specificitate pentru Ag adsorbit, pe baza solida,

- revelarea reactiei se face prin adaugarea substratului cromogen,

- activitatea enzimatica este invers proportionala cu cantitatea de Ac din proba,

Dezavantajele tehnicii:

necesitatea conjugatelor specifice fata de variatele Ag absorbite ,

imposibilitatea precizarii clasei de imunglobulina a Ac.

Proba: ser sanguin, exudate, secretii etc,

Necesar: truse comerciale, apa distilata, acid sulfuric (pentru stoparea reactiei), pipette automate, varfuri, aparat de spalat automat si spectrofotometrul.

Procedura: se respecta strict indicatiile producatorului,

repartizarea probei, a martorilor sigur (+) si sigur (-), incubarea sistemului,

spalare pentru indepartarea reactivilor nespecifici, nefixati,

adaugarea conjugatului si incubare,

spalare, pentru indepartarea excesului de conjugat,

adaugarea substratului cromogen si incubare,

stoparea reactiei.

Citire si interpretare:

in primele 15 min dupa stoparea reactiei, se citesc rezultatele la lungimea de unda indicata de producator (la spectrofotometru),

daca Martorii se inscriu in limite normale, se calculeaza valoarea "prag" a trusei, cunoscuta sub numele de "cut- off" / CO, care este o marime calculate pe baza formulei indicate deb prospectul trusei.,

interpretarea rezultatelor difera in functie de tehnicile utilizate:

* In tehnicile necompetitive, directe si indirecte, o proba este reactiva (are Ac) daca absorbtia acesteia este mai mare sau egala cu valoarea CO si nereactiva (reactie negative) daca absorbtia este sub limita CO.

* In tehnicile de tip competitiv, o proba este reactiva daca absorbtia este mai mica sau egala cu valoarea CO si nereactiva daca absorbtia este mai mare decat CO.

Problme de interpretare ridica probele care au absorbtia egala cu +/- 10% din CO. Aceasta este asa numita "zona gri" a trusei. Rezultatul nu poate fi interpretat si se recomanda fie retestarea aceleiasi probe cu alt tip de trusa sau testarea unei noi probe prelevata dupa 3- 6 luni.

Data fiind specificitatea mai redusa a tehnicilor EIA in raport cu sensibilitatea, se recomanda ca rezultatele fals pozitive sa fie confirmate prin tehnici mai specifice, cum ar fi Western Blot (in special in cazul infectiei HIV).

Control de calitate: se realizeaza prin martorii pozitivi si martorii negativi, livrati de producator, cu o anumita valoare a absorbtiei, precizata in prospectul trusei.

Surse de eroare: congelarea repetata a probelor, pastrarea peste 2-3 zile la +4˚C, contaminarea probelor, prezenta eritrocitelor sau a factorului reumatoid.